香灰菌黑色素对真菌生长及多酚氧化酶活性的影响

香灰菌黑色素对真菌生长及多酚氧化酶活性的影响 天然产物研究与开发 N a t P rod R es D ev 2008 , 20: 501 2504 ( ) 文章编号 : 100126880 200803 20501 204 香灰菌黑色素对真菌生长及多酚氧化酶活性的影响 3 吴 尧 ,王雪梅,马爱民 ,谢笔钧 华中农业大学食品科技学院 ,武汉 430070 摘 要 :以 PDB 培养的香灰菌丝体为材料 ,提取 、纯化香灰菌黑色素 ,并测定香灰菌黑色素对六种真菌生长及对 其胞外多酚氧化酶活性的影响 。结果明 :香灰菌黑色素对六种真菌的生长没有抑制作用 ,而对其多酚氧化酶 活力有明显的诱导作用 。在不同的香灰菌黑色素浓度范围内 ,六种真菌胞外多酚氧化酶最大酶活的出现时间 不同 。 关键词 :香灰菌 ;黑色素 ;多酚氧化酶 中图分类号 : Q936; R285 文献标识码 : A Effec ts of M e lan in Ex tra c ted from H ypoxylon sp1on Fun ga l Grow th an d Po lyphen o l O x ida se A c t iv ity 3 WU Yao, WAN G Xue2m e i, MA A i2m in, X I E B i2jun College of Food S cience and Technology, H uazhong A g ricu ltu ra l U n iversity, W uhan 430070, C h ina A b stra c t:M yce lium of H ypoxy lon sp. cu ltu red in PDB m ed ium wa s u sed to extrac t and p u rify m e lan in. The effec ts of m e lan in from H ypoxy lon sp. on grow th and ac tivity of po lyp heno l oxida se of six fungi we re a ssayed. The re su lts showed tha t the m e lan in d id no t inh ib it funga l grow th, bu t cou ld effec tive ly induce the ac tivity of po lyp heno l oxida se in the se fun2 gi. W ith in the concen tra tion s of m e lan in added in cu ltu re, the m axim um of po lyp heno l oxida se ac tivity of the six fungi ap 2 p ea red a t d iffe ren t tim e. Key word s: H ypoxy lon sp. ; m e lan in; po lyp heno l oxida se 天然黑色素是指存在于植物 、动物和微生物中 色素对六种真菌生长及胞外多 酚氧 化 酶活 力的 影 的一种色素 ,可呈现红色 ,褐色及黑色 ,具有复杂结 ,为天然黑色素的进一步研究和开发提供参考 。响 构 ,一般为非均质的类多酚聚合体 ,它是目前已知生 1 材料与方法[ 1 ] 物色素中最多最广的一类 。“香灰菌 ”是银耳的 [ 2 ] 伴生菌 ,它对 银耳 的 生长 、栽 培至 关 重要 。香 灰 1. 1 菌种及培养基 ( ( ) 菌在生长过程中会产生并分泌大量的黑色素 ,我们 香灰菌 H ypoxy lon sp. ; 平菇 P leu ro tus ostrea2 [ 3 ] ) ( ( ) 曾对这种黑色素的抗氧化活性进行过报道 。 tus;金针菇 F lam m u lina velu tipe; 灵芝 Ganoderm a ( ( () ) lucidum ; 猪肚菌 Panus g igan teus; 黑木耳 A u ricu2 多酚氧化酶 po lyp heno l oxida se, PPO , EC. 1. 10. )) ( ) 3. 1 是生物体内普遍存在的一类铜结合酶 ,一般可 la ria au ricu la r; 鬼 伞 C oprinus sp. 。以 上 菌 种 均 [ 4 ] (以氧化酚类物质形成聚合物 。 Sco re 等的研究指 由本实验室提供 。 PDA 培养基 : 39 g PDA 粉末 D if2 )co加入蒸馏水 1000 mL。 PDB 培养基 : 24 g PDB 粉 出在真菌的相互作用中 ,真菌胞外多酚氧化酶的大 [ 5 ] ()量分泌可能是真菌黑 色 素的 形成 因 素之 一 。还 末 D ifco加入蒸馏水 1000 mL。 有报道称在灵芝菌发酵液中 ,低浓度茶多酚在诱导 1. 2 主要实验仪器和试剂 菌体分泌多酚氧化酶的同时也影响着菌体生长和胞 7221 型可见光分光度计 ; 主要试剂均为国产分 [ 6 ] 外代谢产物的积累 。本文 初 步研 究了 香 灰菌 黑析纯 。 1. 3 实验方法 1. 3. 1 菌种培养 收稿日期 : 2007 207 204 接受日期 : 2007 208 207 在无菌条 件 下 , 用 灭 菌 的 解 剖 刀 取 015 cm × 3 通讯作者 Te l: 86 227 262229767; E2m a il: a im inm a@m a il. hzau. edu. cn 015 cm 大小的香灰菌菌种块 , 接种于装有 100 mL PDB 培 养 基 的 250 mL 三 角 瓶 中 , 每 瓶 接 种 三 块 。 ,使其终浓度分别为 0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4 g / 母液 于 25 ?, 150 rpm 摇床进行浅层发酵培养 5 d。实验 L;以不加黑色素的培养基为空白对照 。所需其它六种菌种均培养于 PDA 平板 。 将平菇 、金针菇 、灵芝 、猪肚菌 、黑木耳 、鬼伞六 1. 3. 2 香灰菌黑色素的提取及纯化 参考吴 尧 等 的 种大型真菌分别接种到上述加黑色素浓度梯度和空 [ 3 ] 方 法 : 过 滤 收 集 香 灰 菌 菌 丝 白对照的培养基中 ,置于 25 ?培养箱中静置培养 , 体 ,蒸 馏 水 冲 洗 后 研 捣 碎 , 加 入 适 量 的 1 mo l /L 设置三个重复 。每隔一周进行一次多酚氧化酶活力 N aOH , 100 ?水浴提取 3 h。 4000 rpm 离心取上清 的测定 。 [ 6 ] 液 , 1 mo l /L HC l调到 pH 2. 0 , 4000 rpm 离心收集沉 多酚氧化 酶活 力 测 定 方 法 : 取 pH 值 为 6. 8 ( ) 淀 ,即得黑色素粗品 。 的磷酸盐缓冲液 PB S3 mL 及 0. 1 mo l /L 邻苯二酚 2 mL ,混匀于试管中 ,并在 30 ?水浴锅中预温 。在适量黑色素粗品中加入 7 mo l /L 的 HC l 15 mL 于 100 ?水浴 6 h, 4000 rpm 离心收集沉淀 ,用蒸馏 PDB 培养基 中取 菌悬 液 2. 4 mL , 经 10 , 000 rpm , 5 水漂洗 3次 ,沉淀溶于 pH 8. 0 的 KOH 中 。加入一 m in离心 ,取上层清液 2 mL 加入经 5 m in 预温后的 ( ) 倍体积的氯仿 :异戊醇 1: 5 , V /V 上下颠倒数次后 混合液试 管 中 , 混 匀 后 立 即 使 用 可 见 分 光 光 度 计 ( )离心收集上清液 ,重复三次操作 。将所收集的液体 410 nm 进行调零 ,然后将比皿中的混合液倒回原 用 1 mo l /L HC l 调 到 pH 2. 0 , 离 心 收 集 沉 淀 。用 试管中 ,再次将混合液试管放入水浴锅中 , 1 m in 后 100 %乙醇 、95 %乙醇 、70 %乙醇梯度洗涤 ,再离心收 测定吸光值 。每隔一分钟进行一次测定 ,共测 5 次 。 集沉淀 。沉淀用去离子水漂洗三次 ,冷冻干燥后存 定义 1 mL 酶液在 1 m in 内使反应溶液体系吸光值 ( )() 于 220 ?冰箱备用 。 410 nm 增加 0. 001 为 1个酶活单位 U 。1. 3. 3 香灰菌黑色素对真菌生长的影响试验 将提2 结果与分析 取纯化处理后的香灰菌黑色素 ,于 60 ?溶 于 pH 8. 0 的 KOH 溶液中 ,使其终浓度达到 20 g /L , 2. 1 香灰菌黑色素对真菌生长的影响 μ用 0. 22 m 微孔滤膜过滤除菌后作为黑色素母液 在含有 0. 1和 0. 5 g /L 香灰菌黑色素的 PDA 培 备用 。 养基中 ,平菇 、金针菇 、黑木耳和猪肚菌在第 3、6 和 将黑色素母液添加到 PDA 培养基中 ,使其浓度 9 d的菌落直径都略大于空白对照 , 而在两种黑色 分别达到 0. 1 和 0. 5 g /L , 将所实验的六种真菌取 素的浓度的培养基中相差不大 。鬼伞在添加 0. 5 g / 0. 5 cm ×0. 5 cm 大小接种于添加了相应的浓度的 L 黑色素情况下 ,在测定时间内菌落直径都较低于 黑色素和空白对照的 PDA 培养基中 ,每 3 d测量六 空白对照和添加了 0. 1 g /L 黑色素的培养基 。香菇 种真菌的菌落直径 ,三次重复 ,计算平均值 。 在添加黑色素的培养基中生长 都略 低 于空 白对 照 () 1. 3. 4 香灰菌黑色素对真菌多酚氧化酶活性的影 见表 1 。与空白对照相比 ,六种真菌在添加了黑 响试验 色素的培养基中生长情况没有明显差异 ,说明香灰 在装有 100 mL PDB 培养基的 250 mL 三角瓶菌黑色素对这六种真菌没有明显的生长抑制作用 。 中 ,以黑色素为诱导物 ,分别在培养基中加入黑色素 ( )表 1 六种真菌在添加不同黑色素浓度 PDA 培养基上的菌落直径 cm ( )Tab le 1 Co lony d iam e te rs of six fungi on PDA added d iffe ren t concen tra tion s of m e lan in cm ( )( )空白对照 Con tro l 黑色素 M e lan in 0. 1 g /L 黑色素 M e lan in 0. 5 g /L 3 d 6 d 9 d 3 d 6 d 9 d 3 d 6 d 9 d 1. 71 5. 8 8. 47 2. 02 5. 69 8. 81 1. 58 5. 17 8. 90 平 菇 金针菇 1. 83 6. 71 9. 00 2. 22 7. 32 9. 00 2. 21 7. 12 9. 00 鬼 伞 1. 14 2. 96 5. 52 1. 16 3. 01 5. 27 0. 98 2. 78 4. 98 黑木耳 1. 22 3. 73 6. 78 1. 31 4. 21 7. 12 1. 31 4. 41 7. 04 猪肚菌 1. 24 4. 43 7. 32 1. 31 4. 53 7. 62 1. 23 4. 50 7. 51 香 菇 0. 85 2. 72 5. 14 0. 91 2. 20 4. 79 1. 00 2. 66 4. 78 Vo l120 吴 尧等 : 香灰菌黑色素对真菌生长及多酚氧化酶活性的影响 503 2. 2 香灰菌黑色素对真菌多酚氧化酶活性的影响 香灰菌黑色素对平菇 、金针菇 、灵芝 、猪肚菌 、黑 木耳 、鬼伞六种大型真菌的胞外多酚氧化酶活力的 影响情况如图 1 ,6所示 。 从图 1、图 5可以看出 ,平菇和黑木耳的胞外多酚氧化酶活力在 0. 1 g /L 黑色素浓度范围内 ,培养 5 周后 酶活分别达到最大值 93. 5 U 和 21. 25 U ,超过 0. 1 g /L 时酶活随浓度增加而减小 。在空白对照中 ,平菇在第 四周出现酶活最大值 29. 5 U ,黑木耳在第三周出现酶 活最大值 8. 25 U。除平菇黑色素浓度为 0. 4 g /L 的试 样低于空白试样 ,黑木耳除黑色素浓度为 0. 3和 0. 4 g / L 的试样与空白试样的酶活接近之外 ,两者其它浓度的 试样酶活均高于空白试样 。 添加了 0. 05 g /L 黑色素的培养基中培养的金 针菇 ,在培养 2 周后其胞外多酚氧化酶活达到最大 值 54. 25 U ,其酶活明显高于空白试样 47. 25 U ,在 (其它浓度黑色素的试样酶活均略低于空白组 见图 ) 2 。灵芝在黑色素浓度 0. 2 g /L 培养的第 2 周达到 最大值 36. 875 U ,而空白对照中相同培养时间出现 () 酶活最大 值 10. 75 U 见 图 3 。猪 肚 菌 在 第 3 周 013 g /L 黑色素浓度下达到最大值 71 U 之后 ,随添 加的黑色素浓度增加会使酶活下降 ,空白对照在第 () 2 周出现最大值 32. 125 U 见图 4 。鬼伞的酶活在 添加黑色素浓度为 0. 4 g /L ,培养的第三周表现出最 大活性 23. 25 U ,空白对照在第 6 周出现酶活的最 () 大值 2. 665 U 见图 6 。 添加了黑色素的所有试样 的酶活均高于空白试 样 ,即各浓度黑色素对多酚氧化酶活力的提高均起到 了促进作用 。黑色素对灵芝 、猪肚菌 、鬼伞胞外多酚氧 化酶活力的影响情况呈现了相同的趋势 ,即在相同的 时间 ———第三周 ,出现了酶活的最大值 ,而平菇和黑木 耳是在第五周 。黑色素对金针菇胞外多酚氧化酶活力 的诱导作用主要体现在 0. 05 g /L 以下的低浓度范围 。 香灰菌黑色素对六种真菌影响的差别在于酶活变化最 大值所对应的黑色素浓度和培养时间不同 。 图 1 黑色素对平菇多酚氧化酶活力的影响 F ig11 Effec ts of m e lan in on P leu rotus ostrea tus ac tivity ve2 lu tip e lagsbuchhand lung, Sc ience Pub lishe rs, Stu ttga rt. 1998 , 174 . 3 讨论 () () () 3 W u Y 吴尧 , M a AM 马爱民 , Si GH 佀国涵 , et a l. I2 so la tion and an tioxidan t ac tivity of m e lan in p igm en t from H y2 六种真菌在添加了香灰菌黑色素的培养基中 , 均生长良好 ,与空白没有明显差别 。因此我们可以 () poxy lon sp. N a t P rod R es D ev 天 然 产 物 研 究 与 开 发 , 推测 ,香灰菌黑色素作为一种类多酚物质不会对大 2007 , 19: 470 2473. Βm itnaü l M. P rop e rtie s of po lyp heno l oxida se from A nam u r 部分真菌产生毒性 ,并可以被大部分真菌分解 。 4 () banana M usa cavend ish ii . Food Chem , 2007 , 100: 909 2 添加了香灰菌黑色素培养的六种真菌菌悬液 , 913. 其胞外多酚氧化酶酶活明显高于空白组 ,而且在一 Sco re AJ , Pa lfreym an JW , W h ite NA. Extrace llu la r p heno loxi2 5 定范围内随着黑色素浓度的增加而提高 ,说明香灰 da se and p e roxida se enzym e p roduc tion du ring in te rsp ec ific 菌黑色素能够对真菌多酚氧化酶起到诱导作用 。在 funga l in te rac tion s. In t B iodeter B iodeg r, 1997 , 39: 2252233. 不同的黑色素浓度下 ,随着培养时间的增加 ,六种真 () () () Yin YF 殷亚峰 , D ing YT 丁玉庭 , O uyang J 欧阳喆 , 6 菌胞外多酚氧化酶酶活先递增 ,达到最大值后再递 et a l. Stud ie s on fe rm en ta tion cond ition s of Ganode rm a luc id2 减 ,但达到最大值的时间有一定的差异 。 um p roduc ing po lyp heno l oxida se in the low2grade green tea. () J Z hejiang U n iv Tech 浙江工业大学学报 , 2005, 33: 390 2 多酚氧化酶是植物体内普遍存在的一种非线粒 394. 体内的末端氧化酶 ,它可以把酚类物质如单酚 、邻苯 () () () H uang YK 黄有凯 , L uo M 罗曼 , J iang L K 蒋立科 , et 二酚 、邻苯三酚 、对 苯二 酚等 氧 化为 相应 的 醌类 物 7 a l. Effec ts of T richoderm a ha rzia rum on po lyp heno l oxida se [ 7 ] 质 。醌类物质对病原 微生 物 起着 抑制 作 用或 杀 () and p e roxida se in rice. M icrobiology 微 生 物 学 通 报 ,[ 8 ] 伤作用 ,具有一定的抗病能力 。多酚氧化酶对食 2003 , 30: 124. 品和饮料生产也会产生重大影响 ,它不仅影响食品 () () L i ZG 李忠光 , Gong M 龚明 . Imp rovem en t of m ea su re2 8 和饮料的色泽 ,也影响其品质 ,特别是在制作绿茶 、 m en t m e thod of po lyp heno l oxida se ac tivitie s in p lan t. J Yun2 [ 9 ] () 红茶 、烤烟和水果类饮料的过程中更为突出 。因 nan N orm a l U n iv 云南师范大学学报 , 2005 , 25: 44 249. () () () Cao ZY 曹志艳 , Yang SY 杨胜勇 , Dong J G 董金皋 .此 ,利用香灰菌黑色素来提高真菌多酚氧化酶的活 9 A review on re la tion s be tween p a thogen ic ity and m e lan in of 力 ,有着重要的现实意义 。 () p lan t fungi. M icrobiology 微 生 物 学 通 报 , 2006 , 33: 154 2 158. 参考文献 ) () () (10 D a i Y 戴亚 , Sh i CH 施春华 , Tang H 唐宏 , et a l. The 1 Ko llo sa N. 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