MTHFR基因突变及叶酸维生素B12缺乏与中青年脑梗死发病关系的研究

MTHFR基因突变及叶酸维生素B12缺乏与中青年脑梗死发病关系的研究 天津医科大学 硕士学位论文MTHFR基因突变及叶酸维生素Blt12gt缺乏与中青年脑梗死发病关 系的研究 姓名:高海凤 申请学位级别:硕士 专业:神经病学 指导教师:张哲成 20030501 丕堡墨壁盔兰堡主竺堂垡重塞 一 ,,,,,基因突变及叶酸维生素,,,,缺乏与 中青年脑梗死发病关系的研究 摘要 目的:探讨高同型半胱氨酸血症(,,,,,,,,,;,,,,,,,,,，,玎,;,)与中青年脑梗死的相互关系，并就可能引起，,,,;,的,,，,,,，亚甲基四氢叶酸还原酶 (,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,,,;，，,,,,,)的基因多态性和叶酸维生素,,,相关因子进行研究分析，为中青年脑梗死的一级预防寻找新的危险因素。 方法:收集,,例中青年脑梗死患者(年龄?,,岁)和,,例正常对照者 (性别及年龄与病例组匹配)的一般资料，采用,,,,,,,,技术检测,,,,,基因,,,,,多态性，应用高效液相色谱荧光检测法测定空腹及蛋氨酸负荷后血浆惑同型半胱氨酸(;,,,, ,,,,;,,,,,,,，,,;,);水平，用化学发光法检测血清时酸和维生素,,,浓度，血脂及血糖由我院生化室常规测定。 结果:(,)脑梗死患者组空腹血浆,,,,水平均值为,,(,, , ,,,。，负荷后均值为,,(,,,, ,,,,,，明显高于对照组的,,(,,“,,,,,和,,(,,,， ,,,,,俾,,(,,)。(,)病例组中,;,,检出率为,,(,,,，对照组，,,,;,检出率为,(,,,。两组比较有统计学意义(,,,(,,)。(,),,,,,基因,,,,,多态性有三种基因型:纯合突变(,,,)型、杂合突变(,,,)型和野生型(,,,)型。 “)脑梗死组,汀型、,,,型和,,,型频率分别为,,(,,,、,,(,,,和,,,,,，对照组分别为,,(,,,、,,(,,,;,,, ,,(,,,;脑梗死组,等位基因频率为,,(,,,。对照组为,,(,,,:脑梗死组,仃纯合基因型频率及,等位基因频率明显高于对照组(,,,(,,)。(,,两组三种基因型血浆空腹,,，;,水平的改变存在同一种趋势，即,玎型者高于,，,和,,,型者(,,,(,,)，,,,型和,,,型者比 天津医科大学硕士生学位论文比较无差别,,,,(,,)。(,)血清叶酸水平病例组明显低于对照组，分别为,(,,?,(,, ,,,,,和,(,,?,(,,,,,,,:两组血清维生素,,,浓度比较，病例组为,,,(,,”,,,,,(,,,,,,,，明显低于对照组的,,,(,,，,,,(,,,,,,,(,,,(,,)。(,)空腹血浆,,;,水平与叶酸、维生素,(,浓度呈负相关(,,,(,,)。(,),,种基因型的血清叶酸及维生素,,:水平比较，,仃基因型者均低于,,,和,,,型者(,,,(,,)，,,,型和,,,型无统计学差异(,,,(,,)。(,)脑梗死组神经功能缺损程度与空腹血浆,,;,水平无明显相关性(,,,(,,)。?,,,,,,,,相关分析证实,,;,是中青年脑梗死发病的独立危险因素。 结论:,,,,,基因突变和叶酸及维生素,,,缺乏是引起，,，,;,间接导致中青年脑梗死的重要遗传和营养因素。 关键词:脑梗死 中青年 ,,,,,基因 叶酸 维生素,。 墨堡堕型盔兰堡主竺兰堡兰苎一—— ,,,仃,;, ,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,;,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,(,,;,),,, ;,,,,,,, ,,,,,;,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,也, ,,,,,,, ,,;,,,, ,,,;, ,,,, ,,,, ,, ,,;,，,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,; ,,;,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,,,,, ,;,,，,,,,,,, ,,,，,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,, ,,,,,;,,,,( ,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,(,,,, ,,;,,,,,,,，,,, ,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,—,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,;,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,;, ,,？,,, ;,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,，,,,;,,;,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,; ,;,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,;,,,,,,,,,,,;,,, , ,,, ,,,;,,, ,,,, ,,,,,,,,，,,,,, ,,,,,, ,;,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,, ,,,, ;,,,,,,, ,,,,,;,,,, ,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,( ,,,,,,,(,),,, ,,,, ,,,, ,,,,,, ,,;, ,, ;,,, ,,,,, ,,,, ,,(,, ,,,, ,,,, ,,，,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,(,, ,,, ,,,,,，,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,, ,,(,, , ,,,,, ,,, ,,(,, , ,,,,,(,,,(,,)((,)，, ;,,,,,,,,，,,(,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,，,,,,,,,;,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,;, ,,, ,(,,,,,,,(,,)((,),,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,, ,,,,,,,,(,,,)，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,),,, ,,,, ,,,,(;,;)((,),,, ,,,？,,,;,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,:,,,，,,(,,,;,,,，,,(,,,;,,,，,,(,,,，,,,,,,,;,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ;,,,,,, ,,,,,(,,,(,,);,,, ,,,？,,,;, ,, ,,,,,,, ,, ;,,,,,,, ,,,,,;,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,(,,,，,,,,,,,;,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,;, ,,, ,,,, ,,(,,,,,,,(,,((,),,, ,,,, ,,,,,,;, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,,,,,，,,,, ,,,,,, ,,,, 一,, 一 一 盔堡垦型茎堂堡圭兰兰堡堡兰 ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,(,,,(,,)， ,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,;, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,(,,,(,,)( (,),,, ,,,,, ,,,,; ,;,, ;,,;,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,, ,(,,,,,,(,, ,,,,,，,,,,, ,,,,, ,,?,(,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,，,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ,,, ,,;, ,,,,,,,,;, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,(,,,(,,)((,),,, ,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,, ,,;, ,,, , ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,,,,, ,,,,; ,;,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,;,,,,,,(,,,(,,)((,),,, ,,,,, ,,,,; ,;,,锄, ,,,,，，,,, ,,, 。,眦。,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,,,, 、?,,,,,, ,,。,,,, ,,,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,(,,,(,,)((,)，, ;,,, ,,,,,(,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,;, ,, ,,;, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,, ,,, ,,髓,,,, ,,,,, ,,,;,,,,,, ,;,,,,(,,,(,,)((,,),;;,,,,,, ,, ,,,,,,,, ;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,;, ,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,;,,,, ,,, ;,,,,,,, ,,妫幔颍悖簦椋铮?,, ,,,,, ,,,,招(,,,;,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,;,,,;, ,, ,,咖,,,,; ,;,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,; ,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,, ,,,;, ,,,, ,,;,,,,,,, ,,,,,;,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,(,,, ,,,,, ;,,,,,,, ,,,,,;,,。, ,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,; ,;,, ,,,,,,,,,, ?,( 天津医科大学硕士生学位论文 前 言 脑血管病作为神经科常见病、多发病，近年来发病率逐年上升。据流行病学调查，脑血管病、心血管病和肿瘤是目前威胁人类健康和生存的三大杀手。脑血管病致残率及致死率极高，给家庭和社会带来沉重的经济负担。近年来脑梗死发病年龄有明显年轻化趋势，且发现部分早发性脑梗死患者并无高血压病、高血脂、糖尿病、冠心病及饮酒、吸烟等危险因素。作为社会前进和发展动力的中青年，担负着家庭和社会的双重压力，其发病所带来的损失更是巨大。因此，探索新的危险因素对于脑血管病尤其是早发性脑卒中的预防工作显得尤为迫切。 脑血管病是多危险因素疾病，其危险因素可分为两类，一类是无法干预的，一类是可以干预的，还有相当一部分至今尚未获共识。如能对其中一些确定的可改变的危险因素予以有效的干预，则可能降低脑卒中的发病率退劳雎省, 昀矗 孀畔赴 肿由 镅В 肿右糯 Ъ际醯姆?梗 臃肿铀 教教制浞?』 疲 罢移湟赘谢 颍 佣 锌赡艿母稍ず椭瘟埔 殉晌 醚芯苛煊虻娜鹊恪啊啊俊?自,,,,年,;,,,,,九首次报道,例少见的先天性异常病例，即因胱硫醚?,,合成酶(,,,)缺乏引起的同型半胱氨酸尿症患儿表现出严重的动脉粥样硬化征象以后，人们逐渐认识到同型半胱氨酸(,,,,;,,,,,?，,,,)在动脉粥样硬化发病中的重要性。而,,;,作为心脑血管病发病的一个独立危险因素，已成为近年来的研究热点，越来越受到关注。 ,;,是一种含硫氨基酸，不属于组成蛋白质的,,种氨基酸，体内不能合成，只能来源于蛋氨酸的分解代谢。血浆,,,,包括,,,、双硫同型半胱氨酸(,,,,,,,,, ,,,,;,,,,,,)和混型半胱氨酸(半胱氨酸(,,,,, (,一 天津医科大学硕士生学位论文,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,—,,,,,,,,)三种形式。正常人体内游离,,,很少，一般是以蛋白结合形式存在。人体摄入的,,，;,有,,,经肾脏清除，健康的肾脏能完成,,,的,,,代谢过程，肾功能不全则影响,,,代谢。 ,,,在细胞内有三种代谢途径:(,),;,重新甲基化为蛋氨酸，称再甲基化途径。即在蛋氨酸合成酶催化下，以维生素,，:为辅因子，再甲基化形成蛋氨酸，此反应中，必须有,，(甲基四氢叶酸作为甲基的供体，,,,甲基四氢叶酸在,,,,,催化下，由四氢叶酸产生的。(,),,,与丝氨酸缩合为胱硫醚。称为转硫化途径。此途径由,,,催化，以维生素段为辅因子，与丝氨酸聚合成胱硫醚，进而代谢为胱氨酸和,(丁酮酸。(,)直接释放入细胞外基质内。此部分与血浆浓度的测定密切相关。它反映了,,,生成和代谢之间的不平衡，当在细胞培养液中加入大量的蛋氨酸，细胞释放,,,会明显增加。 在,,,代谢途径中，如果缺乏作为甲基供体的甲基四氢叶酸，以致,,,不能再甲基化合成蛋氨酸，或,,,合成胱硫醚受阻不能继续降解时都会造成,,,在血循环中的积累，导致，,,,,。 引起，,,,,的因素很多，包括遗传、营养及其他因素。营养性因素,〕，如代谢中作为辅酶参与的维生素,,、维生素,。:及叶酸缺乏，可导致,,;,。,,,,,,,,,,等”,对,，,和轻微脑卒中患者及正常对照组观察后发现，血浆,,,,水平受叶酸、维生素,。。及年龄、性别、肾功能等因素的影响，单因素分析结果显示，血浆,,,,水平与血清叶酸及维生素,，:水平呈显著负相关，多因素逐步回归进一步证实了上述结论。,,;,,等,,,,年报道，，,,,,,者,,,伴随一种或多种,族维生素(叶酸、维生素,。。、维生素,,)的缺乏。证明维生索,。,及叶酸的缺乏是诱发血浆,,,,水平升高的一个重要代谢因素„“。 遗传因素，即,,,及,,，,，,,活性降低而引起的,,;,。其中以,,,,,基因突变较常见。人类,,,,,基因位于染色体,,,,(,上，互补脱 (,( 墨堡垦型查堂堡主竺兰垒堡苎——氧核糖核酸(;,,,)全长,(,,,。,,,,,,等盱,应用多聚酶链反应一单链构象多态性(,,,—,,,,)技术证实,,,,,基因在,,,位发生点突变，碱基,置换了碱基;，其编码的氨基酸由缬氨酸替代了丙氨酸，引起,,,,,活性大大降低，而其不耐热性却大大增加，从而引起,,,甲基化受到抑制，导致血浆,,,,水平升高。研究表明,,〕,,,,,、,,,基因突变可能通过使酶活性降低导致的血浆,,,,水平升高从而参与动脉硬化的形成和发展，认为,,,,,和,,,基因突变是脑血管病的易感基因。,,,,,,,,,,等”,对,,例中或重度,,,,的血栓患者进行的研究表明，,,,,,基因,,,纯合子与中度增高的血浆,,,, 水平有关，,,(,,中度,,,,,患者存在此种基因突变，,,,基因变异与异常增高的,,,,有关，且病例组,,,,,及,,,均有突变的比例是,,(,,，明显高于对照组的,(,,。,,;？,,,等?们在研究了,,,位患者后发现，纯合子突变基因型患者的血浆,,,,水平比正常基因型者高,,,。许海燕等,?的资料表明，,,,,,基因突变者，无论纯合子或杂合子，血浆,,,,水平均明显高于无突变者。 ,,,;,,,等于,,,,年通过流行病学调查，首次提出,,,,是心血管病的独立危险因素。此后，许多研究相继证实，,,,,与急性心肌梗死、脑卒中、冠状动脉疾病以及外周血管病有密切的关系„,,，,,，…。,,,,,等„,,,调查了,,,,例美国成人血浆,,,,水平与卒中的关系，卒中者共,,,人。校正年龄后，卒中的比数比为,(,(,,,,， ,(,(,(,):校正性别、种族、教育程度、收缩压、胆固醇水平及吸烟、糖尿病等因素后。则联系强度较年龄稍低(比数比为,(,，,,,,， ,(,—,(,)。最后结论为血浆,,,,水平增高增加了卒中的危险度。一项涉及,,,,例患者和,,,,名对照者的流行病学资料显示，轻至中度的,,,,明显增加脑血管病的发病危险性，而且，血浆,,,,水平与脑梗死的严重程度有相关性,,,,。,,, ,, ,,,〕报道,,例脑梗死患者和,,,名对照的研究表明， (,( 天津医科大学硕士生学位论文患者组的血浆,,;,水平平均值比对照组高,(,倍，且患者组存在,处或,处血管狭窄的血浆,,;,水平明显高于仅有,处狭窄或血管正常者。 随后的研究表明，单纯检测空腹血浆,,;,水平会使相当一部分，,,,;,患者漏诊。,,;,是指空腹血浆,,;,水平或,和蛋氨酸负荷后的血浆,,;,浓度超过正常对照组,,,参考值的上限。,,,,等?引对,,,例受试者研究后发现，,,,例,,;,中,,,是通过,,,发现的，而这些患者空腹血浆,,;,水平却表现正常，因而,,;,的检测必须包括空腹和,或负荷后血浆,,;,水平增高两种情况才有意义。 血浆,,,,水平升高可通过一系列因素促进动脉粥样硬化和血栓的发生，从而导致心脑血管病的发生四，。,,„,,„,,〕。,;,对血管的损害机制主要涉及血管壁、血小板和凝血因子三方面。一般认为，,,;,可使氧自由基生成，引起血管内皮细胞的损伤和毒性作用;并促使动脉平滑肌细胞的增生，加速,,,胆固醇的氧化，削弱,,,胆固醇的保护性作用，增加泡沫细胞的形成，致使血管内壁增厚，且影响血管壁弹性，导致闭塞性血管病的发生;可增加细胞内,,腺苷同型半胱氨酸，后者调控内皮细胞的凋亡，从而引起内皮功能受损并抑制内皮细胞生长:增加血小板凝血恶烷的产生，激活血小板的黏附和凝血因子,的活性，抑制蛋白,的活性;另外，血浆,,;,水平增高常伴有低纤溶活性，故在形成血栓机制中可能还与纤溶系统有关。 为研究脑梗死患者发病与,,;,关系，探讨脑梗死患者中是否存在着,,,,,基因突变和血清叶酸、维生素,,,缺乏，本课题应用,,,(,,,,技术检测,,,,,基因,,,,,突变，用高压液相荧光检测技术测定空腹及蛋氨酸负荷后血浆,,;,水平，用化学发光法检测血清叶酸和维生素,,,浓度，对脑梗死患者及正常入进行对照研究，为中青年脑梗死的一级预防寻找新的危险因素。 (,( 天津医科大学硕士生学位论文 材料与方法,、 研究对象: 选取,,,,(,,,,年发病,,内收住我院的脑梗死病人,,例，其中男,,例，女,,例，年龄,,(,,岁，平均年龄,,(,,?,(,,岁，均经头,,或,, ，证实，除外心源性栓塞、肝、肾功能不全及甲状腺疾病者，根据,,,,年全国脑血管病诊断标准，符合腔隙性脑梗死患者,,例，动脉血栓性脑梗死患者,,例。病例组患者均于发病,,内根据脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准(改良的爱丁堡与斯堪的纳维亚研究组标准)行神经功能缺损评分，最高分,,分，最低分,分，轻型,,,,分，中型,,,,,分，重型,,,,,分。正常对照组,,例，男性,,例，女性,,例，年龄范围,,,,,岁，平均,,(,,?,(,,岁，年龄及性别与病例组匹配，均系本科医务工作者及志愿者。二、 主要试剂:(,),,,提取试剂,,,溶液，,,,,,,,,,,，,,,,,,溶液，饱和,,,，溶液，无水乙醇，,,溶液，均用国产分析纯试剂配制。三,,,试剂 ,(,,？ ,,,聚合酶(华美生物工程公司); ,(,×(,,,,)(上海生物工程公司); ,(,,×,,？ ,,,聚合酶,,,,,, ,(华美生物工程公司);,,,,, ,,,,(,;,(,, ,(, ,, ,,?)，,,,,, ,,，，,(,,,,,,,, ,(,,,,,,, ,,,,, ,,, , , , , , ,,,,,独立包装。,(,,,引物:上游引物:,?(, , , , , , , , , , , ,(,， ,,( 天津医科大学硕士生学位论文下游引物:,?一,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,?引物由上海生物工程公司合成。三,,,,试剂 ,(,,,,，内切酶(华美生物工程公司) ,(,,×,,，,,，,,,,,,(华美生物工程公司) ,,,,”，,,,—,,，(,, ,(,)，,,,,,,,，，,(,,,,,,,，,,,,,,，,(,,,,,, ,,,，,,,,,,;,,,, ,(乙酰化,,,(,,,,,,)四电泳试剂 ,(琼脂糖(华美生物工程公司) ,(溴化乙锭(,,。华美生物工程公司)五叶酸、维生素,。:测定试剂 ,(，,,,,，,,叶酸化学发光试剂盒(,,公司，,,,) ,(，,,,,，,,维生素,。。化学发光试剂盒(,,公司，,,,)三、 主要设备:(,)高速台式离心机(上海医用分析仪器厂，,,,(,,,型)三,,,仪(美国,,公司，,,,,型)三稳压、稳流电泳仪(北京市六一仪器厂，,,,(，，型)四可见，紫外检测仪(北京市六一仪器厂，,,,,,型)五分析天平(上海衡器厂)六高效液相色谱仪(美国,,,,,?,一,,,,型)七荧光检测仪(,,—，,,型)八色谱数据处理机(,,—,,型)九，,,,,，,,检测仪(美国,,公司，,,,,,型) 天津医科大学顾士生学位论文四、 方法与步骤:(呻血浆,,;,水平测定:所有入选对象均于清晨空腹抽取肘静脉血,,,，,,,,,,抗凝后，置于冰水中，于,,内,。,,,,,,力离心,,,,,，分离出血浆，置(,,。,保存。取血后马上口服含,一蛋氨酸(,(,,,,,)的橙汁,,,,,后，可进食碳水化合物的食物，,,后，再次抽取静脉血,,,，按上述方法分离出血浆，保存。标本全部采集完后，采用高压液相色谱荧光检测技术测定，以美国,，,,,公司提供的,;,标准品作对照，并对其作稳定性及准确性进行检验。批内变异系数为,(,,,。批间变异系数为,(,,,。三外周血白细胞,,,的提取; ,(,,,,抗凝全血,(,,,加入,(,,,,,,溶液及,, ,， ,,,,,,,,,,,,剧烈 混匀，室温,,,,,离心,,,,,，弃去上清液; ,(反复加入,,,溶液,(,,,，清洗沉淀后以,,,,,离心,,,,,，弃去上 清液三次，直至沉淀为白色; ,(力日入,,,溶液,(,,,，,,,,,,,,且,混匀， ,,?水浴,,,,,: ,(取出后加入,, , ,饱和氯化钠溶液摇匀，室温,,,,,,,,离心,,,,: ,(取上清液约,,,(,,, , ,，加入三倍体积无水乙醇，室温,,,,,,,,离 心,,,,,, ,(弃去上清液，加入,,,乙醇,(,,,清洗后，室温,,,,,,,,离心,,,,,: ,(弃去上清液，室温晾干，加入,,, ,,,溶液，(,,”,保存备用。三目的基因的体外扩增: ,(,,, ,反应体系: ,,×,,,,,,(( , , , ,,,, ,,,,,:,,(,, ,,,,,,,,,,:,, , 丕堡垦型查兰堡主皇兰堡堡苎 上游引物:,,,,,, 下游引物:,,,,,, ,,,模板:,, , ,,？,,,聚合酶:,, ,,,,,:加至终体积为,,, , ,(,,,反应条件: ,,?,,,,一,,?,,,,一,,?,,,,一,,?,,,,一,,?,,,, , , ,, ;,;,,, ,,,反应结束后，取,(,,,,,,产物于,,琼脂糖凝胶中电泳，以,,,,,,,,,,,, ，为,,,分子量,,,,,,，观察电泳结果并照相。四扩增片段的限制性片段长度多态性(,,,,)分析: ,(,,,,反应体系 ,,,产物,,,, ,,,,， ,, ,,,,,, ,,, 乙酰化,,,, ,,,, ,,,,,加至终体积为,,, , ,(酶切:,,,酶切,小时后，,(,,琼脂糖凝胶中电泳，以,,,,, ,,,,,,,，为,,,分子量,,,,,,，观察电泳结果并照相。 ,(电泳条件: 电压:,,,, 电流:,,,, 温度:,,,,,? ,,,( 天津医科大 ×,,,五血清叶酸、学硕士生学位论文 电泳时间:，(,小时 电泳缓冲液:, 维生素,,,测定:清晨空腹抽取肘静脉血,,,，于当日内,,,,,,,离心,,,,,，分离出血清，置(,,”,保存。标本全部采集完后，用美国,,公司的，,,,,，,,试剂盒，采用化学发光法测定。其中，叶酸批内变异,(,,，批间变异,(,,;维生素,,,批内变异,(,,，批间变异,(,,。血脂、血糖等生化指标由,,,(,,,,,全自动生化分析仪测定完成。六统计学处理:应用,,,, ,,(,统计软件包处理，计量资料以,?,表示，两组小样本间均数比较在方差齐性检验后应用,(检验;多组间均数比较用方差分析:组间率的比较应用, ,检验，血浆,,,,水平与高血压病、血脂、糖尿病、吸烟及饮酒等危险因素的相关性分析用,,,,,,,,相关。 一】,, 结 果 (一)病例组与对照组一般情况比较(表,)病例组体重指数(,,，)、空腹血糖(,,,)、总胆固醇(,,)、甘油三酯(,,)及低密度脂蛋白(,,,)水平均高于对照组(,,,(,,)，两组比较有统计学差异。 (,,)病例组与对照组血浆,,,,水平、,,;,检出率及血清叶酸和维生素,,,水平比较(见表,)病例组空腹血浆,,,,水平(,,;,)、负荷后血浆,,,,水平(,,,,)均值分别为,,(,, ，, ,,,,,和,,(,, , ,,,,,，明显高于对照组的,,(,, , ,,,,,和,,(,,, ,,,,,(,,,(,,)。病例组血清叶酸平均浓度为,(,,,,,,,，维生素,,,为,,,(,,,,,,,，明显低于对照组的,(,, ,,,,,和,,,(,, ,,,,,(,,,(,,)。以空腹和,或蛋氨酸负荷后血浆,,;,水平超过正常对照组的,,,为,,,,的标准，发现病例组中,,,,者,,例，检出率为,,(,,,，对照组中,,;,仅,例，检出率为,(,,,，前者明显高于后者(,,,(,,)。 (三)血浆,,,,水平与血清叶酸、维生素,,,浓度及其它危险因素间 的关系 (表,) ,,,,,,,,等级相关结果显示，血脂、高血压、体重指数、吸烟与血浆,,,,水平无明显相关性(,,,(,,)。血清叶酸、维生素,,,浓度与血浆,,,,水平呈负相关(,,,(,,)。空腹血糖与空腹血浆,,,,水平呈正相关(尸,,(,,)。 (四),,,,,基因,,,扩增产物鉴定:根据,,,,,基因的序列，参照文献的引物设计，合成了,,,,,基因目的片段的引物，利用,,,法进行目的片段的扩增，,,,扩增产物与,,,,, ,,,,,,, ， ,,,,,,在琼脂糖凝胶上电泳，结果见图,，扩增片段长度,,,,,，其量及纯度适于进行下一步,,,,检 (,,, 天津医科大学硕士生学位论文测。(五),;,产物,,,,分析结果:将,,,,, ，酶切结果，用琼脂糖凝胶电泳参照,,,,, ,,,,,,, ， ,,,,,,，可见,,,,,有三种基因型:,仃纯合型，为酶切后含有,,,,,及,,,, ,种,;,,(,,,杂合型，含有,,,,,、,,,,,和,,,,三种片段;,,,野生型，为仅有,,,,,片段。因,,,,片断分子量太小，在琼脂糖凝胶电泳中速度快，常不显示或显示不清楚(图,)。 (六),,,,,基因,,,,,多态性基因型频率和等位基因频率分布:病例组与对照组基因型频率分布和,等位基因频率分布不同(见表,、图,、图,)。病例组,厂,纯合型基因型频率为,,(,,,，,等位基因频率为,,(,,,，明显高于对照组的,,(,,,和,,(,,,，(,,,(,,)。 (七)三种基因型空腹及负荷后血浆,,,,水平比较(见表,、表,、图,、图,)两组三种基因型空腹及负荷后血浆,,,,水平的改变存在同一种趋势，即研型者高于,,,型和,,,型者(,,,(,,)，而,,,与,,,型者无差异(,,,(,,)。 (八)三种基因型,,;,检出率的比较(表,)病例组中,,,,型患者,,例，其中,,，,;, ,,例，检出率为,,(,,，,,,型患者,,例，,,;, ,,例，检出率为,,(,,，明显高于没有基因突变的,,,型患者，后者的,,,,,检出率为,,(,,;对所有受试者的基因型与,,;,检出率的比较得出同样的结果，即有基因突变的患者,,;,发生率高于没有基因突变者。 (九)三种基因型血清叶酸、维生素,,,水平比较(见表,、表,、图,、图,)三种基因型的血清叶酸及维生素,,,水平比较，结果发现,厂,型者低于,,,和,,,型者(,,,(,,)，,,,型与,,,型者无统计学差异(,,,(,,)。 一,,( 天津医科大学硕士生学位论文 (十)神经功能缺损评分与血浆,,,,水平的关系(表,,) 根据患者入院时的神经功能缺损评分，将病例组分为轻、中及重三型，其中轻型,,例。中型,,例，重型,例(包括死亡,例)，三型的空腹,,;,水平经,,,,,比较无统计学意义(,,,(,,)。 (,,, 似茸鲁慷 .