左归丸、右归丸对皮质酮所致大鼠海马神经细胞病理模型学习记忆

左归丸、右归丸对皮质酮所致大鼠海马神经细胞病理模型学习记忆 1左归丸、右归丸对皮质酮所致大鼠海马神经细胞病理模型学习记忆相关 信号转导 蛋白表达的影响1 金国琴 赵新永 顾翠英 戴薇薇 徐品初2 上海中医药大学 上海 201203 摘 要 目的观察左归丸和右归丸含药鼠血清对皮质酮所致大鼠海马神经细 胞病理模型学习记忆相关信号转导蛋白表达的影响。方法体外采用高浓度皮质酮 10-4M处理细胞制作皮质酮损伤型大鼠海马病理细胞模型。采用Western blot 和免疫 细胞化学法观察模型细胞与学习记忆相关的信号转导蛋??/B>表达变化及左归丸和 右归丸含药鼠血清的干预作用。结果与空白对照组比较皮质酮模型组细胞与学习记 忆相关的信号转导分子p-CaMKII、p-CREB、 p-ERK、p-CREB 和Arc蛋白表达、以 及相关受体蛋白GR、MR、TrkB、NR1的表达均明显降低而Sinapsin-1蛋白的表达各 组间均无显著性差异与皮质酮模型组比较左归丸和右归丸鼠血清对模型细胞上述各 项指标的异常变化均有不同程度地改善作用。 结论补肾方药—左归丸和右归丸能够 保护大鼠海马神经细胞免遭高浓度皮质酮的损伤作用改善上述学习记忆相关信号转 导蛋白的异常表达。 关键词 海马神经细胞 皮质酮 补肾方药 学习记忆相关信号分 子 注 1. 上海市教育委员会重点学科建设资助项目J50301 上海市教委科研项目 07CZ04 2. 上海中医药大学附属曙光医院中医内科实验室 Effects of Zuogui Wan左 归丸 and Yougui Wan右归丸 on Learning and Memory -Related Signal Transdution Protein Repressions in the Corticsterone Induced Rat’s Hippocampus Neurocyte Pathologic Model1 Zhao Xinyong Jin Guoqin Gu Cuiying Dai Weiwei Xu Pinchu Department of Biochemistry Shanghai University of TCM Shanghai 201203 ABSTRCT Objective To observe the effects of Zuogui Wan左归丸 and Yougui Wan右归丸 rat’s serum on learning and memory related signal transdution protein repressions in the corticsterone induced rat’s hippocampus neural cell pathologic model. Methods: The pathologic neurocyte model was established by adding the high concetration corticsterone10-4M to culture the primary hippocampal neuron of the newborn SD rat. The learning and memory-related signal transdution protein repressions were examined by using Western blotting and immunocytochemistry method 2and the effects of Zuogui Wan and Yougui Wan were analysed. Results: Compared with the blank control group the expression of p-CaMKII、p-ERK、p-CREB signal molleculas and Arc protein and GR、MR TrkB、NR1 receptor proteins were obviously decreased in the pathologic neurocyte modelthere were no markedly difference in expression of synapsin-1 of among groups Zuogui Wan and Yougui Wan however could improve above indices in the pathologic cell model to verying degrees. Conclusion:The Zuogui Wan and Yougui Wan could protect Rat’s Hippocampus neurocyte from the toxicity of high concentration corticosterone and improve the abnormal expression of the learning and memory-related signal transduction proteins. Key words Hippocampal neurocyte CorticosteroneCORT Kidney-nourishing recipe learning and memory-related signal molecular NOTE: 1. This project was supported by Leading Academic Discipline Project of Shanghai Municipal Education CommissionNo.J50301. This project was also supported by Shanghai Municipal Education Commission fundNo.07CZ04 2.Affiliate Shuguang Hospital of Shanghai University of TCM. 报道提出随衰老下丘脑-垂体-肾上腺皮质HPA轴过度 亢进引起血中糖皮质激素大鼠为皮质酮CORT异常增高高浓度皮质酮反馈作用于大 脑海马区域神经细胞相应受体GR引起海马结构与功能的损害导致老年性学习记忆 下降1。中医认为老年性学习记忆减退属于 “呆症”和“健忘”范畴其病位在脑而本于 “肾”。左归丸和右归丸是经典的补肾方药具有延缓机体神经内分泌退行性变化及补肾健脑的功效2.3。本课组前期实验研究也发现左归丸和右归丸能够通过不同程度地降低血浆CRH、ACTH和皮质酮含量改善老年大鼠HPA轴的过度亢进状态降低皮质酮对大脑海马区域的毒性作用提高老年大鼠空间学习记忆能力4.5但其改善学习记忆的分子机制尚未探明。本文在前期工作基础上体外原代培养大鼠海马神经细胞模拟老年大鼠的高皮质酮血症采用高浓度皮质酮10-4M损伤细胞制作皮质酮损伤型大鼠海马病理细胞模型观察左归丸和右归丸含药鼠血清对学习记忆相关分子表达的影响为临床运用补肾健脑法改善学习记忆退化提供科学的实验依据。 1材料与方法 1.1左归丸和右归丸方药组成及含药鼠血清的制备 1.1.1动物SD雄性大鼠18只350?20克SPF级由上海中医药大学实验动物中心提供 3动物合格证号SYXK沪2004-0005。随机分为3组正常对照组、左归丸组和右归丸组。 1.1.2 方药组成 右归丸和左归丸取自《景岳全书》原方。右归丸由熟地24g、山药12g、枸杞12g、山茱萸9g 、菟丝子12g、鹿角胶12g、杜仲12g、当归9g、肉桂12g和制附子18g组成。左归丸由熟地 24g、山药 12g、枸杞 12g、山茱萸 12g、川牛膝9g、菟丝子 12g、鹿角胶 12g和龟胶 12g 组成各中药饮片购自上海华宇中药有限公司常规煎制。左归丸和右归丸药液分别含生药量为1.60g/ml和1.99g/ml。 1.1.3 鼠血清制备 参照文献6略加修改按临床60Kg体重成人用药量的25倍剂量灌胃给药每日2次。连续灌胃4天正常对照组以等体积的生理盐水灌胃。最后一次灌胃给药约1.5小时后动物麻醉腹主动脉采血。将血液置40C冰箱2小时2500 rpm离心25min取上层血清。将血清于56?水浴30 min 灭活后用0.22um滤器过滤除菌分装-200C冰箱保存备用。 1.2. 大鼠海马神经细胞原代培养及实验分组处理 参照文献7略加修改取新生24小时SD乳鼠海马组织剪为约lmm3的小块加入0.25胰酶消化置于37?、5 CO2培养箱中30min用种植培养液终止胰酶活性超净台上静置5min弃上清液进一步加人适量种植培养液滴管吹打制成细胞悬液以0.5??1X10-7个细胞ml接种于预先经多聚赖氨酸处理的细胞培养板中置于37?、5 CO2培养箱培养24小时后更换培养液nerobasalB2750:1继续培养以后每周更换培养液2次每次换半液。培养10天后换无血清培养液。实验分为5组1空白对照组2 l0-4M、CORT模型组3正常鼠血清干预组模型10正常鼠血清4左归丸含药鼠血清干预组模型10左归丸含药鼠血清5右归丸含药鼠血清干预组模型10右归丸含药鼠血清。继续培养48h后在倒置显微镜Olympus B×51下观察各组细胞形态变化。 1.3 Western blot检测各组大鼠海马神经细胞相关信号分子的蛋白表达变化 1.3.1总蛋白的提取 将长满细胞的6孔培养板放置在冰上弃去培养液。用预冷的PBS充分洗涤以洗去残留培养液。向培养板每孔中加入预冷的RIPA 裂解缓冲液0.25ml然后用细胞刮子沿着孔壁刮细胞。吸出刮下的细胞裂解液置于预冷的14ml 离心管中将样品管插入冰盒进行超声裂解超声强度以不产生泡沫为准每次超声2-3秒重复3-4次。取出小量细胞裂解液用C试剂盒测蛋白浓度分装、-70?冰箱保存。 1.3.2 免疫印迹及显色反应 上样将样品稀释成所需浓度加入5X上样缓冲液95?水浴5分钟。电泳10聚 4丙烯酰胺凝胶电泳每孔上样量为60μg蛋白。电压100V、15min120V恒压、1h 30min。转膜湿转200mA恒流、2h。洗膜用PBS洗涤10min/次X 3次。分别加一抗稀释液为含5脱脂奶粉的PBSTp-CAMKII、 p- CREP、p-ERK、Synapsin-1、ARC、内参β-actin稀释比例参照抗体说明书分别11000、12500、13000、13000、14000、15000倍。加入一抗后于室温孵育2h或4?过夜。洗膜用PBST洗涤5min/次X 3次。加入二抗抗兔HRP稀 释液为含5脱脂奶粉的PBST稀释比例为15000倍室温摇晃2h。洗膜用PBST洗涤5min/次X 3次。发光 加发光剂X光胶片曝光压片约2min显影。胶片进行灰度扫描结果以各组目的蛋白/内参蛋白比值表示。 1.4免疫细胞化学方法SABC检测各组大鼠海马神经细胞相关受体蛋白的表达变化 倾弃96孔板培养液PBS洗涤5 min/次×3次多聚甲醛固定lhPBS振洗10min/次×3次0.3 H2O2作用10min 用试剂室温处理30min。加入一抗分别为兔抗大鼠GR、MR、TrkB和NR1稀释比 均为1750倍室温孵育60min生理盐水洗min/次×次滴加溶液B生物素标记的二抗室温孵育30min生理盐水洗5min/次×3次滴加溶液C过氧化物酶标记的链霉菌抗生素蛋白室温孵育10min生理盐水洗5min/次×3次DAB显色系统显色:取1ml蒸馏水加50μl1-2滴溶液A混匀再加入溶液B50μl1-2滴充分混匀。避光保存30 min内有效。室温染色时间为4-10min。苏木素复染min自来水冲洗。倒置显微镜下观察海马神经细胞并拍照。用抗体稀释液替代一抗作阴性对照。 结果采用MIAS-160型自动图像分析仪进行分析每个标本随机选取3个区域取其平均值计算每个标本选取区域的平均值与总区域0.014 cm2之比相对比值。 1.统计学处理 应用SPSS11.0软件进行单因素方差分析结果以?S表示P