海藻糖对液态低温保存血小板保护作用的实验研究

海藻糖对液态低温保存血小板保护作用的实验研究 word格式论文 海藻糖对液态低温保存血小板保护作用 的实验研究 作者,崔云,刘璐,黄成垠,尹其华,黄鹰 ,摘要, 目的, 研究 海藻糖对液态低温,4?,保存血小板的保护作用。 方法 ,采集兔心脏血,按常规方法制备浓缩血小板,CP,,在CP中加入不同浓度的海藻糖,4?储存,用51Cr铬酸钠进行标记后自体回输入兔体内,于回输后1、24、48、72h抽取兔耳动脉血,测定放射性计数率, 计算 24、48、72h血小板存活率,同时设常温对照组及单纯4?储存的低温对照组进行比较。结果,加入不同浓度海藻糖各储存组的血小板寿命明显长于低温对照组,并且随着海藻糖浓度的增加而延长。结论,海藻糖可延长4?液态保存血小板的寿命,对血小板具有保护作用。 ,关键词, 海藻糖,血小板,液态,储存,4?,51铬 word格式论文 Abstract,Objective To study the protection of trehalose for liquid rabbit platelets stored at 4? traced by 51Cr. Methods Cardiac blood was taken and made into concentrated platelet(CP).CP were stored at different conditions,such as low temperature and low temperature+different dose of trehalose for 24h.Platelets were transfused into rabbits’ bodies after bEing labelled with 51Cr and platelet lifespan of 24,48,72h was calculated. Results After trehalose was added into the platelets stored at 4?,the lifespan was obviously longer than that of platelets stored at low temperature. And with the dose increasing,the lifespan of platelets wes prolonged obviously till the dose was more than 50mgml-1. Conclusion Trehalose, protecting platelets, can prolong the lifespan of liquid platelets stored at low temperature. Key words,trehalose; platelet; liquid;storage; 4?; 51Cr 海藻糖对液态低温保存血小板保护作用的实验研究在对大量失血和化 疗、放疗等处理造成血小板减少患者的 治疗 过程中,需要进行血小板输注。血 小板在储存过程中存在的一些不足,使之不能适应临床需求,如,22 ?常温振 荡储存易使血小板遭受细菌污染,污染几率是低温储存的50倍,输入体内后可 word格式论文 能会造成机体脓毒性败血症,并且储存时间短于5d,深低温可长期大量储存血小板,并能够进行远距离运输,有效利用全血中的血小板成分,但血小板深低温储存时所用的保护剂二甲基亚砜,DMSO,对患者有毒副作用,在洗涤去除DMSO的过程中,血小板易被激活、损伤而丧失其临床 应用 价值 ,1,。 近年来,血小板液态低温保存倍受关注。随着对液态低温下血小板诱导活化及在体内清除机制研究的不断深入,血小板保存技术取得了突破性的进展。液态低温可使血小板被激活、损伤,寿命缩短。海藻糖,trehalose,是一种非还原性双糖,能抑制寒冷所致的血小板膜侧向分离和血小板聚集,1,,阻止血小板活化、损伤,是很有潜力的血小板低温保护剂。本实验采用同位素51Cr示踪技术对海藻糖是否可延长4?液态储存中血小板的寿命进行探索。 1 材料和方法 1.1 主要材料 海藻糖,C12H22O112H2O,相对分子质量378.33,上海恒信化学试剂有限公司,原上海试剂二厂,生产,ACD抗凝剂,型号DIN00788139,美国 word格式论文 Baxter Fenwal公司生产,GC911γ放射免疫计数器,科大创新股份有限公司中佳分公司生产。2.0,2.5kg健康雄性新西兰大白兔21只,9,12月龄,由东南大学医学院实验动物中心提供。 1.2 方法 1.2.1 制备浓缩血小板,CP, 每只兔取10ml心脏血,与1.5ml ACD抗凝剂混匀, 1000 rmin-1离心10min,取上层血浆至另一离心管中,再以3000 rmin-1离心20min,22?,,之后将上层血浆移至另一试管中备用,下层血小板中加备用自体血浆1ml,使血小板悬浮。 1.2.2 储存CP 第1组,常温对照组,,将以上制备的CP置于22?水浴锅中温浴24h,第2组,低温对照组,,将以上制备的CP置于4?冰箱储存24h,第3,8组, word格式论文 CP中依次加入浓度为20、30、40、50、60及70mgml-1的海藻糖1ml,混匀,37?水浴锅中温浴后于4 ?冰箱储存24h。 1.2.3 标记血小板 取出储存的CP,于室温,22?,下以3000rmin-1离心20min,弃上清,加生理盐水1ml,使血小板悬浮,然后加入1.11MBq Na251CrO4,37?水浴锅中温浴45min,其间振荡数次,之后再以3000rmin-1离心20min,弃上清,加备用自体血浆1ml,使血小板悬浮,2,。 1.2.4 血小板回输 将以上标记好的1ml血小板通过兔耳缘静脉自体回输入兔体内,于回输后1、24、48、72h抽取1ml兔耳动脉血,测定放射性计数率,并以1h时血液的放射性计数率作为100%, 计算 24、48、72h血小板存活率。 word格式论文 1.2.5 Na251CrO4放射性计数率与标准活度换算 根据公式A=lg,1,lgC-b,,将测量所得的动物器官组织样本的γ计数率值换算成动物器官组织样本的放射性摄取,ID%g-1,。 1.3 统计学处理 所得数据以?s示,采用t检验进行统计 分析 。 2 结果 4?储存的低温对照组血小板各时间段的存活率非常低,24h存活率只有(6.38?2.88)%, 72h时只有,3.86?1.06,%,说明4?储存的血小板输入体内后寿命很短。加入不同浓度海藻糖4? 24h储存各组,第3,8组,各时间段血小板存活率明显高于4?储存的低温对照组,P,0.05,,并且随着海藻糖浓度的增加,各时间段存活率也增加,当浓度达到50mgml -1时,24、48及72h存活率分别达到,59.16?2.05,%、,51.95?2.81,%及,40.44?2.43,%,并且超过此浓度,各时间段存活率不再增加,即50mgml-1海藻糖组与60、70mgml -1 word格式论文 海藻糖组无明显差异。见表1。 表1 不同储存条件下血小板的存活率,略, 3 讨论 研究 表明,低温下血小板的生 理学 性质及形态会发生改变,使其被活化、损伤,寿命缩短,1,3,。当它们置于低温下时,形态会从正常的铁饼状变成圆球状,周边形成许多伪足,同时伴有血小板胞浆内的钙离子明显增加,微管解聚,肌动蛋白增加5倍以上。此外,血小板4?低温保存24h以上会出现а颗粒的聚集和释放,类似于血小板正常生理激活过程,之后血小板几乎失去活性。胞浆内钙离子的迅速增加及骨架肌动蛋白的集结装配,不仅使血小板形态发生异常改变,还可以使其膜发生脂相转移,导致侧向分离,使细胞膜通透性增加,一些离子通过离子通道不受控制而进入细胞内,最终结果是出现蛋白变性和水肿、自由基过度产生、细胞骨架改变等现象,使血小板容易被激活。膜侧向分离可形成许多小的集团,这些集团由一些排列整齐的膜蛋白组成。研究者将这些小的集团分离出来后,发现其中包含有血小板凝血酶蛋白受体CD36及非受体类酪氨酸激酶类src、lyn及fyn,表明这些集团在细胞信号通路中起着一定作用,并且通常是使血小板激活的信号通路,在没有凝血酶存在的情况下可使血小板发生异常激活 word格式论文 ,4,。 海藻糖是一种天然存在的非还原性双糖,无论是内源性还是外源性,对生物体和生物大分子都具有良好的非特异性保护作用,还能够有效抑制寒冷所致的血小板膜侧向分离和血小板聚集,1,,因此,近年来倍受人们关注,成为一种很有潜力的血小板低温保护剂。以往海藻糖都是作为血小板冷冻干燥保存保护剂,并且显示出良好的 应用 前景。但是,冷冻干燥保存再水化过程容易使血小板形态结构、表面糖蛋白发生改变,不可避免地发生血小板的激活、损伤。因此,近年来许多研究者对液态保存血小板进行新的尝试,如在4?液态保存血小板中加入抑制细胞骨架肌动蛋白、第二信使抑制剂、海藻糖和抗冻蛋白等,防止血小板受到激活而损伤,5,。本实验即对液态低温血小板中加入海藻糖进行研究,结果发现,血小板加海藻糖4? 24h储存各组各时间段血小板存活率明显高于4?储存组,P,0.05,,说明海藻糖可有效延长液态低温储存后血小板在体内的寿命。其原因在于海藻糖可防止蛋白质变性,抑制低温下血小板膜侧向分离及损伤。海藻糖与葡萄糖及蔗糖一样,其羟基也能代替水分子同蛋白质分子表面部分结合,对蛋白质形成保护,同时海藻糖的分子较小,易于以分子形式填充到蛋白质分子的空隙中,有效限制蛋白质分子内部的结构发生变化,从而避免蛋白质变性失活,6,。低温下,海藻糖可作为一种水分替代分子,避免血小板生物膜发生固相液相转变、侧向分离,防止血小板活化而寿命缩短,7,。此外,本实验结果显示,加入不同浓度海藻糖低温储存各组血小板寿命虽均低于常温对照组,但常温下血小板容易受细菌污染,储存时间短于5d,而海藻糖对血小板有良好保护作用的同时,还 word格式论文 能使血小板长时间储存,可满足临床上对血小板的大量需求。 总之,海藻糖对液态低温下血小板的寿命有较明显的延长作用,因此, 海藻糖在血小板液态低温储存中具有一定的应用前景。相信本实验将为血小板储 存技术的 发展 及其适应临床需求提供依据。 , 参考 文献 , ,1,TABLIN F, WOLKERS W F, WALKER N J, et al. Membrane reorganization during chilling: implications for longterm stabilization of platelets ,J,. Cyobiology, 2001, 43(2): 114123. ,2,李家增,王鸿利,韩忠朝.血液实验学,M,.上海,上海 科学 技 术出版社,1997,304. ,3,GOUSSET K, TSVETCOVA N M, CROWE J H, et al. Selective partitioning of receptors and signaling molecules in raft membrane domains of word格式论文 human platelets,J,. Mol Biol Cell, 2001,12(2): 332333. ,4,GOUSSET K, WOLKERS W F, TSVETCOVA N M, et al. Evidence for a physiological role of membrane rafts in human platelets ,J,. J Cell Physiol, 2002, 190(1):117128. ,5,周俊,刘景汉.血小板冻干保存的研究进展,J,. 中国 实验血液 学杂志,2004,12,4,,542545. ,6,周俊,刘景汉,欧阳锡林,等.血小板胞内海藻糖测定 方法 的建 立和评价,J,.中国实验血液学杂志,2004,12,6,,837840. ,7,周俊,刘景汉,欧阳锡林,等.人血小板冻干前负载海藻糖技术研究 ,J,.中国技师杂志,2004,6,12,,15891591. word格式论文