[doc] 高糖对THP-1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4表达的影响.doc

[doc] 高糖对THP-1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4达的影响.doc 高糖对THP-1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4表达的影响 ? 852? [文章编号]1000—4718(2008)05—0852—04 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology2008,24(5):852—855 高糖对THP一1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子 相关凋亡诱导配体受体4表达的影响木 梁文昌,李连喜,杨志红,张烁,何敏,金惠铭,胡仁明 (复旦大学附属华山医院内分泌科,复旦大学内分泌糖尿病研究所,上海200040; 复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032) 【摘要]目的:探讨高糖对单核/巨噬细胞系THP一1细胞及人主动脉平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡 诱导配体受体4(TRAIL—R4)表达的影响.方法:用PMA孵育THP,1细胞,诱导其分化成为巨噬细胞.流式细 胞仪检测成功诱导的巨噬细胞粘附分子CD11b及CD1lc.采用不同糖浓度干预THP一1细胞,用Westernblotting 技术检测TRAIL—R4的表达.用25mmol/L高糖培养液在不同时点 孵育人主动脉平滑肌细胞,观察TRAIL—R4 蛋白表达的变化.用PKC激动剂干预THP一1细胞后,用 Westernblotting技术检测TRAIL—R4的表达.结果:佛 波酯(PMA)孵育THP一1细胞48h可诱导其分化成为巨噬细 胞.20mmol/L高糖明显上调人THP一1细胞TRAIL — R4的表达.高糖对人主动脉平滑肌细胞TRAIL—R4表达上调的影 响随着刺激时间的增加而增加.PKC激活后 THP一1细胞TRAIL—R4的表达明显上调.结论:高糖上调 TRAIL—R4蛋白表达,TRAIL—R4通过抑制巨噬细胞 及平滑肌细胞的凋亡促进动脉粥样硬化. [关键词]受体,肿瘤坏死因子;巨噬细胞;肌,平滑,血管 【中图分类号】11363【文献标识码]A Highglucoseup--regulatesTRAIL--R4expressioninTHP--1cellsand smoothmusclecells LEONGMan—cheong.,LILian—X1 一,YANGZhi—hong.,ZHANGShuo.,HEMin.,JIN Hui—ming2. HURen一.ming. (DepartmentofEndocrinology,HuashanHospital,InstituteofEndocrinolog yandDiabetologyFudanUniversity,Shanghai 2O0O4O,China;DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,Shanghai MedicalCollegeofFudanUniversity,Shanghai 200032,China.E—mail:renminghu@fudan.edu.ca) [ABSTRACT]AIM:ToevaluatetheexpressionofTNF—relatedapoptosisi nducingligandreceptor4(TRAIL— R4)ofTHP一 1cellsandhumanaortaSmoothmusclecellsunderhighglucoseintervention.METHODS:Monoeyticcell lineTHP一 1wasincubatedwithPMAtoinducetomaturemacrophage,AdhesionmoleculesCD11bandCD1lcwereas- sessedbyFACS.TRAIL—R4levelsinTHP一 1cellstreatedwithdifferentglucoseconcentrationsweredeterminedby Westernblotting.ThechangesofTRAIL—R4proteinexpressionswereobse rvedatdifferenttimepointsinhumanaorta smoothmusclecells.WesternblottingwasemployedtoevaluateTRAIL—R 4levelsaftertheinterventionofPKCactivator. RESULTS:Incubationwith160nmol/LPMAinducedmaturemacrophages.TRAIL—R4expressionwasup—regulated afterincubationwith20mmol/Lglucoseinmacrophages.TRAIL—R4Wase levatedinatimecoursemannerunderhigh 出岛 selevelinhumanaortasmoothmusclecells.Moreover,activationofPKCinduc edTRAIL—R4expressions.CON- CLUSION:Up—regulatedTRAIL—R4proteinlevelsinducedbyhighglucoselevelsmightinhibitapoptosisofmonocytes andsmoothmusclecellsandcontributetotheprogressionofatherosclerosis. [KEYw0RDS]Receptors,tumournecrosisfactor;Macrophages;Muscle,s mooth,vascular 糖尿病及其慢性并发症是常见的代谢性疾病之 一 ,糖尿病大血管及微血管病变是糖尿病患者致死, 致残的主要原因,而高糖高脂是导致糖尿病血管病 变的主要因素.糖尿病患者的高血糖,高血脂可 导致内皮细胞损伤,单核细胞粘附,迁移,移行进入 血管壁并分化成为巨噬细胞.巨噬细胞一方面吞噬 脂质转变成泡沫细胞,同时表达,分泌多种细胞因 子.这些细胞因子一方面加剧了血管壁的慢性炎症 【收稿日期]2008—01—29【修回日期]2008—04—17 ?【基金项目]国家863重大课资助项目(No.2002BA711A05);上海 市科学技术委员会重大课题资助项目(No.04dz19504) ?通讯作者Tel:021—62481305;E—mail:renminghu@fudan.edu.cn , 反应,同时也进一步加重了内皮细胞损伤,并促进血 管平滑肌细胞增殖及分泌细胞因子.血管平滑肌细 胞亦可吞噬脂质而转变成泡沫细胞,后者是糖尿病 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的病理基础]. 最近的研究显示,肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导 配体(TNF—relatedapoptosisinducingligand.TRAIL) 在血管生理及动脉粥样硬化的病理过程中发挥重要 作用.而TRAIL—R4是肿瘤坏死因子受体超家族 中的一员,它能够与TRAIL相互作用广泛调控细胞 凋亡,并可作为诱导受体中和TRAIL的生物学作 用J.本研究观察高糖对单核/巨噬细胞系THP一1 细胞和平滑肌细胞TRAIL—R4表达的影响,以更好 的了解糖尿病患者发生动脉粥样硬化的病理生理机 制. 材料和方法 1材料 THP一1细胞由中国科学院上海细胞生物学研 究所细胞库提供;人主动脉平滑肌细胞和231培养 液购自CascadeBiologics公司;RPMI一1640培养基, 购自Gibcol公司;胎牛血清(fetalbovineserllm,FBS) 购自Hyclone公司;牛血清白蛋白(BSA),佛波酯 (phorbolmyristateacetate,PMA)为Sigma公司产品. CD1lb及CD11C购自上海晶美公司. 2方法 2.1细胞培养THP一1细胞培养用含有10%小 牛血清的RPMI一1640培养液,37.c,5%CO培养箱 中静置培养,培养液中加Hepes10mmoL/L和青霉 素,链霉素为1×10U/L,在每次实验前用160 nmol/LPMA孵育THP一1细胞48h,诱导其分化成巨 噬细胞.人主动脉平滑肌细胞用含有平滑肌生长补 充剂的231培养液培养,37?,5%CO培养箱中静置 培养. 2.2流式细胞仪检测CD11b及CD11C用160 nmol/LPMA诱导THP一1细胞48h后,胰酶消化贴 壁的THP一1细胞,分别做巨噬细胞表面分子的特殊 标记CD11b或CD11C,室温避光孵育30min,流式细 胞仪检测表达量. 2.3蛋白印迹验证TRAIL—R4的差异表达向细 胞内加入RIPA200L和PMSF2L,融化后吸人离 心管中.12000r/min4.c离心30min,吸取上清 液.分光光度计Bradford法进行蛋白定量,一2O? 保存.每次实验各取样品5Og蛋白进行12%SDS — PAGE电泳,100V30min;150V90min.转膜, 100V2h.5%脱脂奶粉封闭1h.TBST液10min ×3次洗膜.取兔抗人TRAIL—R4抗体(1:1500, Calbiochem)或B—actin抗体(1:5000,SantaCruz) 与膜进行杂交,室温2h.TBST液洗膜10min×3 次.取辣根过氧化物酶(HRP)标记?抗(1:3000, cellsignalingtechnology)与膜杂交,室温1h.TBST 液洗膜,10min×3次.ECL(上海普飞)显色5min. 然后依次进行曝光,显影,定影.TRAIL—R4表达以 TRAIL—R4/13一actin总灰度值表示. 3统计学处理 数据用均数?差(?s)表示,采用 SPSS15.0统计学软件进行数据处理,组间比较采用 方差. 结果 1THP一1细胞培养,诱导其分化成为巨噬细胞 用含有10%小牛血清的RPMI一1640培养液培 养THP一1细胞,待细胞进入对数生长期后,用160 nmol/LPMA孵育THP一1细胞48h后,THP一1细 胞从悬浮状态诱导成贴壁状态,细胞表面粘附分子 CD11b明显低表达,CD1lc呈相对高表达(图1),符 合巨噬细胞的特点o. 2高糖对单核/巨噬细胞系THP一1细胞TRAIL— R4表达的影响 用不同糖浓度的培养液孵育THP一1细胞24h 后,抽取细胞总蛋白行Westernblotting检查可见2O mmoL/L高糖能明显上调TRAIL—R4蛋白表达(图 2). 3高糖对人主动脉平滑肌细胞TRAIL—R4表达的 影响 用25mmoL/L高糖的培养液孵育人主动脉平滑 肌细胞,Westernblotting检测发现随着刺激时间的增 加,高糖(25mmol/L)对人主动脉平滑肌细胞TRAIL — R4表达的上调作用明显增加(图3). 4PKC激动剂对THP一1细胞TRAIL—R4蛋白 表达的影响 于THP一1细胞中加入不同浓度的PKC激动剂 干预24h后,Westernblotting检验发现TRAIL—R4 表达随PKC激动剂浓度增加而增加(图4). 讨论 TRAIL—R4是第四个被确认为TRAIL的受体. 其主要功能是通过竞争TRAIL与促凋亡受体TRAIL — R1,TRAIL—R2的结合从而抑制TRAIL的促凋亡 作用.生理情况下,TRAIL与TRAIL—R1或 TRAIL—R2结合后通过后者的死亡结构域募集 caspase一8及caspase一10的前体,活化的caspase一8 进一步切割caspase一3前体,生成有活性的caspase 一 3,从而触发外源性的凋亡通路.而TRAIL与 TRAIL—R4结合后,由于TRAIL—R4不具备完整的 死亡结构域而无法转导凋亡信号,从而抑制了细胞 凋亡].TRAIL不仅有着广泛的促凋亡活性J,它 ? 854? ? C Q > In N 0 THP-1f×200) 10.1011010 CDl1b ? C U > 山 THP一1cellsstimulatedwithPMAfor48h(×200) N 0 101010 CDl1C Fig1Incubationwith160nmo~LPMAinducedmaturemacrophages,THP—lcellsbecameadherentafterinducedtomaturemacro— phagebyincubationwith160nmo~LPMAfor48h.LowexpressionofCD1lb andrelativehighexpressionofCD1lcwereob— servedinTHP一1cells.whichwasinconcordwithmaturemacrophages. 图1PMA孵育THP一1细胞48h可诱导其分化成为巨噬细胞 A TRAIL—R4 D—actin Control2Q Glucose(mmol/L) A TRA1L—R4 13-actin Controll5mmo1/L20mmol/L glucoseglucose Fig2TheexpressionofTRIAL—R4inTHP一1cellsindifief— entglucoseconcentrationsofcuhuralmedia.THP,1gj cellswereincubatedwith20mmolfLglucosefor24h. CellextractswereanalyzedforTRAIL—R4expressionby Westernblotting,”p—regulationofTRAIL—R4wasob— servedat20mmo~Lglucose.A:immunoblottingimage; B:quantificationofimmunoblottingx4-s.n=3,P< 0.055control, 图2不同糖浓度对单核/巨噬细胞系THP一1细胞TRAIL图3 一 R4表达的影响 B2?5 C ? 塞2.0 墨 1.5 .f1.0 复0.5 ._ DDc0一??Q.I?Q寸.一,, A TRAIL—R4 13-actin ControlQ!QQQ9 PMA(nmoi/L) PMA(nmoi/L) Fig4ActivationofPKCup—regulatedtheexpressionofTRAIL — R4inTHP—lceHs.THP—lcellswereincubated withdifferentconcentrationsofPKCactivator(PMA)for 24h.TRAIL—R4expressionwasassessedbyWeslem blotting.Up—regulationofTRAIL—R4wasfound.A: Westernblottingimage.B:analysisofWesternblotting from3experiments.面?s./1,:3.’P<O.05contro1. 圈4PKC激活后TRP一1细胞TRAIL—R4表达明显上调 还可以拮抗TNF—的促白细胞黏附作用,因此被 认为是抗炎因子?….研究显示TRAIL的表达与C 反应蛋白呈负相关,由于c反应蛋白与斑块的稳定 性与氧化应激密切相关,提示TRAIL有稳定斑块及 对动脉粥样硬化有保护作用.近来有研究发现1 型糖尿病患者外周血T细胞表达TRAIL—R4明显 高于对照组,由于TRAIL—R4有上述抑制细胞凋亡 的生理作用,提示TRAIL与TRAIL受体相互作用与 胰岛B细胞的凋亡有关.巨噬细胞的持续增殖 及平滑肌的增生是糖尿病大血管病变的重要病理生 理基础,本研究首次发现高糖干预情况下能上调 fnIP一1细胞及入主动脉平滑肌TRAIL—R4的表 达,且TRAIL—R4的上调随PKC激动剂浓度增加而 增强.提示THP一1细胞于高糖情况下凋亡减少,从 而间接促进增殖,加剧炎症反应的恶化.本研究显 示TRAIL—R4可能成为干预糖尿病血管并发症的 靶点之一. 高糖情况下PKC通路的激活是糖尿病最重要的 发病机制之一.PKC通路的激活不仅是糖尿病微血 管病变的主要因素,也在动脉粥样硬化中扮演重要 角色.由PKC激活介导的巨噬细胞增殖是糖尿病血 管并发症的重要病理生理过程,但其中巨噬细胞增 殖的靶点至今尚未明确?.本研究应用不同剂量 PKC受体激动剂PMA干预巨噬细胞后,发现TRAIL — R4表达上调,说明TRAIL—R4的表达受PKC调 控,由于TRAIL—R4具有抑制凋亡作用,因此提示 ? 855? 在高糖激活PKC所导致的巨噬细胞和平滑肌细胞增 殖中TRAIL—R4扮演了重要角色,高糖刺激后巨噬 细胞和平滑肌细胞TRAIL—R4表达的上调对动脉 粥样硬化的发病可能起促进作用. 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