综述动物繁殖行为与雄性激素关系研究

综述动物繁殖行为与雄性激素关系研究 激素与动物行为研究组 雄性动物的繁殖行为与雄激素关系研究 李玉欢 周津津 王思睿 张端阳 徐美瑶 郝鹏飞 马文杰 (东北林业大学野生动物资源学院 哈尔滨 150040) 摘要:本文综述了近年来雄性动物的繁殖行为与雄激素(主要是睾酮)的关系研究，主要包括季节性繁殖动物和非人灵长类，并比较了雄性激素对其繁殖行为的影响异同，本文还综述了主要研究方法的进展，即粪便取样法、从粪样中提取激素的方法改进，以及激素含量分析的放射免疫分析法和最新应用的高效液相色谱，评价了其优缺点并提出了改进的方向。研究明:雄性激素的变化与雄性繁殖行为在不同物种呈现不同程度的相关性，是其繁殖行为发生季节性变化的生理基础，但在较高等的灵长类动物中, 性激素对其性行为的这种控制作用已大大削弱乃至消除。在这些灵长类动物中, 性激素主要影响它们的交配动机, 这种交配能力与性行为动机的分离, 使动物性行为的表达受其社会经历和社群环境等社会因子的影响成为可能。现在研究技术方法已经基本成熟，有利于我们为经济动物养殖以及野生濒危物种保护打下良好基础。 关键词:繁殖行为;睾酮;粪便取样法;放射免疫分析法 Study on the relationship between male animal reproductive behavior and androgen Li Yuhuan Zhou Jinjin Wang Sirui Zhang Duanyang Xu Meiyao Hao Pengfei Ma Wenjie (College of Wildlife Resources; Northeast Forestry University, 150040, China) 1 激素与动物行为研究组 Abstract:This paper reviewed recent male reproductive behavior of animals with androgen (mainly testosterone) the relation, mainly including seasonal breeding animals and nonhuman primates, and compared the male hormone the similarities and differences between the influence of reproductive behavior, this paper has summarized the main research progress of methods, namely waste sampling method, from the dung samples of the method of extract hormone improvements, and the analysis of the hormone levels ria analysis and new application of high performance liquid chromatography (HPLC), and evaluated its advantages and disadvantages and puts forward the direction of the improvement. Research shows that: the male hormone changes with male reproductive behavior in different species present different degree of correlation, is its reproductive behavior occurrence seasonal changes of physiological basis, but in higher primates, sex hormones to its sex role has been greatly weakened the control and eliminate. In these primates, sex hormones main influence their mating motivation, and the ability of the mating sexual behavior motivation of separation, make animal behavior by the expression by society. Keywords: breeding behavior; testosterone; waste sampling; method radiation immune analysis method 2 激素与动物行为研究组 前 言 成功繁殖是动物适应环境的具体表现，也是动物维持其种群发展的重要策略。性激素和动物的繁殖有着密切关系，性激素的活动指挥着生殖系统，协调实[]1现繁殖后代的机能。雄性动物的生殖状况、发情周期与雄激素水平的变化有密切关系，雄激素中最为重要的就是由睾丸分泌的睾酮(Testosterone)，它除了促进雄性生殖道、副性腺体和第二性征的正常发育外，还对维持雄性动物的性行为有重要作用。社会地位和经历在改变睾酮对性行为或攻击行为中也有不容忽视的重[]2要影响。许多研究表明，雄性激素是调控动物繁殖行为的主要因子。近些年来，许多学者做了这方面的研究，主要研究方法是无损伤取样法，以及放射免疫分析法，研究都根据研究对象而对研究方法做了改进。近年来对于各种动物特别是特种经济养殖动物进行了很多研究，可见这也是一个相当热门的研究方向。 1 繁殖行为与雄激素关系研究简述 1.1 季节性繁殖行为与雄性激素的关系 在一些季节性繁殖的动物的相关研究中发现，睾酮与雄性的周期性繁殖行为密切相关，繁殖季节睾酮水平明显高于非繁殖季节，性行为也集中在发情期。研究表明，成年公羊睾酮水平在秋季最高，交配行为与睾酮水平相关显著(P,0.01)。驯鹿(Rangifer tarandus)和马鹿(Red Deer)睾酮分泌的季节性增加诱 [3-5]导出明显的具有发情期特点的性行为和攻击行为。李春旺等研究发现，雄性麋鹿(Elaphurus davidianus)的许多繁殖行为如嗅尿、尿喷洒、泥浴、角触地面、驱赶、约束雌、下颔压雌、爬胯和交配等的发生频次与粪样中睾酮水平都呈极显著的正相关(P<0.01)。除了卷唇、腺体标记、角斗、爬胯雄和追雌行为以外，其[]6它各行为频次都与粪样睾酮水平呈显著的正相关。雄性蒙古野驴(Equus hemionus)粪样睾酮水平季节变化显著，并且与很多繁殖行为的季节性变化显著相关，可见睾酮分泌的季节性波动是雄性蒙古野驴繁殖行为季节性变化的生理基[7]础。 李春等在1999年l2月至2000年9月，测定了成都动物园和成都大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)繁育研究基地的4只雄性小熊猫(Ailurus fulgens)粪样中睾酮水平变化情况，同时对其行为进行了观察。研究结果表明，雄性粪样中睾酮水平在繁殖期(12月,3月)显著高于非繁殖期(4月,9月)(P<0(01)，且睾酮水平变化与繁殖行为密切相关。并且未与雌性接触的雄性小熊猫的睾酮水平仍旧与其他雄性小熊猫的的睾酮水平变化基本相同，出现了繁殖期与非繁殖期的[]8变化。Hemdon等对猕猴(Macaca mulatta)的研究也说明了同样的问题，即使 [9]雄性猕猴不与雌性猕猴接触，其雄性睾酮水平也会随着季节的而波动。 圈养狼(Canis lupus lani)的许多繁殖行为在各阶段有显著差异，其变化与睾酮水平的高低变化一致。这些结果均表明雄狼的睾酮水平变化与繁殖行为的发生密切相关，但由于没有对未配对的雄狼做激素检测，尚不能说明雌性是否对雄狼的发情有促进作用。对东北虎(Panthera tigris altaica)的这方面研究则明显 3 激素与动物行为研究组 观察到雌虎可以诱导雄虎发情，其邀配行为影响了雄虎交配的频次及成功率[10-11]。 以上一系列的研究表明，生活在寒温带的动物，以有蹄类为例，为了适应环境，在外界各种资源，尤其是食物资源最丰富的时候即春夏之际产下幼仔，使幼仔在自然界中食物条件最好的时期内生长发育，而形成了一定的繁殖周期:在秋末初冬季节，光周期影响动物夜间松果腺褪黑激素(melatonin)分泌的变化，通过神经-垂体-性腺轴控制动物的繁殖期。随着性激素的不断分泌，繁殖行为开始出现(一般雄鹿繁殖行为早于雌鹿，当雌雄鹿达到同期发情后才能配种。雌鹿经过一个很长的怀孕期后产仔，雄鹿经过繁重的配种期后，则进入很长的休情期以[]12恢复体力。这种长期的适应可以理解为一种“短日照理论”，即光周期的变化使控制GTH分泌的负反馈机制的敏感性发生了变化，从长日照向短日照的转变，[]13可刺激腺垂体GTH的合成和释放，进而刺激睾丸的分泌活动和性行为。 1.2 非人灵长类的繁殖行为与雄性激素的关系 灵长类动物大多是集群生活，社会组成及社会关系必然影响性腺激素和性行为的发生。因此，以自然条件下、社会群体中灵长类动物为研究对象开展性腺激素与性行为关系研究，对进一步揭示灵长类动物性腺激素和社会因素交互作用影响性行为具有重要作用和科学意义。 社会因素(如同性和异性个体的存在)影响动物性腺分泌水平，例如在一年的大部分时间里，松鼠猴(Saimirisciureus)在形成新群后，异性个体的存在和活 动刺激了性腺的活动，从而导致性腺激素的含量达到使雌性个体进入繁殖状态的 [14-15][16]水平。睾酮水平的高低主要表现为性欲的强弱，以往的研究表明，睾酮分泌量的多少直接对雄性动物的性行为起着介导作用。有试验中观察到，阉割后[17]的雄性小鼠性欲与雄性性行为丧失，但是在较高等的灵长类动物中，性激素 [18]对其性行为的这种控制作用己大大削弱乃至消除。虽然睾酮的浓度对于性动机行为以及维持性行为能力具有重要的作用，但是一旦其睾酮分泌量超过维持繁殖所需要的睾酮浓度极限值，交配行为的表达则更多地依赖于社会因素而不是其生理特征的作用。Wallen在对日本猴的研究中发现，日本猴的睾酮分泌水平与交配行为以及接触性攻击并无显著相关性，相反，与非接触性攻击有显著的相关性[19]。在灵长类动物中，性激素主要影响它们的交配动机，这种交配能力与性动机行为的分离，使动物性行为的表达受其社会经历和社群环境等社会因子的影响成为可能，因此，非人灵长类动物个体特征也是影响睾酮分泌的重要因素，进而成为影响其繁殖行为的重要因素。对于野生雄性黄山短尾猴(Macaca speciosa subsp)性腺激素与性行为关系的研究再次证实了这一点。他们再次验证了性腺激素与性行为之间的关系是自身生理特征、环境因子和社群因素共同作用的结果。该研究首次探讨雄性黄山短尾猴性腺激素分泌特点以及性腺激素变化和性行 [20]为之间的关系，进一步验证和揭示了短尾猴全年交配的生物学基础。 2 研究方法 2.1粪样取样法 研究行为--生殖--内分泌--行为的相互关系，需要在采集行为数据的同时，需 4 激素与动物行为研究组 要采集同期大量连续的样本，早期的研究大多以血液作为样本，但在动物中进行大量连续的血液采集既不方便亦有失科学道理，尤其是对于自然野生群体基本没有科学的现实性以及可操作性。根据尿液和粪便中性腺激素浓度与血液中性腺激素浓度的正相关性，许多学者在分析动物体内性腺激素水平的研究时，用尿样或者粪样取代血样，尿液样品或者粪便样品的获得既不会因人为干扰而使自然野生动物社会活动以及社会功能受到侵扰，又免去了因为捕捉或者是化学保定而使动物产生应急反应或者是伤害的顾虑，对于自然野生群体动物来说，尿液样品的采集因为排便的随机性而十分困难，故而粪便样品为研究自然野生动物的最理想的选择。现在粪便取样法已经基本成熟,成为野生动物繁殖行为生态学中一种被广 [21]泛认可、科学实用的新方法。1957年，Hurst等关于家禽排泄物中雌二醇、孕酮和雌三醇等雌激素的研究，是这方面的先驱性工作。通过测定粪便中性腺激素来反映动物生殖状态这一方法在非人灵长类动物的繁殖生物学研究中已有较广 [21-23]泛的应用。虽然粪便取样法具有无损伤、易采集、易保存、低耗费等优点，也解决了繁殖生理学，保护遗传学和分子生态学研究中所存在的取样难题，但它还是存在一定的缺陷与不足。首先，对于自然环境下人类难以接近的物种，获得其粪便比较困难;其次，研究群体中特定个体的准确识别成为制约特定个体粪便样品的重要因素。再者，粪便存在的偶然性因素也较多，随机性较大，尤其是当 [20]采集粪便受到视线等各种物理因素的制约。如在分子生物学方面, 就存在着消化道脱落细胞少, 遗传物质存在降解的问题。在PCR 扩增过程中, 粪便中的 扩某些物质还可能影响到某些酶的活性。由于粪样中物质的复杂性, 对于PCR 增的结果分析要慎重。由于粪样不同程度的暴露在外界环境中, 外界的污染也不可避免(魏辅文等, 2001)。然而随着生物学技术的发展，这些局限性逐渐被认识和纠正，使得可靠性不断提高和适用范围不断扩大。研究粪样使野生动物许多研究领域的研究成为可能。粪样分析已成为生态学家和野生动物管理者的有用工 [24]具，今后将更加有效地应用于保护生物学及生命科学其他领域的研究。 另外值得注意的是，目前，利用无损伤取样法研究哺乳动物繁殖行为与雄激素的关系的报道有很多，但在禽类方面的较少，但这并不代表该技术在禽类中不适用，相反，该方法还存在相当大的优越性，因为在哺乳动物，其排出的类固醇化合物主要存在于尿液中，而收集又相当困难，所以只能改为搜集粪便，虽然有一定的可行性，但相比之下，禽类的粪便和尿液是混在一起的，所以在收集和测量上更具有可操作性。Bercovitz等的工作也验证了这一点，他们在鸟类方面开展的一系列工作，为将这一技术在鸟类的繁殖研究中进行应用起了重要的推动作[25-26]用。陈玉燕等在1997年就繁殖季节与非繁殖季节的绿头鸭(Anas [27]platyyhynchos)的粪便中睾酮浓度变化进行了测定。张雁云曾于2001年对笼养 [28]下黄腹角雉(Tragopancaboti)粪便中性激素的变化进行研究。近些年来，从粪尿混合物中提取固醇化合物的方法已用于对多种野生鸟类的监测研究，为这些鸟类的繁殖管理及保护起到了很好的指导作用。主要是家禽，野生鸟类较少。东北林业大学田秀华教授在近些年在这方面做了许多工作，其中对笼养丹顶鹤(Grus japonensis )的研究发现，丹顶鹤繁殖期的睾酮明显高于非繁殖期，非繁殖期雄性丹顶鹤睾酮浓度平均水平维持在(84.81士27.35)ng/dl.且丹顶鹤繁殖期和非繁 [29]殖期粪样中睾酮浓度水平存在显著差异(P=0.021<0.05)。在对笼养大鸨(Otis tarda)的研究中发现，雄性个体的游走和理羽行为发生的频次与粪便中睾酮含 [30]量显著相关(P<0.05)。其他行为与性激素含量无显著相关。 5 激素与动物行为研究组 2.2激素提取方法 关于从粪便中提取雄激素的方法，近十几年来在Wasser的方法的基础上不断被加以改进、发展、变化,没有形成一个固定的模式，而是根据不同动物的实际情况，尽量采取简便高效、切实可行的提取方法。通过检测动物粪便性激素来监控、了解动物的繁殖行为和生理机能。首先华盛顿大学的Risler等人创建了一个用于野生动物粪便荷尔蒙研究的方法并首次对豚尾猴(Macacane mestrina)的生殖激素进行了测定。该方法包括有粪便样品的混匀、过滤、提取、葡聚糖凝胶提纯等步骤。Risler用此方法提取了豚尾猴的粪便生殖激素,同时采集了豚尾猴的血样,测量了血清的雌二醇(E2)和孕酮(P)，发现其数据与粪样中的雌二醇和孕酮相关性很强。 Wasser等用Risler所创建的方法对旧大陆猴的粪便荷尔蒙进行了研究,他发现尿液被污染和粪便贮藏时间过长都会影响类固醇激素的准确性，但如加入乙醇则可消除这些影响，并且通过调节粪样中的含水量可使食物中的纤维对类固醇激素的影响减少到最低程度。后来，Wasser又再次改进了Risler的方法——使用二氯甲烷并省去了层析。Brown等人在研究猫科动物的粪便荷尔蒙时，为消除致癌剂的使用,省去了使用二氯甲烷这一步，并在其它步骤上作了一些改动，提高了雌二醇和孕酮的提取率。李春旺等在研究麋鹿粪样中性激素时，将Wasser等和陈玉燕等的方法改进后用来提取麋鹿粪样中的激素，包括雄鹿的睾酮、雌鹿的孕酮、雌二醇和雌三醇。该方法比较简便省时，仅包括混匀和提取两个步骤。1999,2000年李春、魏辅文等对李春旺等的方法进行了进一步的改进,只使用甲醇和石油醚两种有机溶剂提取小熊猫粪便中的睾酮、孕酮和雌二醇。这种方法将各种性激素的提取步骤统一起来,使实验更加省时简便，同时也避免了强致癌物质二氯甲烷的使用。此外,Wasser的方法还被加以不同的改进,用于提取其它动物的粪便 [7]类固醇激素。 2.3 粪便中激素含量分析方法 分析粪便中激素的含量，一般采用放射免疫分析法(RIA).该方法具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质。应用范围广，据不完全统计，目前至少已有300多种生物活性物质已建立了RIA。它几乎能应用于所有激素的分析，当然也包括雄激素。但是该方法也存在一定的问题，如其灵敏度受方法本身工作原理的限制，对体内某些含量特别低的物质尚不能测定。且由于放射免疫分析是竞争性的反应，被测物和物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量。还有一些研究表明利用皮质醇或皮质酮的特殊抗体产生的结果可能和实际含量不一致.最重要的是，该方法不能在一个样本中同时检测到所有的类固醇代谢物(例如，皮质醇、皮质酮和睾酮或雌二醇)。在近几年，利用化学衍生技术来检测自然界中痕量物质逐渐发展起来。利用高效液相色谱[23](HPLC)可以用一个提取物来测量粪便中所有的激素。在对圈养狼的繁殖行为与性激素关系的研究中采用了该方法，弥补了RIA的缺陷，取得了不错的效果， [10]在今后的研究中值得借鉴。 将来，我们可以将已成型的方法加以改进以适合其他物种，尤其是特种经济动物以及濒危动物的繁殖生理的研究。 6 激素与动物行为研究组 参考文献 [1] 王建辰,章孝荣.动物生殖调控[M].合肥:安徽科学技术出版社,1998. [2] R.M.Rose,杜坤大.雄性激素与行为[J].心理科学进展, 1983,3(03):521. [3] Borg K E,Esbenshade K L,Johnson B H, Lunstra D D, Ford J J. Effects of sexual experience,season and mating stimuli on endocrine concentrations in adult ram [J].Hormones andBehavior1992,26:87-109. ， [4] Lasley B L,Kirkpatrick J F.Monitoring ovarian function in captive and free-ranging wildlife by Means of urinary and fecal steroids [J]. Zoo Wild Med,1991,22:23-31. [5] 贾志云,段恩奎,蒋志刚,王祖望,笼养雌性果子狸的同性数量影响发情状态兼论繁殖期尿 液雌二醇浓度的变化[J].动物学报,2002,48(5):618-624. [6] 李春旺,蒋志刚,房继明等.麇鹿繁殖行为和粪样激素水平变化的关系[J].兽类学 报,2000,20(2):88-99. [7] 丁英.蒙古野驴(Equus hemionus hemious)的行为、粪样激素水平及两者相关性研究[D]. 内蒙古师范大学,2007. [8] 李春,魏辅文,李明等.雄性小熊猫粪便中睾酮水平的变化与繁殖周期的关系[J].兽类学 报,2003,23:115-119. [9] Hemdon J G， Mindi L B,Nordmeyer D L,Turner J J.Seasonal testicular function in male rhesus monkeys J[J].Hormones and Behavior,1996,30:266-271. [10] 孔繁繁.圈养狼(Canis lupus)的繁殖行为与性激素关系的研究[D].曲阜师范大学,2007. [11] 乔征磊.半散养东北虎(Panthera tigris altaica)发情交配行为与粪样性激素水平变化的 关系[D].曲阜师范大学，2008. [12] Larissa C,Tim H,Clutton B.Sex differences in weather sensitivity can cause habitat Segregation:red deer as an example[J].Animal Behavior,2000,59(5):1049-1060. [13] 郑亦辉主编.动物激素及其应用[M].南京:江苏科学技术出版社,1996. [14] Mendoza S,Mason W.Behavioral and endocrine consequences of heterosexual Pair formation in squirrel monkeys[J]. Physiology and behavior,1989,46:597-603. [15] Mendoza S, Mason W.Breeding readiness in squirrel monkeys:Female rimed female are triggered by males[J].Physiology and behavior,1991,49:471-479. [16] 李江源,朱积川.睾酮补充治疗中老年男子部分雄激素缺乏(PADAM)的初步研究[J].老年 医学与保健,2001,7(4):209-211. [17] Beaeh FA,Levinson G.Effects of androgen on the glans Penis and mating behavior of castrated male rats[J].Journal of Experimental Zoology,1950,114:159-168. [18] Clancy AN,Zumpe D,Michael RP.Intracerebral infusion of an aromatase inhibitor,sexual Behavior and brain estrogen receptor-like immunoreactivity in intact male rats[J].Neuroendocrinology,1995,61:98-111. [19] Bercovitch FB.The physiology of male reproductive[M].Mayfield Mountain View， California,1999. [20] 夏东坡.野生雄性黄山短尾猴性腺激素与性行为关系研究[D]. 安徽大学,2007. [21] Hurst O,Kuksis A,Bendell F.The separation of estrogens from avian droppings.Can J Bichem Physiol,1959,35:637. [22] Risler L.Warsser SK.Saekett GP.Measurement of excreted steroids in Macaca nemestrina-American Journal of primatology,1987,12:91-100. [23] Perez L.Czekala NM.Wienseel A,et al.Excreted steroids in Macaca nemestrina-American 7 激素与动物行为研究组 Journal of primatology,1987,12:91-100. [24] 刘丙万,蒋志刚.粪样在野生动物研究中的作用[J].动物学研究,2002,23(1):71-76. [25] Jinmao Y, Haifeng Z, Yunwei S,et al.2005.Talanta.66,982-992. [26] Bercovitz AB,Collins J,Price P,et al.Non-invasive assessment of seasonal hormone profile in captive bald eagles[J]Zoo biology,1982,1:111. [27] 陈玉燕,吴丙新,赵明杰.睾固酮激素免疫分析法至建立与应用[J].台北动物园学 报,1997,9:1-16. [28] 张雁云,郑光美,汪欢等.笼养下黄腹角锥(Tragopancaboti)粪便中性激素的变化研究.北京 师范大学学报(自然科学版),2001,37(5):685-689. [29] 张冬冬.笼养丹顶鹤繁殖期行为与粪便中类固醇激素变化的研究[D].东北林业大 学,2007. [30] 卢小琴.笼养大鸨繁殖期行为与粪便中性激素水平的研究[D].东北林业大学,2007. 8