[doc] cpcHID操纵子序列用于钝顶节旋藻品系分类与鉴定的研究

[doc] cpcHID操纵子序列用于钝顶节旋藻品系分类与鉴定的研究 cpcHID操纵子序列用于钝顶节旋藻品系分 类与鉴定的研究 46卷6期 20O6年12月4日 微生物 ActaMicrobiologicaSinica 46(6):1003,1006 4December20o6 cpeHID操纵子序列用于钝顶节旋藻品系分类与鉴定的研究 杨灵勇,汪志平,曹学成,陈晓燕,徐步进 (浙江大学原子核农业科学研究所杭州310029) 摘要:克隆并测定7株钝顶节旋藻品系的cpcHID操纵子序列,以及16SrRNA和16S-23SrRNA转录单元内间隔区 (ITS)序列,进一步通过生物信息学和分子系统学等研究发现:(1)7株品系的cpeHID序列,以及16SrRNA和ITS序 列具有很高的相似性.(2)基于7株品系epcHID序列的GC含量绝对偏差平均值,碱基变异率和遗传距离系数普 遍比基于16SrRNA和ITS序列的大.(3)基于cpcHID序列的分类结果与基于16SrRNA和ITS序列的十分相近. 因此,cpcHID可作为节旋藻等蓝细菌分类与鉴定的一种新的分子标 记,特别是以其丰富的信息量而在品系水平的 分类鉴定中占有优势. 关键词:节旋藻;cpcHID操纵子;16SrRNA;16S.23SrRNAITS;分类 中图分类号:Q93文献标识码:A文章编号:0001—6209《2006)06—1003.04 节旋藻(Arthrospira)和螺旋藻(Spirulina)均为光合放氧, 无异形胞,不分枝,呈螺旋形的原核丝状蓝细菌 (cyanobaeteria)’.多年来,该类群的属种划分,鉴定及命 名,主要以其形态学特征为依据.但由于形态学分类的 优先权不统一,以及藻丝形态随生长环境变化而呈现多形性 变异(Polymorphism)等原因,致使节旋藻与螺旋藻在属水平, 以及属内种或品系水平上的分类与命名长期存在争议”]. 这种混乱状况不仅影响着该类群的理论研究与学术交流,而 且严重制约着国内外节旋藻产业(因历史原因商业界仍习惯 称为”螺旋藻产业”)的进一步发展”‘.因此,迫切需要寻 求并建立能准确反映物种之间自然的系统发生关系,有效区 分该类群属,种,品系水平的标记. 国内外已从脂肪酸,蛋白质的组成及含量等生理生化水 平对该类群的分类与鉴定作了一些有意义的探索.].特 别是利用RAPD,以及有”生物进化分子钟”之称的16SrRNA 基因序列分析等分子生物学技术,在该类群分类与鉴定方面 取得了研究成果’’”,为修正以形态特征为主的传统分 类体系,建立该类群以形态和生理生化特征为基础,以分子 遗传标记为依据的新的分类体系,提供了必要的理论依据与 技术方法.值得指出的是,近年来人们利用蓝细菌等少数藻 类所特有的捕光色素蛋白——藻胆蛋白亚基的基因(如 cpcB,cp04,cpcB-cpcA间隔区)序列,对节旋藻等藻类所作的 分类学研究所取得的结果不仅与基于16SrRNA序列的分类 结果相吻合,而且所取得的分类信息比16SrRNA基因序列 的更为丰富.在藻胆蛋白分子中除亚基外,还有3种起 连接作用的棒状连接多肽,所对应的3个基因cpcH,cpcl和 cpcD组成一个操纵子cpcHID13],它们和藻胆蛋白亚基的 基因均由一个被称为”TEA”的祖先基因演化而来’].基 于cpcHID与藻胆蛋白亚基基因在系统演化方面的同源关 系,本文探索了利用cpcHID操纵子基因序列对钝顶节旋藻进 行品系间分类与鉴定的可行性,以期为节旋藻和螺旋藻等蓝 细菌的分类,鉴定与命名提供信息量更丰富的新的分子标记. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1实验材料:所选的7株钝顶节旋藻品系中,Sp一1由中 国农业大学毛炎麟先生馈赠;Sp一2由中国科学院植物研究所 顾天青先生馈赠;Sp一3,Sp-5,Sp一9和Sp-10为中国南方规模养 殖品系;Sp一11为中国北方规模养殖品系.上述藻株均经单 细胞分离培养而得到,现保存于本所生物资源与分子工程实 验室.参照李晋楠等的方法进行培养及显微形态观察. 1.1.2试剂和仪器:TaqDNA聚合酶和琼脂糖为Sangon公 司产品;克隆载体pMD18一T,以及dNTP,DNA限制性内切酶, T4DNA连接酶均为TaKaRa公司产品;DNA凝胶回收试剂盒 购于上海博亚公司;PCR引物由上海博亚公司合成.其它试 剂均为分析纯.序列扩增用HybmdLimited公司的HBPXB6 BThermalCyclerPCR仪,测序用AppliedBiosystems公司的 3730型测序仪. 1.2PCR引物与扩增 根据GenBank上的cpcHID操纵子序列(AF164139),利用 Primer5.0引物设计软件得到上游引物PF:5 CAATACATCTrcGCCGAT不3,下游弓I物PR:5’-CGTATrATC 基金项目:国家自然科学基金(30000010) 通讯作者.Tel/Fax:86-571—86971021;E-mail:zllpwaIlg@zju.edu.cn 作者简介:杨灵勇(1982一),男,浙江人,硕士研究生,研究方向为海洋生物技术.E-marl:akuyly@126~corn 其他作者:李雪斌,黄晖 收稿日期:2006-01—06;接受日期:2006-03—17:修回日期:2006—05—27 1OO4YANGLing-yongeta1./ActaMicrobiologicaSinica(2006)46(6) GGTAGrI?ATcGG3,.25LPCR反应体系中含引物PF和PR 各0.5/.tmol/L,4种dNTP各1~mol/L,2.5u的TaqDNA聚合 酶,1O倍的PCR缓冲液2.5,5Ong基因组DNA(按照文献 [6]的方法提取).反应程序:94?5min;94~C30s,58~C1min, 72oC2min,30个循环;72oC8min. 扩增16SrRNA基因及16S-23SrRNA转录单元内间隔区 (IntemallyTranscribedSpacer,rPs)的引物参照Willmotte等j 所设计的引物1(5’-AGAGT兀’GATccTcA3)和引物18 (5’-1,兀GGccGcrI?GccTAGGTATCC.3).反应体系 除所用引物不同外,其它与cpcHID的扩增体系相同.反应 程序:94?5min;94oC30s,55?1.5min,72oC3min,30个循环; 72?8min. 1.3PCR产物的克隆及测序 将经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化的PCR产物连接到 pMD18一T载体上,转化感受态E.coliTG1,蓝白斑法筛选阳 性克隆,提取质粒并作酶切鉴定,将含有目的片段的重组质 粒进行测序. 1.4序列分析,系统进化树构建 序列分析采用BioEdit7.0软件,多重序列比对采用 C1ustalX1.81软件,遗传距离分析及系统发生树的构建采用 Phylip3.65软件包. 2结果和讨论 2.1扩增序列的基本结构及GC含量比较 藻株Sp-10,Sp-2,Sp-9,Sp-1,Sp-11,Sp-3和Sp-5的基因组 DNA分别经cpcH1D操纵子,以及16SrRNA与ITS的特定引 物PCR扩增与克隆,并测得相应的序列.各藻株cpcHID序 列在GenBank上的注册号依次为DQ279774,DQ279775, DQ279776,DQ279777,DQ279778,DQ279779,DQ279780,16S rRNA和ITS序列在GenBank上的注册号依次为DQ279767, DQ279768DQ279769,DQ279770,DQ279771,DQ279772, DQ279773. 17株品系序列的碱基数与GC含量 Tab】el1ThenumberofbaseandGCcontentinsevenstraim 通过序列比对和分析发现,所扩增的cpcHID序列的长 度均为1492bp,包含cpcH基因的部分序列,cpcl和cpcD基因 的全部序列,以及2个基因间隔区(IGS1,IGS2),其排列方式 为cpcH—IGS1一cpcI.IGS2一cpcD;16SrRNA和ITS序列的长度为 1957bp一1961bp,包含几乎全长的16SrRNA基因和完整的 ITS区(含tRNAl和tRNA两个tRNA基因),其排列方式为 16SrRNA.ITS1.tRNAn~.tRNA.ITS2.同时,节旋藻属和螺旋 藻属ITS序列的排列方式一般不同,前者即为上述所测的7 株品系的排列方式,后者的排列方式则为16SrRNA.ITS1. tRNATM.ITS2… ,这进一步表明本文所用的7株品系确均为节 旋藻. GC含量分析(表1)显示,7株品系cpcHID序列的GC含 量为47.65mo1%,48.12mo1%,16SrRNA和ITS序列的GC含 量为53.75mo1%,53.88mo1%;前者的绝对偏差平均值为 0.1877,显着大于后者的0.0261.这表明节旋藻cpcHID在进 化过程中的变异程度可能比16SrRNA和ITS的更高,也许可 作为藻株间分类与鉴定的一种新的分子标记. 2.2基于Cl~el/ID,16SrRNA及ITS的差异位点数比较 运用BioEdit7.0软件分别对7株节旋藻品系的cpcHID, 16SrRNA,ITS作序列对齐分析,统计得到藻株间碱基的差异 位点数.由表2可知,基于cpcHID,除s0-1和Sp-2之间无差 异位点外,其余两两藻株间的差异位点数为1,63;基于16S rRNA,Sp-1和Sp-2之间也无差异位点,其余两两藻株间的差 异位点数为1,12;基于ITS,Sp-1,Sp-2,Sp-9,Sp-10两两之 间,以及Sp-3和Sp-5之间无差异位点,其余两两藻株间的差 异位点数为1,46;若同时基于16SrRNA和ITS,除Sp-1和 sw2之间无差异位点外,其余两两藻株间的差异位点数为1 , 56. 上述结果显示,节旋藻品系之间,16SrRNA序列的差异 性虽较为普遍,但差异位点数较少,7株品系共有16个差异 位点;而ITS的差异性虽较小,但差异位点数则较多,7株品 系共有46个差异位点.根据16SrRNA序列和ITS在差异性 及差异位点数方面的这一互补特性,作者在计算遗传距离和 构建系统发生树时,将16SrRNA基因序列和ITS综合起来进 行统计,以便为钝顶节旋藻品系间的分类鉴定提供足够的信 息.但即便如此,7株品系间16SrRNA序列和ITS的总差异 位点数也只有62,变异率为3.2%,而7株品系间cpcHID序 列的差异性不仅普遍,而且总差异位点数达72,变异率为 4.8%.因此,从序列的差异位点看,cpcHID序列具备用作节 旋藻分类与鉴定的优势. 2.3基于Cl~eHID及16SrRNA和ITS的遗传距离矩阵与系 统发生树比较 将所测得7株钝顶节旋藻品系的cpcHID序列,以及 16SrRNA和ITS序列分别进行多重序列比对,并将比对结果 导入Phylip3.65软件包的dnadist程序.采用F84模型计算遗 传距离(表2).同时,采用极大似然法(Phylip3.65软件包的 dnaml程序)构建7株品系的系统发生树(图1),并利用 bootstrap进行置信度检验,自举次数为100. 杨灵勇等:epcHID操纵子序列用于钝顶节旋藻品系分类与鉴定的研究.,微生物(2oo6)46(6)1005 Belowthediagonal,thefiguresoutsidebracketswerethenumberofdifferents itesbasedonmultiplepair-wlsecomparisonofcpcHID , andthefiguresinside bracketswerethenumberofdifferentsitesbasedonmultiplepair-wisecomparisonof16SrRNAandITSregion,respectively.Abovethediagonal,thefigures outsidebracketswerethegeneticdistancecoefficientsbasedoncpcHID,andthefiguresinsidebracketswerethegeneticdistancecoefficientsbasedon16SrRNA andITSregion. Sp-116SrRNA和ITS的大.这一结果与前面GC含量,差异位点 数的分析结果相吻合.同时,基于cpcHID所构建的系统发 Sp-2生树与基于16SrRNA和ITS的非常相似,只是bootstrap值略 有不同.7株品系可分为3大类:Sp-11单独为一类;Sp-3和 Sp-5为一类;Sp-1,Sp-2,Sp-9和Sp-10为一类.其中,后两类 的bootstrap值均为100%.在最后一类中,Sp.1和Sp-2先聚 类后与Sp-10聚成一组,再与Sp-9聚类.上述结果与李晋楠 等利用RAPD分子标记所得的分类结果十分相近. 16SrRNA基因是存在于所有生物中的一类古老,功能相 同,既含保守区又含可变区的序列,其序列变化与进化距离 相适应,被称为进化分子钟.16SrRNA和ITS作为一种进化 的分子标记,已被广泛用于细菌等生物(包括蓝细菌)的系统 学研究..J.节旋藻和螺旋藻等蓝细菌是地球最早出现 的光合生物之一,距今已有35亿年的历史.].通过上述 对7株钝顶节旋藻品系的cpcHID序列,以及16SrRNA和ITS 序列的GC含量,差异位点数,遗传距离矩阵和系统发生树 等比较表明,cpcHID作为蓝细菌中的古老序列之一,其进化 趋势与16SrRNA和ITS的相适应,可作为节旋藻分类与鉴定 的一种新的分子标记,并且以其丰富的遗传差异信息而在种 s._2内品系问的分类与鉴定中更具优势. 值得注意的是,波浪形的Sp.1和螺旋形的sp一2在形态, Sp一1生理生态及分子水平均有显着差异,但无论基于cpcHID 还是16SrRNA和ITS,都不能区分这两个品系.这提示我们 在进行分类与鉴定时,有必要综合利用和考察形态学,生理 生态学,分子生物学等不同水平及多种标记. 图1采用极大似然法构建的系统发生树 Fig.1Phylogeneticdendrogramconstructedbythemaximumlikelihood method.A:BasedoncpcHID;B:Basedon16SrRNAandITSregion. Numbersatbranchpointwerebootstrapsupportvaluesobtainedfrom100 replicares. 由表2可知,除Sp-1和Sp-2间的遗传距离系数为0外, 其它品系间基于epeHID的遗传距离系数比所对应的基于 参考文献 [1]茅云翔,杨官品,张宝红,等.16SrRNA基因与16S-23SrRNA 转录单元内间隔区序列分析及其在节旋藻和螺旋藻分类鉴 定中的应用.高技术通讯,2001,6:12—18. 【2]NelissenB,WilmotteA,Neel’sJM,eta1.Phylogeneticrelationships amongfilamentoushelicalcyanoboctefia.跏ApplMicrobiol, 1994.17:206—210. l006YANGLing-yongeta1./ActaMicrobiologicaSinica(2006)46(6) [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1O] RomanoI,BellittiMR,NieolausB,eto2.Lipidprofile:auseful ehemotaxonomiemarkerforclassificationofanewcyanobaetefiumin Spirulinagenus.Phytochemistty,2000,54(3):289—294. 汪志平.蛋白质SDS--PAGE用于螺旋藻分类及突变体鉴定的 研究.浙江大学(农业与生命科学版),2000,26(6):583 —- 587. CohenZ,MargheriMC,TomaselliL.Chemotaxonomyof eyanobaeteria.Phytochemistty,1995,40(4):1155—1158. 李晋楠,汪志平.RAPD分子标记技术用于螺旋藻(Spirulina) 分类的研究.海洋与湖沼,2002,33(2):203—208. 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Therefore,itmvealedthatcpcHIDoperoncouldbeappliedasanewmolecularmarkertoclassificationandidentification ofcyanobacterium,andmoreappropriateforspeciesorstrainsdeterminationduetoitsabundantinformation. Keywords:Anhro~ira;cpcHIDoperon;16SrRNA;16S.23SrRNAITS;Classification Foundationitem:NationalNaturalScienceFound~onofChina(30000010) Correspondingauthor.Tel/Fax:86?571—86971021;E-mail:zhpwang@6u .edu.cn Otherauthors:LIXue?bin,HUANGHui Received:6January2006/Accepted:17March2006/Revised:27May2OO6