四种水产药物对牙鲆Paralichthys+olivaceus肝细胞色素P450酶影响

四种水产药物对牙鲆Paralichthys+olivaceus肝细胞色素P450酶影响 上海海洋大学 硕士学位四种水产药物对牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝细胞色素 P450酶影响的研究 姓名:韩华 申请学位级别:硕士 专业:临床兽医学 指导教师:李健 20090512 上海海洋大学硕士学位论文 四种水产药物对牙鲆(,,,,,,;,,,,, ,,,,,;,,,)肝细胞色素 ,,,,酶影响(的研究 摘要 细胞色素,,,,酶(,,,,,,)是与动物体内药物代谢关系最为密切的药物代谢酶，其活性的诱导和抑制往往会导致药物的相互作用，从而可能产生水产药物残留或影响药物疗效，严重威胁水产品安全。然而，‘关于水产药物对鱼类,,,,,,活性诱导和抑制的报道却非常少。本文以此为切入点，以重要的近海养殖经济鱼类牙鲆为研究对象，在不同水平上研究了水产用药物对该酶的活性及达的影响。研究分为两部分: 第一部分:研究了三种水产用喹诺酮类药物(,,)氟甲喹、恩诺沙星和诺氟沙星对牙鲆肝组织中氨基比林,(脱甲基酶(,,,,)、红霉素,。脱甲基酶(,,,,)和,(乙氧基异吩嗯唑酮(脱乙基酶(,,,,)活性的影响;以及利用半定量,,,方法研究了上述三种药物对,,,,,基因表达的影响。结果表明，和对照组相比，三种喹诺酮类药物对牙鲆肝,,中,,,,、,,,,、,,,,酶活性均具有抑制作用，其中恩诺沙星和诺氟沙星组,种酶的活性极显著下降(尸,,(,,)，而氟甲喹组中，,,,,、,,,,酶活性显著下降俨,,(,,)，,,,,酶活性极显著下降(尸,,(,,)。提示这,种,,药物牙鲆,,,,,,酶具有广泛的不同程度的抑制作用。,,,,,,结果表明，各药物组的,,,，,在,,,,水平上发生了下调，且,种药物影响表达下调的大小为，恩诺沙星,诺氟沙星,氟甲喹，结合药物对,,,,,依赖的,,,,酶活性抑制的结果，发现,种不同喹诺酮类药物对,,,,,酶活性及,,,,,基因表达的影响具有基本一致的效果，表明这,种药物作为抑制剂对,,,,,的抑制机制可能是抑制酶蛋白的合成，即可能是通过抑制,,,,,的表达，从而减少蛋白质，抑制了,,,,,酶蛋白合成，导致,,,,,酶活性下降。 第二部分:以中药黄芩苷作为受试药物，研究其在不同剂量和作用时间下对牙鲆肝,,,,,,酶活性及,,,,,基虮泶锏挠跋臁,捎锰迥谑笛椋 栖塑辗直鸢矗簦搿辏ǎ担埃恚纾 耄纭ぃ洌 ?校ǎ保埃埃恚纾 耄纭ぃ洌?透撸ǎ玻埃埃恚纾 耄纭ぃ洌 备黾亮苛 诠嘌丽遥 ?诟 场?丁?固旌笕? ,富钚越峁 砻鳎焊 程欤 峡瞻鬃槎 裕 栖塑崭骷亮孔榈娜纾危摹?牛遥危摹?牛遥希拿富钚悦挥忻飨员浠 桓 短欤 咧屑亮孔榈模粒校危摹?牛遥希拿富钚约 灾 觯ㄊ 迹埃 埃保 牛遥危拿富钚韵灾 陆蒂玻迹埃 埃担 ?, 上海海洋大学硕士学位论文中剂量组的,,,,酶活性极显著增,(,,,(,,)，,,,,酶活性显著增加(,,,(,,);给药,天，高剂量组的,,,,、,,,,酶活性极显著增加，,,,,酶活性极显著下降俨,,(,,)，(中剂量组的,,,,、,,,,酶活性极显著增加(,,,(,,)，,,,,酶活性显著下降(,,,(,,)，低剂量组的,,,,、,,,,酶活性显著增加妒,,(,,)。由结果可以看出，黄芩苷对牙鲆肝,,,,,,酶的作用具有选择性，即选择性的诱导,,,,,和,,,,,各自依赖的标志酶,,,,酶和,,,,的酶的活性，抑制,,,,,依赖的标志酶,,,,的活性;黄芩苷对,,,,,的诱导作用与给药剂量和药物作用时间呈相关性，给药剂量越高，诱导作用越强，给药时间越长，诱导作用也越强。半定量,,,鲒果表明，各药物组的,,,,,在,,, ,水平上都发生了上调，且这种表达的上调同,,,,,酶的活性一样随用药时间和剂量的增加而加强，说明黄芩苷作为诱导剂对,,,,,的诱导机制可能发生在转录水平上，可通过诱导,,,,,的表达而增强,,,,,酶的活性。 关键词水产药物，牙鲆，细胞色素,,,,，酶活，基因表达 ，， 上海海洋大学硕士学位论文 ,,,,;,, ,, ,,,, ,？,,;,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,; ;,,,;,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,;,,,,, ,,,,,;,,, ,, ,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ;,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,—,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,(,,,,,,,,,(,,,,,,;,,,,, ,, ,,,, ,,,;, ,,,,,,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,, ,,,,;,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, 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上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:聋鲜 日期:唧年岁月,乞日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在 年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 , 不保密? 学位论文作者签名:燕洱 日期:力,歹年么助多日 上海海洋大学硕士学位论文 引言 药物在体内的生物转化，即代谢，无论以何种方式进行，都需要酶的参与，其中与药物的代谢最密切相关的是细胞色素,,,,酶系(;,,,;,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,，;,,)，以下简写为,,,,,,，它广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内，是一族重要的混合功能氧化酶…，参与多种内源性物质(如脂肪酸衍生物、类固醇激素、维生素等)和外源性物质(如药物、致癌物、环境污染物等)的代谢，调节生物体与外界环境的相互作用并使其与环境相适应，保持生物体内环境的稳态，与生物体的生长、发育等相关，具有重要的生物学意义【,圳。正是由于它的这种生物学上的重要性，使得其自,,,,年发现以来，一直是药理学和毒理学研究中的一个十分引人注目的领域。 ,,,,,,在药理学研究中的重要性主要表现在:参与药物在体内的，相代谢反应，此反应是药物在体内代谢的关键一步，又是药物从体内消除的限速步骤，所以该酶的活性决定了药物的代谢速率，与药物清除率有着直接关系【,】，从而对药物的药理作用、治疗效应和安全性产生重要影响。影响,,,,,,活性的因素很多，其中许多药物都是该酶的诱导剂或抑制剂，当它们与其他需经,,,,,,代谢的药物联合应用时，会影响这类药物的代谢，产生药物的相互作用，从而影响药效和毒性，是导致药物不良反应的重要原因【,】。所以，,,,,,,在药理学中通过评价其活性指导临床合理用药具有重要的意义。然而，在水产用药上却很少考虑,,,,,,对药物代谢的影响，从而增加了渔药中毒、残留的发生率，使药物疗效陆担 跋炝怂 钒踩 虼耍 谒 持校 杂憷啵茫伲校矗担暗难芯拷 晌 ?硌а芯康男驴翁猓 饨 兄 诹私庖?镌谒 锾迥诘淖饔没 碛胂 媛桑 谥傅妓 俅埠侠碛靡 ??锊辛艏嗫胤矫嬗凶胖卮笠庖澹妫贰俊?上海海洋大学硕士学位论文 第一章文献综述 ,,,,,,是一族结构、性质类似而又有所差异、由基因超家族编码的含血红素的膜结合蛋白，主要位于滑面内质网上，因与一氧化碳(,,)结合形成的复合物在波长,,,,,处有最大特征吸收峰而得名【,】。它不但具有底物广泛性的特点，而且还在结构、功能、催化活性和基因表达调控等方面具有多样性的特点【,，,,，可以代谢多种内外源物质，具有重要的生物学功能，在医药、农业、环境等基础领域已经开展了广泛的研究。, ,,,,,,的概况,(, ,,,,,,的组成与分布 ,,,,,,是一个酶系，又称混合功能氧化酶(,,,,, ,,,;,,,, ,,,,,,,，,,,)系统，由多种成分组成，目前已知的主要组分包括两种细胞色素(细胞色素,,,,和细胞色素,,)、两种黄素蛋白(即,,,,,(细胞色素,,,,还原酶和,,,,(细胞色素,,还原酶)以及磷脂等，,,，它们共同构成了一个电子传递体系，对药物等内外源物质进行氧化。其中黄素蛋白起电子载体作用，将,,,,,传来的电子传递给,,,,,,，而磷脂可以加速电子的传递以提高,,,,氧化作用的速度，,,,,蛋白则是,,,,,,酶系的末端氧化酶，是酶系的关键组分，负责与氧的结合，(活化氧分子，同时也负责与底物结 ’合，决定底物和产物的特异性，引。 ,,,,,,在生物界中广泛分布，各种脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌等生物体中均已发现它的存在。它 不仅在不同种类的生物中存在，在同种生物的不同组织或器宫中也有发现，存在显著的种属、组织和器官差异，如在脊椎动物中，它分布于肝、肾、肺、皮肤、脑、消化道和骨髓等组织器官中【,，,,】，在鱼类中则主要分布于肝、肾和鳃等部位，,?。,,,,,,的分布还具有策略性的特点，即不同类型的,,,,,,具有不同的区域特异性和立体选择性，如肝脏作为药物代谢的主要场所是,,,,含量最丰富的器官，此外，它在外源化合物进入体内的主要入口组织中含量也相对较高，这些组织是对经皮肤和口腔进入生物体的外源化合物的第一道防线，,,,,,,这种策略性的分布可使其在生物体内最大限度的发挥作用【,’,,,。 , 上海海洋大学硕士学位论文进一步研究发现，,,,,,,在生物体内以可溶性和膜结合两种形态存在，其中，在原核生物中，,,,,,,作为一种可溶性蛋白而游离于胞质中，在真核生物中，则作为一种膜结合蛋白，主要分布在滑面内质网上，也有少数分布于线粒体膜和细胞核膜上，且不同细胞器内,,,,,,的含量分布不均一，所起的作用也不尽相同，以肝微粒体含量最高【,,】。,(, ,,,,,,的分类与命名 根据从,,,(,),传来的电子传递到催化位点的方式可将,,,,,,分为四类:，类,,,,,,，需要同时含有,,,的,,,,(,)还原酶和铁(硫还原酶进行电子传递;，，类,,,,,,，只需要一种含有,,,,,,,的,,,,还原酶进行电子传递;，，，类,,,,,,，可以自己提供电子，无需其它的电子供体;，,类,,,,,,，则直接从,,,(,),接受电互【,,】( , , 目前，,,,,,,采用的是由,,,,,,【,,,(,,,,)等科学家根据,,,,,,酶的氨基酸序列的同源性及序列间的亲缘关系来进行命名的，依次分为家族、亚家族和酶个体三级，同源性大于,,,的归于同一家族(,,,,,)，用阿拉伯数字表示，如,,,,;同源性大于,,,的归于同一亚家族(,,,,,,,,,)，用大写英文字母表示，如,,,,,:同一亚家族的酶具有相似的功能，这些酶根据被鉴定的先后顺序用阿拉伯数字编序来加以区分，如,,,,,,。目前，已发现近,,,个家族,,,,多种,,,,,,基因序列，其中涉及大多数药物代谢的,,,,,,酶系主要有,,,,、,,,,和,,,,这三个家族，研究得也最深入。,(, ,,,,,,的循环催化机制 ?,,,,,的主要生理功能是催化机体内的物质代谢，是自然界中的一种生物催化剂，具有催化多样性和底物广谱性的特点;即它对许多内源性(如脂肪酸衍生物、类固醇激素、维生素等)和外源性化合物(如药物、致癌物、环境污染物等)的代谢都有催化作用。,,,,,,酶可以催化成千上万种的反应，甚至对具有相似化学结构的底物也表现出多种反应类型，反应过程涉及多个步骤，作用机制也有多种。其中，,,,,,,酶的单加氧机制是最早也是最典型的反应，研究得也比较清楚，该反应通过电子传递系统，将分子氧还原，并将其中的一个氧原子插入底物分子中，形成水分子，使底物水溶性增加。总反应式及模式图四(图,(,)如下: ,,,，,,，,,，，,,,,,’上堑吐,,,，,(，,，,,,,， 上海海洋大学硕士学位论文 ,,代表底物，,,,代表羟基化产物 图,(, ,,,,,,总反应模式图 ,,,,,,(,?, ,;,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,;,,,, 该单加氧反应的催化循环机制主要是通过,,,,,,酶系电子传递系统，由 ,,,,,提供电子，经过黄素蛋白(即,,,,,(,,,,还原酶)传递给与其紧密相邻的 ,,,,,,酶， 后者激活氧分子，使底物氧化，被氧化的底物释放出后，游离的,,,,,, 酶又可重复循环进行催化作用，此外由细胞色素,,和,,,,,,,还原酶组成的一个电 子传递支路也可作为提供第二个电子的来源【,】 。事实上，由于整个催化反应的复杂性，随着生物所处环境的不同， ,,,,,,。还存在除了上述单加氧机制外的催化机制，主要利,,】:(,)无氧情况下，存在过氧 化物支路，即底物通过过氧化物提供的氧原子而形成羟基化产物;(,)氧不加入底 物中形成羟基化产物，而是通过氧化还原机制，形成超氧化物或过氧化氢; (,),,,,,,不完全是氧化催化剂，它还起到还原催化作用，即由亚铁,,,,,,提供 电子，在无氧条件下进行分布反应，许多化合物如染料、,(氧化物等都可接受,个 ‘ ? 电子而被还原。 ,,,,,,的催化机制图解，,列(图,(,)表示如下: , 上海海洋大学硕士学位论文 ,,, ,,,,表，,示(,,,,,,酶活性部位中血红素的铁离子;,,表示底物;,,,表示羟化产物;,,,表示 羟化副产物;,’,,,,表示过氧化物;,’,表示还原产物: 。,,,,代表过氧化物作为交 , ,,,,替的氧供体 图,(, ,,,,,,的催化机制 ,,,,,,(,—,,,,; ,,;,,,,,, ,, ;,,,,,,,,, ,,,, 通过这些各种催化机制，,,,,,,对包括药物在内的多种外源物质的代谢进行催化作用，主要有两种反应类型:一种是氧化型反应，涉及氧化性的,,,或,(,等键的断开，具体主要包括,(氧化、,(氧化、环氧化、,(脱烷基、,(脱烷基、,(脱烷基、脱氢、脱硫、脱胺、脱卤、芳香族羟化等反应;另一种是非氧化型反应，涉及脱氢、脱水和异构化等，具体主要包括肽键、酯键和酯胺键的水解、硝基还原、偶氮还原、环氧化物水合等反应。，,(,影响,,,,,,的因素 ,,,,,,活性可受到多种因素的影响而发生改变，这种活性的改变直接影响了对药物或毒物的代谢，从而影响它们对机体的作用大小，这些因素包括:,(,(,内在因素,(,(,(,种属差异 种属差异是所有影响,,,,,,活性因素中最为明显的一个，外源物质在不同种属中的代谢差异，主要就是由于不同种属的,,,,,,在基因表达调节上具有表达的质和量的差异，从而导致,,,,,,同工酶的组成和活性不同而造成的【,,,。研究表明， 上海海洋大学硕士学位论文在脊椎动物中，,,,,,,总含量依次为猪,兔,大鼠,小鼠,人,鸡,,,’,,,。而,;;,,,;((,,,,,,,’】等通过比较不同文献的数据发现，,,,,,((,,,,还原酶活性高低顺序为大鼠,热带淡水鱼,热带海水鱼、青蛙和褐鳟,蟾蜍、鲽及虹鳟。,(,(,(,性别和性成熟 动物肝脏对外来物的生物转化有着随青春期的开始而显示出性别差异的现象，此现象贯穿于整个成年期，主要是由甾族和一些多肽类(生长激素和促肾上腺皮质激素等)激素调节的缘故。在对,,,,,,的研究中也发现了这种性别差异，一般哺乳动物的雄性,,,,,,活性较雌性强，如大鼠的,,,,,,含量和活性在出生,周内无性别差异，但是随着性成熟，雄性的则比雌性高，这可能与雄性激素促进,,,,,,生成有关,,,,，另有,,,,,,,,【,,】和宣贵达,,,〕等报道，大鼠的,,,,,活性存在明显的性别差异，雄性比雌性高,(,倍，因此，在,,,,,,的研究中，如无特殊需要，一般以雄性动物作为受试对象。 鱼类,,,,,,也表现出与哺乳动物相似的性别差异特性，已有研究报道，性别不同可以引起鱼类肝体比、微粒体细胞色素含量和相关混和功能氧化酶活性的差异。,,,,,,,,:,,】 等发现从佛罗里达(,,,,,,,)捕获到的四斑蝴蝶鱼(劬口,幻如厅;,,,,,,,,,,)的肝体比无显著差异，雄鱼细胞色素,,,,含量、,,,,,,(细胞色素,还原酶活性分别比雌鱼高,,((,,,和,,,。除此之外，雄性比目鱼妒,口,,;矗,枷(‖嚣,‘,幽,、雄性虹鳟(,,;,,,,,;,,, ,,兢,,),,,,以及雄性大马哈鱼?砌, ,,,,,)【,:,】与相应的雌鱼相比，,,,,,,相关的酶也都表现出更高的活性。这种鱼类,,,,,,活性的性别差异，尤其在产卵期，差别更显著,主要是因为雌鱼在产卵期时发生,,,,,,活力急剧下降，同时伴随着对诱导剂及抑制剂敏感性的降低的变化，且已有研究表明，这种变化与鱼类雌激素水平密切相关,,,抛】。,,,,,,,,:’,等研究发现，幼年虹鳟注射,,,,(雌二醇后，,,,,,,含量及相关单加氧酶活性显著下降，但若注射睾酮活性则没有任何提 ’高。,(,(,(,年龄和发育 ,,,,,,的基因编码受到发育的控制，其表达受到年龄的影响，这种影响一般表现为两种模式:一为活性在出生时很低，然后开始增加，到青年成年时达到最高，最后在老年时降低，,,,,,,,,,,研究结果表明年龄对人,,,,,,,的影响就表现为此模式;另一为活性在出生后迅速增加，到青年成年时则保持在一个稳定水平，然后在老年时加快降低。由此可见，年龄对,,,,,,,活性的影响尤其在新生动物和年老动物中表现突出，这主要是由于肝细胞内质网在新生动物中发育不完全，使得内质网膜的,,,,,,酶蛋白含量低，从而造成,,,,,,和,,,,,还原酶的活性明显低于成年动物，而年老动物则由于其肝功能细胞减少，从而使得,,,,,,含量减 , 上海海洋大学硕士学位论文少，表现为依赖,,,,,,的，相代谢反应变慢〔,,】。因此，了解,,,,,,活性随年龄的改变，对我们在预知和防止药物的不良反应方面具有积极作用〔,,,。 对于鱼类而言，由于生长发育阶段不同而引起的,,,,,,表达以及对诱导物反应的差异已经受到研究者的关注，,,,,,,～〔,,〕等研究发现，鱼卵受精后,天就能检测到,,,,,,酶活性，早于肝的发现，到孵化时，,,,活性则提高了,,,(,倍，,,,活性不但在胚胎期可被,,,高度诱导，而且孵化过程可不断增强其诱导敏感性。,,,,,〔,,】也观察到,(,(,(,龄的虹鳟幼体经,(,,或,,,,诱导后，其某些,,,,,,酶活性的诱导与年龄呈正相关上升的关系。,(,(,外在因素,(,(,(,食物及营养状况 食物中的蛋白质、碳水化合物、纤维素、脂肪、维生素和微量元素等成分可改变人和动物体内各种,,,,,,酶的含量、活性和组成，是某些,,,,,,酶的诱导剂或抑制剂。其中，蛋白质的缺乏通常会减慢外源化学物质的代谢,,,,，这可能是由于高蛋白可提高肝微粒体蛋白和,,,,,,含量，使肝细胞滑面内质网面积增加，而蛋白含量低或缺乏则相反的缘故;对于碳水化合.