大蒜素对人食管癌细胞株ECA-109生长的抑制作用

大蒜素对人食管癌细胞株Eca-109生长的抑制作用 【摘要】目的 研究大蒜素对人食管癌细胞株Eca-109增殖抑制作用。方法传代培养人食管 癌细胞，MTT法及流式细胞仪检测测定Eca-109细胞增殖抑制率。结果大蒜素对细胞的生 长均有明显的抑制作用，且呈浓度、时间依赖性。结论一定浓度的大蒜素能抑制食管癌细胞 的生长。 【关键词】 大蒜素 MTT 流式细胞术 Inhibitory Effect of the Garlicin on the Growth of the Human Esophageal Cancer Cell Line Eca-109 ZHAO Jian,WANG Zhong-bin (Department of the Thoracic Surgery,the First Affiliated Hospital,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001 China) 【Abstract】 Objective This paper has studied the inhibitory effect of garlicin on the proliferation of the human esophageal cancer cell line Eca-109. Methods Human esophageal cancer cell was subcultured.The inhibition rate of the Era-109 cell proliferation was assayed by MTT methods and the alteration of the cell cycle was detected by flow cytometry. Results The garlicin had dramatic inhibitory effect on the cell growth,and the inhibition was dependent on its concentration and time. Conclusions Garlicin can inhibit the growth of the human esophageal cancer cell. 【Key words】 garlicin;MTT;flow cytometry 大蒜是百合科植物，我国有悠久的食用历史。近年来的研究表明大蒜含有多种营养成分， 大 蒜的提取物大蒜素又名大蒜新素，化学名二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide)，是从大蒜球 茎中分离出的一种化合物，有多种生物活性，有抗真菌、抗细菌、降血酯、降血压和防治动 脉粥样硬化等心血管疾病的作用,1,2,。近年来研究发现大蒜素具有抗肿瘤活性，如可增强 巨噬细胞的抗肿瘤作用,3,;提高肿瘤患者的细胞免疫功能,4,;对抗癌药具有增敏作用等 ,5,。本研究应用MTT检测法，流式细胞仪技术研究大蒜素对人食管癌株Eca-109的作用， 深入研究大蒜素对肿瘤细胞增殖的抑制作用。 1 材料 人食管癌细胞株Eca-109由中国医科大学细胞生物学教研室提供，大蒜素注射液购自上海禾 丰制药有限公司(30mg/支)，MTT购自Sigma公司，流式细胞仪型号:FACScan(B.D USA)。 2 方法 2.1 细胞培养 人食管癌细胞Eca-109常规培养于含10,小牛血清，100u/ml青霉素及100u/ml链霉素的 RPMI1640培养基中。置于37?、5,CO2培养箱内培养，培养至70,,80,融合时，0.25, 胰蛋白酶消化、传代，维持适当的细胞浓度。 2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率 取对数生长期的Eca-109细胞，MTT法测定,6, 。调节细胞浓度为1.0×104/ml，将 每空接种于96孔细胞培养板中，每孔200μl。贴壁后分别加入用不同浓度的大蒜素: 12.5μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，每个浓度设3个复孔，并 设不含大蒜素的空白对照。培养24h、48h、72h后，弃细胞培养液，每孔加入5mg/ml(或0.5,， Http://Www.Yaokuo.Com 5g/L)的MTT20μl，作用4h后，轻轻吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO溶液150μl，轻轻震荡15min，使结晶物充分溶解，以空白孔凋零。在酶联免疫检测仪570nm(或490nm)波长处测定各孔光密度值(OD值)，求其平均值。以对照组细胞存活率记为100,，按下列公式计算:实验组细胞抑制率=(1,实验组OD值/对照组OD值)×100,。以上实验重复3次。 2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 取对数生长期的Eca-109细胞，调节细胞浓度为5×105/ml，接种于6孔细胞培养板中，每孔2ml。分别加入不同浓度的大蒜素:0μmol/L，12.5μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L。作用24h离心后，收集对照组和实验组Eca-109细胞，PBS洗涤3次后，加入碘化丙啶(PI)染料，避光染色15分钟，即可上流式细胞仪分析。 2.4 统计学分析 实验数据以x?s表示。采用F检验及q检验进行统计处理。 3 结果 3.1 大蒜素对Eca-109细胞的抑制 12.5,100μmol/L的大蒜素可显著抑制肿瘤细胞的生长，并随着作用时间的延长，抑制作用愈加明显(见表1)。 表1 各浓度组大蒜素作用于肿瘤细胞后的细胞生存率(略) 3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 见图1,4，图片左下象限代表正常肿瘤细胞数量，右下象限代表凋亡细胞数量，右上象限代坏死细胞数量，左上象限代表其他情况细胞。 由图可见肿瘤细胞的随着大蒜素浓度的增高凋亡数目增多，凋亡率增高。 4 讨论 四唑盐比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法,试验所用的显色剂四唑盐是一种能接受氢原子的染料，化学名32(4,52二甲基噻唑22)22,52二苯基四氮唑溴盐，简称MTT。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm (或490nm)波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已广泛用于一些生物活性因子的检测，大规模的抗肿瘤药物的筛选，细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高，重复性好，操作简便，经济、快速、易自动化，无放射污染。我们采用MTT比色试验，了解大蒜素对Eca-109细胞的剂量及时间毒性情况。实验结果提示大蒜素在50,100μmol/L浓度范围内可显著抑制人食管癌细胞Eca-109的生长，而低浓度(12.5,25μmol/L)的大蒜素对细胞生长抑制不明显。 流式细胞术(flow cytometry，FCM)是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术，20世纪80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。工作原理,7,是当待测标本被制成单细胞悬液，经染色后进入流动室。流动室充满流动的鞘液，鞘液压力与样品流压力是不同的，当两者的压力差异达到一定程度时，鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单 Http://Www.Yaokuo.Com 列逐个经过激光聚焦区。若将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料，那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发产生特定波长的荧光，通过一系列信号转换、放大、数字化处理后就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率,8，9,。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征。如果对具有某种特征的细胞有兴趣，还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。FCM近几年还被应用于药学的研究，如多药耐药基因的研究中等,10,。 【参考文献】 ,1,杨艳梅,高彦辉.大蒜抗癌作用研究进展,J,.国外医学中医中药分册,2000,22(2):67-71. ,2,马凤英,王文英.大蒜素的药理学研究进展,J,.中草药,1997,28(11):697-702. ,3,张桂梅,冯作化,郝天玲,等.大蒜素对巨噬细胞介导的细胞毒作用作用的影响,J,.中国中药杂志,1996,21(21):45-47. ,4,张志勉,高海青,魏瑗.大蒜素对肿瘤患者细胞免疫功能的影响,J,.山东大学学报(医学版),2003,41(2):148-150. ,5,Dorey K,Barila D,Gavin AC,et al. Regulation of human c A bl Tyrosine kinase activity in Xenopus on cogenic and acceleration of Progesterone–in–duced G2/M transition by Oncogenic for ms,J,. Biol Chem,1999,380(2):223-230. ,6,Saha S, bardelli A,Buckhaults P,et al. A Phosphatase A ssociated with Metastasis of Colorectal Cancer ,J,.Science，2001,294 :1343-1346. ,7,李家增.血液实验学,M,.上海:上海科学技术出版社,1997. 530-540. ,8,Grogan W M.Guide to flow cytometry methods,M,.New York: Marcel Dekker Inc,2000.1220-1226. ,9,丛玉隆,孙芾,陈宝梁.当代血液分析技术与临床,M,.北京:人民卫生出版社,1997.166-171. ,10,栾凤君,杨纯正,邵晓枫,等.100例急性白血病患者多药耐药性检测分析,J,.中华肿瘤杂志,1994,16:360-363. 图1药物浓度12.5μmol/L (略) 图2药物浓度25μmol/L (略) 图3药物浓度50μmol/L (略) 图4药物浓度100μmol/L (略) 作者:赵建 王中彬作者单位:辽宁医学院附属第一医院胸外科,辽宁 锦州 121001 申明:本论文版权归原刊发杂志社所有,我们转载的目的是用于学术交流与讨论,论述仅供参考不构成任何学术建议。 Http://Www.Yaokuo.Com