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谈掺假乌梢蛇的鉴别.doc

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谈掺假乌梢蛇的鉴别.doc谈掺假乌梢蛇的鉴别.doc 谈掺假乌梢蛇的鉴别 乌梢蛇又名乌蛇,来源于游蛇科动物乌梢蛇Zaolys dhumnades 除去内脏的干燥体乌蛇,多于夏、秋二季捕捉,剖开蛇腹或先剥去蛇皮留头尾,除去内脏,盘成圆盘状,干燥,性平,味甘,具有祛风活络镇疼,除湿攻毒之功效,临床用于风湿顽痹、麻木拘挛、中风、口眼歪斜、半身不遂、抽搐、痉挛、破伤风症、麻风、疥癣、瘰疬、恶疮等。 乌梢蛇做为临床功效确切的祛风活络镇痉的动物类药材,其价格一直在不断上涨,市场上出现了大量的掺假乌梢蛇。因此,对乌梢蛇的鉴定已经成为保证药材质量的关键。乌梢蛇...
谈掺假乌梢蛇的鉴别.doc
谈掺假乌梢蛇的鉴别.doc 谈掺假乌梢蛇的鉴别 乌梢蛇又名乌蛇,来源于游蛇科动物乌梢蛇Zaolys dhumnades 除去内脏的干燥体乌蛇,多于夏、秋二季捕捉,剖开蛇腹或先剥去蛇皮留头尾,除去内脏,盘成圆盘状,干燥,性平,味甘,具有祛风活络镇疼,除湿攻毒之功效,临床用于风湿顽痹、麻木拘挛、中风、口眼歪斜、半身不遂、抽搐、痉挛、破伤风症、麻风、疥癣、瘰疬、恶疮等。 乌梢蛇做为临床功效确切的祛风活络镇痉的动物类药材,其价格一直在不断上涨,市场上出现了大量的掺假乌梢蛇。因此,对乌梢蛇的鉴定已经成为保证药材质量的关键。乌梢蛇传统的鉴别方法以形态学为主,但形态学技术需要丰富的积累,而且市售乌梢蛇中药饮片多为蛇段,完整形态无法判断,乌梢蛇的形态学鉴别存在一定的困难。随着乌梢蛇的PCR 鉴别被2010 版中国药典收录,本所收到相当多的日常监督抽验和企业送样。经过多次日常检测发现: 市售乌梢蛇多为短小蛇段,很少有整条蛇鉴别容易掺假; 同一份样品不同人抽样,PCR 鉴别很可能出现不同结果。掺假现象流行加大了PCR 鉴别的难度。本文根据日常检测中出现的掺假乌梢蛇的鉴别,研究讨论掺假乌梢蛇形态学鉴别与PCR 鉴别结合的可行性。 1 材料和方法 1. 1 材料 1. 1. 1 试验药材: 乌梢蛇对照品来源于中国食品药品检定研究院( 批号: 121591-201201) ,乌梢蛇样品( 日常监督抽验: 太仓王植芝中医诊所) 。 1. 1. 2 仪器和试剂: 高速低温离心机( Thermo scientificBiofuge primo R) ,凝胶成像系统( GEL DocTM XR Bio RAD) ,核酸电泳仪( Bio-RAD Power PacTM Basic) ,PCR 仪( AB AppliedBiosystems) 。DNA 提取试剂为天根TIANamp GenomicDNA Kit( 吸附柱批号: M1104) ,DREAM Taq Green Pcr MasterMix( 2 × ) 为Thermo Scientific 公司产品( 批号: 00108596) ,引物合成于上海生工( 批号: 9301839997 和9301839996) ,Gel-Red 购自BIOTIUM 公司,批号11G0127 ) ,TiANGEN 100bpDNA Ladder。其他试剂药品皆为国产或进口的分析纯试剂。 1. 2 方法 1. 2. 1 基因组DNA 的提取: 取剪碎的蛇肉0. 5g,置乳钵中, 加液氮适量,充分研磨使成粉末,取20mg 置1. 5mL 离心管中,按DNA 提取试剂使用步骤提取DNA,提取得到的供试品DNA,置- 20?保存备用。对照品DNA 制备: 取乌梢蛇对照品20mg 置1. 5mL 离心管中,按前述方法提取乌梢蛇对照品DNA。 1. 2. 2 PCR 反应: 鉴别引物:PCR 反应体系: 在200μL 离心管中进行,反应总体积为25μL,DREAM Taq Green Pcr Master Mix 12. 5μL,20μM 的引物各0. 75μL,DNA 1. 25μL,去离子水9. 75μL。PCR 反应参数95? 预变性5min,循环反应30 次( 95? 30s, 63? 45s) , 72?延伸5min。 1. 2. 3 电泳检测: 电泳缓冲液为TAE,胶浓度为1. 2%,在融化的琼脂糖中加入核酸胶染色剂GelRed; 供试品与对照药材PCR 反应溶液的上样量分别为8μL,DNA 分子量标记上样量为6μL,5 V/cm,电泳时间约50min。电泳结束后,取凝胶片在凝胶成像仪上检视。 1. 2. 4 结果判断: 凝胶电泳图谱中,乌梢蛇正品在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上( 350bp) ,应有单一DNA 条带。 2 结果 2. 1 乌梢蛇的形态学鉴别乌梢蛇样品中为3cm 左右的乌梢蛇段,同一份样品中有多条不同大小乌梢蛇,皮颜色深浅不一,有些蛇段鳞片出现脱落。部分蛇段背中央2 , 4 行鳞片未见强烈起棱,脊背不成屋脊状。经本所中药室专家判断为掺假乌梢蛇样品,并挑选出4 段疑似乌梢蛇混伪品供PCR进一步鉴别。 2. 2 乌梢蛇的PCR 鉴别分别从疑似乌梢蛇混伪品蛇段1, 4 中取蛇肉0. 5g,按照基因组DNA 提取方法提取基因组DNA。使用引物进行PCR 反应,并电泳检测结果: 乌梢蛇品有明显目的条带,阴性对照无目的条带,蛇段1 有目的条带,蛇段2 , 4均无目的条带。 3 讨论 随着乌梢蛇蕲蛇川贝母PCR 鉴定方法在药典中收录,中药材的分子生物学鉴定手段正式进入日常中药材质量监督检查的范畴。与传统的形态学鉴定方法相比,分子生物学鉴定方法具有很多优点: 所需样品量小,对样品完整性几乎没有要求,只要能够提取出基因组DNA 的样品均可以操作; 准确可靠,选取出特异性目的序列进行特异扩增,同源性很高的也可以进行测序确认,判断结果更加客观可靠。但是,通过近年来乌梢蛇的日常检测发现,目前市售的乌梢蛇中药饮片多为50 , 100g 的小袋包装蛇段,已经失去了个体的完整性,利于 不法商贩通过混入部分混伪品或混伪品蛇骨上贴乌梢蛇皮进行掺假、制假。一旦有乌梢蛇正品的基因少量混入,正因为PCR 鉴别所需样品量小的特点,掺假乌梢蛇的PCR 鉴定将面临极大的假阳性的风险。如果对每一个单独的蛇段或蛇肉进行PCR 鉴别将增加不小的工作量,不利于日常检测的高效进行。 本研究通过形态学初步鉴别疑似混伪品,并对疑似混伪品进行PCR 鉴别确认,能真正体现出了药材分子鉴别快速、准确可靠、易于操作的优点。但是,产品质量是生产出来的,不是检验出来的。市售乌梢蛇中药饮片的标准不统一,溯源机制还没有很好的建立,不论掺假比例的高低能否直接界定为假药仍然存在不小的分歧。这些问题仍然制约着乌梢蛇中药市场的良性发展,还需要药材质量监督部门和生产企业的共同努力。
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