熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用及其信号转导机制研究

熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用及其信号转导机制研究 熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用 及其信号转导机制研究 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果,其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则,承担相应的法律责任。 ,一,。。‘:, \ ,二:“,。。 , ’ ‖了’ 研究生签名表旮导师签章:彬挝 二痘等睁警亨毫;』歹:’ 砷『年,姜。月.硼 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了 文中特别加以标注等内容外,文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 导师签章:议 研究生繇白易 年舌月矽日 目 录 中文摘要??.. 英文摘要??.. 英文缩写研究论文熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用及 其信号转导机制研究 引言?.. 第一部分熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗氧化作用及 其相关信号转导机制研究 前言???一 日蟊材料与方法结果附图附表讨论小结参考文献 。第二部分熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗炎作用及 其相关信号转导机制研究 前言日舌材料与方法结果附图附表讨论小结参考文献 第三部分熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的促进神经分化 ‘ 作用及其相关信号转导机制研究 前言日舌??。,材料与方法??.. 结果??.. 附图??.. 附表??.. , 讨论??.. 小结??.. 参考文献.. 结论?.. 综述一综述二 致谢 个人简历??中文摘要 熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用 及其信号转导机制研究 摘 要 缺血性脑血管病是临床常见病、多发病之一,根据国际卫生组织 统计,在全球范围内平均每个人中就有一个缺血性脑血管病患者, 缺血性脑血管病造成的死亡率仅次于心脏疾病,在所有的缺血性脑血 管病患者中有大约%患者由于溶栓治疗或栓子自发向远端推移出 现血管再通,而出现缺血再灌注损伤。 随着现代免疫学和分子生物学的迅速发展,认为脑缺血再灌注损 伤的病理生理机制是一种损伤级联反应,主要包括兴奋性氨基酸毒 性、氧化应激、凋亡、细胞内钙超载、自由基损伤、炎症损害等,这 几种因素相互作用、相互影响,构成了一个复杂的调控网络,形成恶 性循环,最终导致细胞凋亡或坏死。 目前已有许多合成或天然物质的神经保护剂进入实验研究,虽然 理论上应用神经保护剂可治疗脑梗死,但是这些神经保护剂在临床治 疗中并没有取得预期的效果,出现临床和理论的严重脱节。出现这种 现象最主要的原因是动物与人类生理机制及耐受性等方面的差异,另 外,由于脑缺血后级联反应的复杂性,可能单一使用阻断某一病理环 节的药物难以奏效。在我们目前的临床治疗中,理想的神经保护剂应 该具备针对缺血再灌注损伤多个损伤环节发挥“一个靶点,多重保护” 作用的特性。 熊果酸 ,是存在于天然植物中的一种五环三 萜系化合物,主要存在于熊果、夏枯草、铁冬青等植物中。研究表 明具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗凋亡、抗病毒、增强免疫功能 等多种生物学作用,并且毒副作用低,具有良好的临床应用潜力。 临床上,缺血性脑血管疾病多为局灶性,部分患者由于溶栓治疗 或栓子自发向远端推移出现血管再通即再灌注现象,因此,制备局灶 性脑梗死并且可实现再灌注的动物模型更为接近临床实际情况。 本研究选用雄性.小鼠、斗、/鼠为研究对象,中文摘要 采用线栓法建立脑缺血再灌注模型,动态观察缺血再灌注损伤后 /信号转导通路与氧化损伤、炎症反应及神经分化的关系, 并选用五环三萜系化合物进行干预,评价干预前后梗死体积、神 经功能缺损评分,以及对/信号通路的激活在缺血再灌 注损伤后的脑保护作用机制进行初步探讨。本研究分三部分,现将各 部分内容概述如下。 第一部分熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗氧化作用及其 ‘ 相关信号转导机制研究 目的:观察脑缺血再灌注损伤后不同时间点/通路的活 性变化,研究熊果酸对缺血再灌注小鼠的抗氧化作用,探讨熊果酸抗 氧化作用的相关信号转导机制。 方法:选用成年雄性.小鼠、。、/鼠为研究对 象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。试验:随机 将.小鼠分为组:假手术组,手术组, 、 、 、 、 五个亚组 每组又根据不同的时间点分为 。试验:随机将.小鼠分为组:假手术组、手 /、大剂量熊果 术组、小剂量熊果酸干预组 /。试验:采用随机的方法分别将一一、 酸干预组. /鼠分为组:假手术组、手术组、大剂量熊 果酸干预组. /。组:假手术后腹腔注射等量 %,组:缺血再灌注术后腹腔注射等量 %,.组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸 /。.组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸 依。各 组取材前进行神经功能评分,染色评价脑梗死体积,染色观 察组织学改变,检测脑组织中丙二醛含量的变化情况,分 的方法检测缺血脑组织、 别用的方法和 . 和蛋白水平的变化、观察核转位的形态学 改变。 结果:在缺血再灌注早期、.、的表达呈逐渐升高 ,自 开始逐渐下降。两种 的趋势,至 达高峰,持续到 剂量熊果酸干预后均可以改善脑缺血再灌注后小鼠的神经功能缺失中文摘 要 评分,.组与组相比可明显降低神经功能缺损,差异有 统计学意义.. ..士..,而组与 . 组相比可降低神经功能缺损,但差异无统计学意义.士. .士..,两种剂量熊果酸干预后均可降低脑缺血再灌 注后小鼠的脑梗死体积,.组与组相比可明显减轻梗死 体积,差异有统计学意义.土. ..士.尸.,而. 组与组相比可减轻梗死体积,但差异无统计学意义.. ..士.尸.。两种剂量熊果酸干预后均可降低脑缺血再 灌注后小鼠的含量,.组与组相比可明显减低 含量,差异有统计学意义.士. ..士..,而. 组与组相比可降低含量,但差异无统计学意义 .士. 表达以 ..士.尸.。、. 值表示,组、组、.组、.组与.的 值分别为:.土.,.士.,.士.,.士.;.士., .:.,.士.,.士.。统计结果显示.可明显诱导 、. 表达增加,差异有统计学意义.,而. 组可诱导、. 表达增加,但差异无统计学意义尸 .。核蛋白及.蛋白的表达变化与基因水平改变类似。 在/鼠中,再灌注 后,.的结果显示,与 组相比,.能够明显诱导核蛋白、.蛋白的表达, 然而在小鼠中,.的诱导能力被阻滞,而且神经功能缺失 更严重。 结论:局灶性脑缺血再灌注后,缺血脑组织的、、. 水平存在一个相关性动态表达的变化过程,提示/通路可能 与抗氧化作用有一定相关性;对局灶性缺血再灌注脑损伤小鼠有 确切的神经保护作用,可改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失, 减小脑梗死体积,诱导、.的表达,减少含量,因此我 们推测的神经保护可能是通过恤通路的激活实现;而在 %鼠脑缺血再灌注模型的观察中,上述推测得到了进一步证 实,在%鼠模型中氧化损伤更明显,的抗氧化作用被阻滞, 说明/通路的激活是发挥其抗氧化作用之一,从而实现其中文摘要 神经保护作用。 第二部分熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗炎作用及其相 关信号转导机制研究 目的:观察脑缺血再灌注损伤后不同时间点/.的活性 变化,研究熊果酸对缺血再灌注小鼠的抗炎作用,探讨熊果酸抗炎作 用的相关信号转导机制。 方法:选用成年雄性.小鼠、/、/、鼠为研究对 象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。试验:随机 将.小鼠分为组:假手术组,手术组, 、 、 、 、 五个亚组 每组又根据不同的时间点分为 。试验:随机将.小鼠分为组:假手术组、手 /、大剂量熊果 术组、小剂量熊果酸干预组 酸干预组. /。试验:采用随机的方法分别将/、 /鼠分为组:假手术组、手术组、大剂量熊 果酸组. /。组:假手术后腹腔注射等量 %,组:缺血再灌注术后腹腔注射等量 %,.组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸 /。各 /,.组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸 组取材前进行神经功能评分,分别用的方法和 和蛋 .的方法检测缺血脑组织中、.. 白水平的变化。 结果:在缺血再灌注早期、..的表达呈逐渐升高的趋 ,自 开始逐渐下降。两种剂量 势,至 达高峰,持续到 熊果酸干预后均可以降低脑缺血再灌注后小鼠的炎症表达, /. 表达以值表示,组、组、. ,.士., 组、.组/.的值分别为:.土. .士. ,.:.;.:.,.士.,.士.,.:.。 统计结果显示.可明显减轻/. 表达,差异有统 表达增 计学意义.,而.组可减轻/. 加,但差异无统计学意义户.。、.核蛋白的表达 后, 变化与基因水平改变类似。在/、鼠中,再灌注中文摘要 .的结果显示,与组相比,.能够明显抑制 、..核蛋白的表达,然而在旷小鼠中炎症表达更严重, 与组相比,的抑制能力被阻滞。 结论:局灶性脑缺血再灌注后,缺血脑组织的、.动 态表达的变化过程与脑组织损伤程度一致,提示/.出通路的 炎症损伤参与了脑缺血再灌注损伤;可下调、抑制.的 核转位,从而减轻缺血再灌注后脑组织的过度炎症反应,实现缺血再 灌注后的神经保护作用;结合第一部分试验结果,抑制 /.表达与诱导/表达上调,减少含量存在一致 性,故我们推测的抗炎作用可能是通过咆脚信号转导通路发 挥作用,从而实现的抗氧化、抗炎的神经保护作用;而在/ 小鼠脑缺血再灌注模型的观察中,上述推测得到进一步证实,在 小鼠模型中炎症损伤更严重,的抗氧化、抗炎作用被阻滞, 说明/通路激活是发挥其抗氧化、抗炎作用之一,从而实 现其神经保护作用。 第三部分熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的促进神经分 化作用及其相关信号转导机制研究 目的:观察脑缺血再灌注损伤后不同时间点神经分化标志物 .、.、.的动态变化,研究熊果酸对缺血再灌注小鼠的 促进神经分化作用,探讨熊果酸促进神经分化作用的相关信号转导机 制。 方法:选用成年雄性.小鼠、、/、鼠为研究对 象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。试验:随机 将.小鼠分为组:假手术组,手术组, 、 、 每组又根据不同的时间点分为 、 、 五个亚组 。试验:随机将.小鼠分为组:假手术组、手 术组、小剂量熊果酸组? /、大剂量熊 果酸组. 依。试验:采用随机的方法分别将广、 /鼠分为组:假手术组、手术组、大剂量熊 果酸组. /。组:假手术后腹腔注射等量 %,组:缺血再灌注术后腹腔注射等量中文摘要 %,.组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸 依。各组取 /,.组:缺血再灌注术后腹腔注射 材前进行神经功能评分,分别用的方法和 和蛋白水平的变 的方法检测缺血脑组织.、.、. 化规律。 结果:在缺血再灌注早期.、.、仅.的表达呈逐渐降 开始逐 达低谷,持续到 ,其中.自第 低的趋势,至 渐回升,而.、【.表达无明显回升。两种剂量熊果酸干预后 均可以上调脑缺血再灌注后小鼠的.表达,而对.、. 的表达无明显影响。.、.、. 表达以值表示, 组、组、.组、.组?、.、?的 .:.,.:.,.:.,.士.; 值分别为:. .士., . ..,.士.,..,.:.;小 .士.,..,.士.。统计结果显示.可明显上调 . 表达,差异有统计学意义.,而组可上 调. 表达,但差异无统计学意义.。两种剂量熊 果酸干预后对.、.的表达无明显影响。.、.、仅. 蛋白的表达变化与基因水平改变类似。在鼠中,再灌注 后,的结果显示,与组相比,.能够明显 诱导.蛋白的表达,然而在/鼠中,.的诱导能力被 阻滞。 结论:局灶性脑缺血再灌注后,缺血脑组织中.、.、. 动态表达的变化过程与脑组织损伤程度一致;可上调.的表 达,而.、.表达未受影响,可能与.主要出现在神经分 化的早期,而.主要出现在神经分化的晚期有关;结合第一部分 试验结果,促进.表达与诱导/表达上调存在一致性, 故我们推测熊果酸的促进神经分化作用可能是通过/信号转 导通路发挥作用,从而实现的促神经分化的神经保护作用;而在 鼠脑缺血再灌注模型的研究中,上述推测得到进一步证实, 在旷小鼠中神经分化标注物降低更明显,而促进神经分化的作 用被阻滞,说明/通路的激活是发挥促进神经分化的作用中文摘要 之一,从而实现其神经保护作用。 关键词:熊果酸;缺血再灌注;神经保护;氧化应激;炎症;神 经分化英文摘要 。 。 ‘ 。 ‘ ‘ ‘ 一一 一 一 ? ? 一 /, . , , %,. , % .% % ,./ . ,, , , ? . . . , ,. ,, . , ,,,?..一 . . , 英文摘要一,,,,?, ,’ .? / : ?,?,,/ . :一咆一 /. :, 一 , ., , , , , , . :’ ?. /. .. , . :? : %; % : ? ; : ;:彳,% / .?%; % ;. / .. 英文摘要, .?.: , / ,../一 ? , , ,? .:., , . .. .士. ,..,.士.. .士. ...户 ..尸., .. , . , ? . . ? . :,一. , . 。. , ? . . / ./ :、?., ?/ 英文摘要 . :? ?一 / . : ,也, ., , . , , , , :’./... :? , . : %; % : ; :/ ; :叫’/ . /? %; %; 曲... : , / , 俨../?. ?.,/. , , ,?.士.,.士.,.士.,.士.;?. .士.,.:.,.士.,.:.. ? 丁.英文摘要 : : 也. ?, .?? .?。腑彳. , . ? ?./ ? . .皿 / : .,? 仪,‖ /. :?晓/ . : ,?, . , ,, , , , . :’ . 一 ‘ ‘ ? ’ ’ 一 一‘ ‘ ?一 ’ /. . . . :? , 英文摘要 : %; %:; ?: ;/ :亿叫/ / . ? %; %; ? / .【一. ,? 【一 : ,,? /,尸../ ? ? ., ? ? ?. ,? , , , ? .:.,.. ,? ..,.士.;? .士.,.:.,..,..; 仅一 .. ,..,.士.,.... :?,? ., . . . 谯?.谢 , . ,? 英文摘要 . , / .英文缩写 英文缩写 随 脑梗死 仅.氨基..羟甲基恶唑..丙酸 大脑中动脉闭塞 / 缺血再灌注熊果酸 活性氧簇 超氧化物歧化酶 .... 亿 核转录因子.相关因子 抗氧化反应元件碱性亮氨酸拉链互补脱氧核糖核酸 碱基对 二甲基联苯胺 焦炭酸二乙酯 们 英文缩写 脱氧三磷酸核糖核酸 乙二胺四乙酸 心入 丫.氨基丁酸 谷氨酸谷光甘肽一转移酶 : 醌氧化还原酶 . 血红素氧合酶. 样受体 活性氮物质印 模式识别受体结合蛋白 . 一 髓样分化蛋白神经微丝 微管 微丝轻链 英文缩写 中链 重链 ? 微管相关蛋白 研究论文 熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用及其相关 信号转导机制研究 引 言 脑血管疾病是继恶性肿瘤、心脏病之后,导致全球人口死亡的三大原 因之一。根据最新的流行病学资料显示,在我国国民的死亡原因统计中脑 血管病居第二位,约占.%,每年新发脑血管患者.万人,死亡 .万人,存活者中约%致残,年内复发率高达%,严重影响着患 者的生活质量。脑血管病中以脑梗死 ,最为常见,其 发病率高、致残率高、病死率高,复发率高的特点给患者家庭和社会带来 沉重的负担,且近年来有年轻化的趋势,因此,脑梗死后如何减轻神经细 胞损伤及死亡是临床面临的重要课。 随着现代免疫学和分子生物学的迅速发展,认为脑缺血再灌注损伤 的病理生理机制是一种损伤级联反应,主要包括兴奋性氨基酸毒性、氧化 应激、凋亡、细胞内钙超载、自由基损伤、炎症细胞因子损害等【‘】。这 几种因素相互作用、相互影响,构成了一个复杂的调控网络,形成恶性循 环,最终导致细胞凋亡或坏死。梗死灶可以分为两个不同的区域:核心层 和外层的半暗带。在缺血核心,神经细胞死亡是即刻的,但半暗带作为适 度低灌注的一个区域,是神经保护剂治疗的目标,其目的是使半暗带区神 经细胞保留完整结构,减轻异常代谢的紊乱,防止或延迟神经细胞死亡。 理论上,这一级联反应过程可被神经保护剂阻止,然而,在临床试验中已 有的许多神经保护剂大都无效或因药物不良反应而提前中止。由于缺血级 联反应大多为多种病理因素相互作用构成的级联损伤,因此通过一种神经 保护剂阻断缺血级联反应的各个环节是不可能的,缺血级联反应的每个环 节都可能成为神经保护治疗的靶点,但达到治疗目的的同时也势必增加病 人的输液量,加重病人的经济负担,如果寻找具有多重保护的作用靶点, 从而开发治疗药物,必能提高脑梗死的治疗效果,减少用药种类,减轻病 人的经济负担,因此寻找能针对多个发病环节的神经保护剂用于临床将成 为今后脑缺血治疗的方向。 熊果酸 ,是存在于天然植物中的一种五环三萜系研究论文 化合物,分子式为:,主要存在于熊果、夏枯草、铁冬青等植 物中。研究表明具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗凋亡、增强免疫功 能等多种生物学作用【她】。国外学者研究报道【】,.主要成分 为五环三萜系化合物可以上调水平,并诱导其向核内转移,发挥其 抗氧化作用。且具有低毒、价廉的特点,如果能证实其为理想的神经 保护剂应用于临床,将具有重要的临床意义,目前有关在缺血再灌注 损伤中的研究和应用鲜有报道。 基于此,本研究通过线栓法建立小鼠大脑中动脉闭塞 巧,的局部脑缺血/再灌注模型,观察熊果酸对局灶性 脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,并探讨其可能的作用机制及信号通 路,为临床进一步阐明脑缺血再灌注损伤的机制和保护脑组织,防止引起 继发性脑损伤的治疗奠定基础,试图寻求具有“一个靶点,多重保护作 用的药理作用靶点,也为的开发及临床应用提供理论基础和实验依据。研究 论文 第一部分 熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗氧化作用及 其相关信号转导机制研究 .?上,?量 莉 菁 局灶性脑缺血再灌注损伤后,活性氧 , ,的 产生增加,远远超过了超氧化物歧化酶 抗氧化能力,同时,和脂质过氧化物也明显增加,抗氧化物谷光甘肽 则下降。在缺血性脑损伤中,氧化应激不但可以直接损伤细胞,导致 细胞坏死,它还可以通过介导线粒体途径、修复酶及转录因子等间 接导致细胞凋亡。核转录因子.相关因子.. , 是细胞氧化后应激反应中的关键因子,是细胞抗氧化反应的中枢调节者, 通过与抗氧化反应元件 ,相互作用 调节抗氧化蛋白和相解毒酶的表达,发挥其抗氧化作用。 在缺血性脑血管疾病的研究中,动物模型是研究缺血性脑损伤必不可 少的方法。大脑中动脉闭塞 ,的 局灶性脑缺血/再灌注模型是体内评价脑保护剂的重要模型,也是目前被 认为最接近于人类脑卒中的模型。通过闭塞大脑中动脉,使其供应区的血 流短暂性减少或缺无,造成脑组织缺血缺氧,产生损伤级联反应,以致使 脑细胞发生坏死或凋亡,其发病过程和机制与临床局灶性脑缺血相似。该 模型可以动态观察缺血脑组织的病理变化,并用来评价神经保护药物的作 用。 本部分我们采用线栓法成功建立了小鼠局灶性脑缺血再灌注模型,以 作为干预药,通过对神经功能缺失评分,脑梗塞体积评价,病理学改 变观察,,和抗氧化酶.的表达情况,了解缺血介导的脑组 织损伤过程中/信号通路的作用,从氧化应激的角度探讨脑组织 缺血损伤的可能机制,有助于深入揭示脑梗死的病理生理机制,并将 ,晓/冱通路作为一个新靶点,为治疗脑梗死的有效性提供理论基 础和实验依据。研究论文 材料与方法 材料 .试剂 石家庄第四制药厂 生理盐水 天津化学试剂有限公司 氯化钠 球~】 天津化学试剂有限公司 无水乙醇 天津市永大化学试剂开发司 二甲苯 /’。? 多聚甲醛 天津化学试剂有限公司 磷酸氢二钠 天津市永大化学试剂开发司 天津市永大化学试剂开发司 磷酸二氢钠 天津市永大化学试剂开发司 磷酸二氢钾 天津化学试剂有限公司 柠檬酸 天津化学试剂有限公司 柠檬酸钠 天津化学试剂有限公司 氢氧化钠 天津市标准科技有限公司 氯仿 天津市标准科技有限公司 异丙醇 水合氯醛 北京中杉生物有限公司 天津市光复精细化工研究所 ?甲基乙二胺 天津市光复精细化工研究所 胺四乙酸二钠 碱 天津市光复精细化工研究所 焦炭酸二乙酯 美国公司 硼酸 美国公司 琼脂糖 美国公司 美国公司 核酸染料 美国公司 逆转录酶. 美国公司 酶抑制剂 美国公司 美国公司 聚合酶 美国公司 随机引物 美国公司研究论文 溴酚兰 美国公司 天津化学试剂三厂 硼酸 天津化学试剂三厂 三羟甲基氨基甲烷 北京公司 . 美国公司 丙烯酰胺 美国公司 北京华美生物工程公司 .’.亚甲基双丙烯酰胺 十二烷基硫酸钠 美国公司 美国公司 过硫酸铵 北京华美生物工程公司 四甲基乙二胺 北京华美生物工程公司 .巯基乙醇 北京化学试剂公司 甘氨酸 北京华美生物工程公司 甘油 北京化学试剂公司 甲醇 美国公司 美国公司 苯甲基磺酰氟 美国公司 脱氧胆酸钠 美国公司 美国公司 . 膜 美国公司 黑龙江完达山乳业公司 脱脂奶粉 . 北京华美生物工程公司 美国公司 蛋白 美国公司 羊抗兔荧光二抗 美国公司 羊抗鼠荧光二抗 英国公司 兔抗多克隆抗体 美国公司 兔抗.多克隆抗体 南京建成生物工程研究所 检测试剂盒 美国 公司 鼠抗多克隆抗体 上海博蕴生物科技有限公司 熊果酸研究论文 ,,.三苯氯化四氮唑 美国公司 美国公司 .仪器 光学显微镜 日本公司 显微照相仪 日本公司 图像分析系统软件 美国公司 石蜡切片机 德国公司 微量移液器 德国公司 扩增仪 德国公司 全自动凝胶成像系统 英国公司 双色红外荧光成像系统 美国.公司 ?型电泳仪 北京市六一仪器厂 .型电泳槽 北京市六一仪器厂 冷冻高速离心机 德国公司 美国.公司 .多功能酶标仪 .自动双纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂 微波炉 格兰仕集团有限公司 型蒸气消毒器 山东新华医疗器械厂 电子天平 上海精天电子仪器有公司 超净工作台 江苏苏净集团 制冰机 日本公司 超低温冰箱 美国公司 漩涡混合器 上海医科大学仪器厂 超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物公司 蛋白定量试剂盒 美国公司 弋仁马 厶” .主要溶液配置 %多聚甲醛 调整.. . 多聚甲醛 研究论文 至 双蒸水 . 调整. . . 至 双蒸水 . 调整. . . . 至双蒸水 水:将去离子水 ,磅高压灭菌 ,加 液 ,过夜,再次 磅高压灭菌,备用。 . ,充 ,硼酸. ,加高压后的双蒸水 。 分溶解后,加.. : 。 加 , ,微波炉中中火加热 %琼脂糖:.琼脂糖加 。 晾至时加 . :? . . ,? , . 。 ,加双蒸水至 .。 :. 加 . .电泳缓冲液: , 的甘氨酸,加 溶于双蒸水 中。使用时用双蒸水倍稀释。 . 转膜缓冲液: ,甘氨酸. , 溶于双蒸水 。 “中。使用时取 ,加入甲醇,加双蒸水至 .,加双蒸水至 .: . , .。 “,然后用或滴定至 . ,加双蒸水至 . .: , .。 , 然后用或滴定至 %丙烯酰胺:丙烯酰胺 ,甲叉双丙烯酰胺 ,溶于总体积为 双蒸水中,加热至?溶解,补加双蒸水至终体积 ,调研究论文 .,置棕色瓶中保存。 %: 溶于 双蒸水中,加热至?,补加双蒸 水至终体积 ,分装后?保存。 . 中。 封闭液:. 脱脂奶粉溶于 , . :? .. 上样缓冲液 , 溴酚蓝. ,甘油. ,加双蒸水至扯/份,分装成份备用,室温 保存,用前每份 .巯基乙醇。 .实验动物 健康成年雄性.小鼠,体重一 ,购自北京维通利华试验动 物技术有限公司,为清洁级动物,购入后由动物室饲养员管理,以标准饲 料喂养并饮用纯净水,饲养环境为我院动物实验中心多层层流架河北省 石家庄市长风净化设备厂,河北省实验动物研究中心监制,恒温 ?。所有动物实验参照中华人民共和国科学技术部颁布的实验动物管理 条例,.执行。 .动物分组 试验:采用随机的方法将.小鼠分为组:假手术组, 、 、 、 、 手术组,每组又根据不同的时间点分为 五个亚组。 试验:采用随机的方法将.小鼠分为组: 假手术组:假手术后腹腔注射等量%。 手术组:缺血再灌注术后腹腔注射等量%。 小剂量熊果酸干预组.:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸 /。 大剂量熊果酸干预组.缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸 /。 试验:采用随机的方法分别将吒广、/鼠分为组: 假手术组:假手术后腹腔注射等量%。 手术组:缺血再灌注术后腹腔注射等量%。 大剂量熊果酸干预组.:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸 /。 方法研究论文 .动物模型的制备 模型组:小鼠称重后,计算水合氯醛的腹腔注射量 /, 抓起小鼠颈背部皮肤使其腹部朝上,适量水合氯醛注射到小鼠腹腔进行麻 右侧大脑 醉。参照 】和】等的线栓法制作短暂性 ,的动物模 中动脉闭塞. 型。将小鼠成功麻醉后,仰卧位固定小鼠,颈部正中去毛,%酒精消毒, 颈部取长度约. 正中切口,沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜,注 意勿伤及气管两侧甲状腺及其外上方甲状旁腺,见到搏动的颈总动脉时仔 细分离血管表面膜组织,避免过度牵拉或离断血管,在颈总动脉近心端置 一丝线以备用,继续向上分离血管以及与血管伴行的神经,注意动作轻柔 避免损伤迷走神经,在甲状腺水平可见颈总动脉分出颈外动脉和颈内动 脉,分离颈外动脉近心端长度 ,备一丝线用于结扎,电凝血管小 分支以防出血。沿颈内动脉继续向颅底方向分离,可见血管在到达鼓泡处 略为膨大并发出一较大分支即翼腭动脉,结扎位于颈外动脉近心端的丝 线,使用微小动脉夹暂时夹闭颈内、颈总动脉,在颈外动脉上用显微手术 剪剪一切口,测量该切口至颈内动脉与颈外动脉分叉处的距离一般为 ,将制备好的栓线线体直径. ,长约. 的尼龙鱼线, . 头端呈球形,头端直径. 姗,距头端.. 处做一标记 插入,在颈外动脉剪口处打一松结以阻断颈内动脉的血液反流,去除颈内 动脉的微动脉夹,将线从颈外动脉插入,进入颈内动脉的颅内段,进线长 . 度约为距颈总动脉分叉处. ,此时进线有轻微阻力,栓线正好 后,拔出尼龙 插至颅内的大脑前动脉,堵住大脑中动脉的开口。阻断 线栓,扎紧动脉残端,缝合皮下组织和皮肤,完成脑缺血再灌注损伤模型。 为避免感染,缝合前在手术局部使用庆大霉素,消毒缝合颈部皮肤。术中 。 及术后用白炽灯照射动物以维持其肛温在?,直到恢复活动【 假手术组,除不插入尼龙鱼线外其余操作同模型组。 各组小鼠手术完成之后,放入洁净饲养笼中,在?恒温条件下 饲养,自由进食水,根据实验,各组小鼠在相应的时间点评分、处死、 取材。 .动物模型的评价 成功标准:?右侧肢体疼痛回缩迟钝或消失;?倒悬时左上肢向胸前研究论 文 屈曲;?行走时身体向右侧倾倒或向右转圈;?右侧出现’症。 排除标准:模型制备完后大鼠虽然有脑缺血症状,但有下列情况之一 者不纳入: 神经学症状评分低于分者评分标准见.; 出现蛛网膜下腔出血者; 镜下观察无缺血病理改变者; 未到观察时间点死亡者。 .神经功能缺失评分 】的级分法,在动物麻醉清醒后 进行评分并记 参考 录神经功能缺失症状,评分标准如下: 分:无神经损伤症状; 分:提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直; 分:行走时向瘫痪侧转圈; 分:行走时向病灶对侧跌倒; 分:不能自发行走,意识丧失。 神经症状评分采用单盲法,即观察者不知实验分组。 .脑梗死体积测定 再灌注 后,每组取只小鼠,断头处死,完整取出脑组织,将 大脑均匀切成片冠状切片。脑片浸入%溶液,?恒温水浴中 孵育 染色,染色后取出于%多聚甲醛中固定 后,数码相机 摄像,利用图像分析软件 .,测定脑梗死面积和脑 梗死体积红色区域为正常脑组织,苍白色区域为梗死区。应用 等的计算纠正水肿:矫正梗死体积百分比矫正梗死体积/非缺血 侧半球体积×%。 .常规苏木精.伊红染色 ..标本取材 缺血再灌注 后,以%水合氯醛 /麻醉,剪开胸腔, 暴露心脏,从心尖处插入灌注针至左心室,并剪开右心耳形成灌注液排除 通道,从左心室快速灌注生理盐水 ,然后以%多聚甲醛 左右灌注固定,于 左右灌注完毕,迅速取脑置于%多聚甲醛中 固定 以上,但不超过 ,经固定和石蜡包埋后,获得的组织切片行研究论文 以上叶. 染色。操作步骤为:%多聚甲醛液体中固定 缓冲液冲洗 次%、%、%、%酒精依次梯度脱水一 二甲苯透明. 次浸蜡 石蜡包埋。包埋好的组织蜡块 在石蜡切片机上进行连续切片,片厚约为 .,相邻切片分别予以 染色。 .. 染色步骤 二甲苯脱蜡 次一梯度酒精脱蜡至水一自来水清洗片刻苏 变红 变蓝自来水清洗 %盐酸酒精分化 木精 %氨水反蓝约 变红后迅速放入自来水冲洗终止 一自来水清 自来水清洗 洗 梯度酒精脱水一二甲苯透明 一伊红 晾干、中性树胶封片。观察脑组织中炎细胞浸润情况。 . 的测定 ..取材 每组取只小鼠,于再灌注后相应时间点断头取脑,于冰上分离缺血 侧皮层脑组织,在冰浴匀浆器中迅速研磨,组织置冻存管备用。 ..原理 脂质过氧化物的主要降解产物之一是丙二醛,可与硫代巴比妥酸发生 处有最大吸收峰。 反应,生成紫红色的物质,该物质在 ..操作步骤 试剂的组成与配制 试剂 .% 试剂硫代巴比妥酸与%冰乙酸配制成.%的溶液 试剂正丁醇吡啶 标准品 /四乙氧基丙烷 ..操作研究论文 混匀,试管口用保鲜薄膜扎紧,刺一小孔,。水浴 ,取出后流水 冷却,然后转/分离。 ,取上清液加入孔微滴定板,于 ,蒸馏水调零、光径校正,测各管吸光度。 ..公式计算 含量/测定管吸光度一标准空白管吸光度/标准 / 管吸光度一标准空白管吸光度× .组织荧光化学染色 缺血再灌注 后,以%水合氯醛 /麻醉后,剪开胸 腔,暴露心脏,从心尖处插入灌注针至左心室,并剪开右心耳形成灌注液 排除通道,从左心室快速灌注生理盐水 ,然后以%多聚甲醛 左右灌注固定,于 左右灌注完毕,迅速取脑置于%多聚蔗糖 溶液中固定 以上,切片前浸泡于%多聚甲醛溶液直至下沉,切片厚约 阻断非特异性染色,兔 岬,.冲洗次,%马血清/ 多克隆抗:抗体,小鼠多克隆抗:抗体含 .%.在?摇床过夜,次日洗 ,加入荧光二抗抗 小鼠、抗兔;和染料? ,避光洗 , 激光共聚焦显微镜观察、照相。 .实时定量. , . ?流程 ..目的基因引物的合成 引物由上海生物工程公司合成,引物序列如下: : 扩增产物的全长为 ,引物序列为: 上游’..’ 下游’..’ .: 扩增产物的全长为 ,引物序列为: 上游’..’ 下游.’ :扩增产物的全长为 ,引物序列为: 上游’.., 下游’..’ ..标本的留取研究论文 各实验组动物于相应时间点断头处死,无菌操作下取梗死侧皮层脑组 织,快速称取 ,置冻存管中放入液氮保存待用,用于抽提总 ..组织总提取 取组织 ,按下列程序提取总 上 及 在冰浴匀浆器中加入 组织,迅速研磨 将匀浆液分装于个管中, 上 氯仿 加入. 剧烈震摇 ,冰上放置. 上 , , 取上层水相转移至另一管中,加等体积的异丙醇,轻轻混匀 . 放置 以上 上 , , 弃上清,加 %乙醇轻轻混匀 , , 上 叩干,加 处理的去离子水溶解沉淀,. 保存备用。 ..提取的完整性检测 、 ,经%琼脂糖凝胶电泳检测,明显可见 取溶液 条带,且 为 条带的两倍, 条带较弱,且弥散,表明降 解较少,完整性良好。用型紫外分光光度计分别测定与, /比值在...之间,表明提取的蛋白污染很少,因此 可于后续反转录反应。 ..提取的定量 用型紫外分光光度计测量/比值,可检测的纯 度和含量,选用/比值为...的用作反转录。研究论文 含量采用紫外分光光度计检测法。 例如:取总提取液.此,用去离子水倍稀释,用紫外分 光光度计测.,. 提取液中纯度/./.. 提取液中含量稀释倍数 .. ‖ .. 第一链合成 第一链合成反应液组成如下表: ..: , ?., , ,. ,反转录 灭活反转录酶。 ..荧光定量检测:, 反应液组成如下表:研究论文 ,? 热循环参数:? ,然后三步反应:? ,? ,进行个循环,于每个循环的第三步? 收集荧 光信号。 ..实时荧光定量结果分析 扩增完毕后,进入结果分析界面,以为内参照基因,与对照 组相比,得到目的基因表达的相对定量值值,我们将值用于统 计分析。 . .分析 ..组织蛋白质提取 每组取只小鼠,于再灌注后相应时间点断头取脑,于冰上分离缺血 侧皮层脑组织,置冻存管中放入液氮,再转移到.?冰箱保存,用于提 取总蛋白。将样本剪碎,按倍体积加入总蛋白提取液,如样本 配制 , 。离 山蛋白提取液。组织经超声匀浆破碎,。放置 心 ,取上清,分装后.?冻存,待实验用,用试剂盒测定蛋白浓 度。 .. 法检测蛋白表达 制备不连续.聚丙烯酰胺凝胶%浓缩胶和%分离胶,灌满 后将梳子插入浓缩胶中,待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖 直向上轻轻将其拔出,用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。取各组 总蛋白 ,使蛋白充分变性, ,与等体积上样缓冲液混合,煮沸 。 ,上样于凝胶加样孔内。浓缩胶上所加电压为 离心 ,当染料前沿进入分离胶后电压改为,溴酚兰移动至胶底部时 终止电泳,时间约为分钟。电泳完毕,剥胶,按蛋白切胶, 将三层滤纸、膜、胶、及另外三层滤纸在转膜缓冲液中浸泡 后并依次从正极向负极叠放,在。条件下 恒压转膜 ,将凝胶 上的蛋白质转移至膜。用丽春红染膜 ,去离子水 ,同时加入 漂洗脱色,鉴定转膜效果。%脱脂奶粉室温封闭膜 兔抗多克隆抗体:,封闭液稀释和兔抗.多克隆抗体 :,封闭液稀释,?孵育过夜,洗膜次,每次 ,同 , 时加入羊抗兔荧光抗体抗体:,封闭液稀释,?孵育 洗膜次,每次,洗膜 。远红外荧光扫描研究论文 成像系统扫描并测定目标带单位密度。扫描完毕后,用洗膜液洗膜次, 每次 ,加入鼠抗多克隆抗体:,封闭液稀释。孵 育过夜,洗膜次,每次 ,加入羊抗鼠荧光抗体:, 。 封闭液稀释,孵育. ,洗膜次,每次,洗膜 化学发光,显影,定影后远红外荧光扫描成像系统扫描并测定目 标带单位密度,检测:,封闭液稀释的表达做为参照,/ 或./的比值代表各组的蛋白相对表达水平。 .统计学处理 采用 .统计软件进行统计学分析,各项检测结果均以 土...表示,多组数据比较采用方差分析,并进行方差齐 性检验;当方差分析有显著性差异时,进一步用检验作两两比较,当方 差不齐时,采用非参数的秩检验,检验水准取.,当.时有 统计学意义。 结 果 对局灶性脑缺血再灌注小鼠神经功能缺失的影响 结果显示:组神经功能评分明显高于组,说明大脑中动 脉缺血再灌注后造成了明显的神经功能缺损;?和.处理后,? 组神经功能评分明显低于组尸.,.组与组相比, 可降低神经功能评分,但无统计学意义尸.见..,., 提示能够改善局灶性脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失。 对局灶性脑缺血再灌注小鼠脑梗死体积的影响 如图..结果所示,组小鼠脑组织染色表现为均匀一致 的红色,而组缺血再灌注侧脑组织染色出现大范围苍白色梗死 区域。与组相比,.组梗死体积明显缩小,差异有统计学意义 尸.,而.组可缩小梗死体积但无统计学意义.见 ....,提示能够减轻局灶性脑缺血再灌注损伤后的梗死体 积从而产生脑保护作用。 组织学观察 .局灶性脑缺血再灌注小鼠不同时间点组织学观察 光镜观察:假手术组在各个时间点均未见明显病理学改变,其余各实研究论 文 ,可见神经元细胞水肿,细胞核浓染, 验组与假手术组相比,梗死后 固缩,局部可见少量散在单核淋巴细胞浸润;梗死后 ,梗死周围组织 明显水肿、坏死,炎性细胞浸润以单个核细胞为主,并可见少量中性粒细 胞,部分神经元水肿变性、坏死;梗死后 ,梗死周围脑组织高度水肿, 液化坏死,脑组织疏松,细胞外间隙增大呈网状,有大量炎细胞浸润,以 分叶核的中性粒细胞为主,成群分布,神经元明显变性坏死固缩,缺血再 灌注后 ,上述改变逐渐减轻见..。 对局灶性脑缺血再灌注小鼠脑组织代谢的影响 活性氧的主要代谢产物为,其含量与体内自由基总体水平 后小鼠缺血侧脑组织匀浆中 呈正相关。与组相比,组 的含量明显升高,而处理组缺血侧脑组织含量低于 组,其中以.组降低最为明显,差异有统计学意义尸.见.., .,而.组较组减低,但无统计学意义.,表 明可通过降低的含量减轻局灶性脑缺血再灌注损伤,而产生脑保护 作用。 激光共聚焦显微镜观察对核转位影响 组可观察到部分核转位,各剂量干预后均可诱导 核转位增加,其中以.组更明显,而.组诱导核转位能力较 .组稍差见..。 及其二相酶.的基因水平变化 .缺血再灌注小鼠脑组织中、.基因水平的动态改变 的 .方法动态观察缺血再灌注脑组织中及. 表达,各实验组各时间点、. 值表明:各实验组各时间点 也、. 均表达,与组相比组各时间点、 . 表达均明显升高,且在 达高峰,持续到 ,差异有统 、. 计学意义尸.,自 开始, 表达逐渐减低, 至第天时基本恢复至 水平见....,.。 的影响 .删缺血再灌注小鼠脑组织中、. 缺血再灌注 后,.的结果显示各剂量均能够增强 亿、.的基因表达,且.组与组相比,、. 表达明显增加,差异有统计学意义.;而.组可增加、研究论文 . 表达,但差异无统计学意义户.见..一... .。 及其二相酶.的蛋白水平变化 .缺血再灌注小鼠脑组织中、.蛋白水平的动态改变 是脚信号转导通路的关键分子,核转位水平的高低 则反映出该信号转导通路的活化程度。.的结果显各时间点 均有核蛋白及.的表达,与组相比组核蛋白 及.自 开始升高,在 达高峰,持续到 ,自 开始,、 . 表达逐渐减低,至第天时基本恢复至 水平见..。 . 对缺血再灌注小鼠脑组织中、.蛋白的影响 再灌注 后,的结果显示,各剂量干预均能 够明显诱导的核转位,增加.的蛋白表达,且.组与 组相比,核转位,.蛋白表达明显增加,而.组可增加 核转位,.蛋白表达。该结果提示,可以通过调节的核转 位实现抗氧化的作用见..。 . 对斗小鼠缺血再灌注后脑组织中、.蛋白表达的影响 再灌注 后,.的结果显示,在/鼠中,与 组相比,.能够明显诱导核蛋白、.蛋白表达,与我 们所预期的一致,在叱广小鼠中,.的诱导能力被阻滞,而且神经 功能缺失评分更严重见..,..,.。