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肺纤方颗粒对盐酸平阳霉素致肺间质纤维化大鼠血清转化生长因子β1和血小板衍生生长因子的影响

2017-09-26 13页 doc 35KB 68阅读

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肺纤方颗粒对盐酸平阳霉素致肺间质纤维化大鼠血清转化生长因子β1和血小板衍生生长因子的影响肺纤方颗粒对盐酸平阳霉素致肺间质纤维化大鼠血清转化生长因子β1和血小板衍生生长因子的影响 肺纤方颗粒对盐酸平阳霉素致肺间质纤维 化大鼠血清转化生长因子β1和血小板衍生 生长因子的影响         &nb sp;          作者:张伟, 姜良铎, 张晓梅, 吴建军, 邓媛, 鲁香凤 【摘要】  观察肺纤方颗粒抗大鼠肺间质纤维化的作用...
肺纤方颗粒对盐酸平阳霉素致肺间质纤维化大鼠血清转化生长因子β1和血小板衍生生长因子的影响
肺纤方颗粒对盐酸平阳霉素致肺间质纤维化大鼠血清转化生长因子β1和血小板衍生生长因子的影响 肺纤方颗粒对盐酸平阳霉素致肺间质纤维 化大鼠血清转化生长因子β1和血小板衍生 生长因子的影响         &nb sp;          作者:张伟, 姜良铎, 张晓梅, 吴建军, 邓媛, 鲁香凤 【摘要】  观察肺纤方颗粒抗大鼠肺间质纤维化的作用~及其对大鼠血清转化生长因子β1,transforming growth factor β1, TGF β1,和血小板衍生生长因子,platelet derived growth factor~PDGF,的影响。:72只雄性Wistar大鼠经气管插管灌注盐酸平阳霉素1 mg/kg复制大鼠肺间质纤维化模型~随机分入模型组、泼尼松组和肺纤方组~每组24只,15只雄性Wistar大鼠经气管插管灌注等体积生理盐水作为假手术组。造模后24 h开始常规灌胃给药~泼尼松组给予醋酸泼尼松5 mg/kg~肺纤方组给予肺纤方颗粒1.25 g/kg~模型组和假手术组给予等体积生理盐水~1次/d。分别于第14、28、45 天取材~假手术组每批5只~其余各组每批8只。检测其肺组织病理改变及血清中TGF β1和PDGF的水平。结果:与模型组和泼尼松组比较~在第45天时病理检测显示肺纤方组肺间质纤维 化的程度较轻,血清TGF β1和PDGF检测结果显示~模型 组大鼠两种因子水平升高~第45天时升高最明显~并高于 假手术组,P<0.05,。肺纤方组与泼尼松组的TGF β1 变化与模型组相似,P>0.05,~两组间TGF β1变化比 较差异无统计学意义,P>0.05,。肺纤方组PDGF水平在 第14天时与其余各组比较显著升高,P<0.01,~然后持 续下降~至第45天与假手术组接近,P=0.792,,而模型组 和泼尼松组PDGF水平皆随时间延长逐渐上升~第45天时均 显著高于假手术组,P<0.01,。结论:肺纤方有一定的减 轻盐酸平阳霉素致大鼠肺间质纤维化的作用~其作用机制可 能与对血清PDGF水平的调节作用有关。 【关键词】  肺纤方颗粒; 肺疾病, 间质性; 肺纤 维化; 转化生长因子β1; 血小板衍生生长因子; 大鼠 Objective: To observe the effects of Feixian Formula, a compound traditional Chinese herbal medicine for treating pulmonary fibrosis, on bleomycin induced pulmonary fibrosis in rats, and its influence on serum transforming growth factor β1 (TGF β1) and platelet derived growth factor (PDGF). Methods: Seventy two male Wistar rats were infused with bleomycin (1 mg/kg) through tracheal intubation to induce pulmonary fibrosis, and they were randomly divided into untreated group (n=24), prednisone treated group (n=24) and Feixian Formula treated group (n=24). Fifteen male Wistar rats of the sham operated group were infused with equivalent normal saline. Twenty four hours after operation, prednisone (5 mg/kg) and Feixian Formula (1.25 g/kg) were given to the prednisone treated group and Feixian Formula treated group respectively by intragastric administration once a day. Equivalent saline was administered to rats of the untreated group and sham operated group. On the 14th, 28th and 45th day, 5 rats in the sham operated group and 8 rats in each of the other three groups were dissected to observe pathologic changes of the lung tissues, and the levels of serum TGF β1 and PDGF were determined by enzyme linked immunosorbent assay. Results: At the 45th day, the degree of pulmonary interstitial fibrosis was lesser in rats of the Feixian Formula treated group as compared with those of the untreated group and prednisone treated group. The levels of serum TGF β1 and PDGF were increased, and were significantly higher than those of the sham operated group, especially on the 45th day (P<0.05). Changes of TGF β1 level in the prednisone treated group and the Feixian Formula treated group were similar to untreated group (P>0.05), and there was no significant difference between the prednisone treated group and the Feixian Formula treated group (P>0.05). PDGF in the Feixian Formula treated group reached the highest level on the 14th day, significantly higher than those of t 1he other three groups (P<0.01). Then it decreased, and was close to that of the sham operated group on the 45th day (P=0.792). The levels of PDGF in untreated group and prednisone treated group were increased depending on time, and were obviously higher than that of the sham operated group on the 45th day (P<0.01). Conclusion: Feixian Formula can relieve bleomycin induced pulmonary fibrosis in rats, and the mechanism of its action may be related to down regulating serum PDGF. Keywords: Feixian Formula; lung diseases, interstitial; pulmonary fibrosis; transforming growth factor β1,platelet derived growth factor; rats     肺间质纤维化是许多不同病因所致 肺间质疾病的共同结局~其发病机制尚不完全清楚~至今没 有理想的治疗方法。本研究使用盐酸平阳霉素,bleomycin A5, BLM,1 mg/kg经气管插管快速灌注的方法复制大鼠肺间质纤 维化模型~研究中药制剂肺纤方颗粒对BLM致肺间质纤维化 大鼠肺组织病理、血清转化生长因子β1,transforming growth factor β1, TGF β1,和血小板衍生生长因子 ,platelet derived growth factor, PDGF,水平的影响。 1  材料与方法 1.1  实验材料 1.1.1  实验动物  清洁级健康雄性Wistar大鼠87只~体质量180,200 g~由北京维通利华公司提供~许可证号为京动许字,1999, 第039号。 1.1.2  主要药品  注射用盐酸平阳霉素~8 mg/支~天津太和制药有限公司生产~批号为050402。肺纤方颗粒剂的制作由北京师范大学教育部资源药物工程研究中心承担~制备工艺符合新药申报要求~药品规格为每剂生药89.5 g~制成25.14 g颗粒~每克颗粒相当于生药3.56 g。醋酸泼尼松片~5 mg/片~天津力生制药股份有限公司生产~批号为0503019。 1.1.3  主要器材  18号套管针、光源、纱布、35度倾斜鼠板、LEICA RM2135石蜡切片机,德国,、LEICA DMLB显微镜,德国,、OLYMPUS全自动显微摄像系统,日本,、Specotrat酶标比色仪,SLT公司,。 1.2  实验方法 1.2.1  造模方法及分组给药  87只雄性Wistar大鼠经腹腔注射10,水合氯醛(3.5 ml/kg体质量)麻醉后仰面固定于35度倾斜鼠板上~将光源直接照射于大鼠咽喉部皮肤表面~左手垫纱布向外向上提起舌头~可见咽喉部有一明显的亮点~从大鼠口腔~右手水平插入18号套管针到达咽喉部时~压低针尾~使针头抬高15,30度~轻轻插入气管~长度约为针长的3/4~拔出针芯。将棉球薄片臵于套管针外口~若棉球薄片随呼吸前后摆动~则说明套管针已经插入气管~若棉球薄片不随呼吸前后摆动~可能套管针误入食道~应立即拔出重新插入。其中72只大鼠按1 mg/kg体质量剂量,1,向气管插管内快速注射2 mg/ml BLM生理盐水溶液~15只假手术组动物注射等体积的生理盐水~注射后继续向气管内快速推注0.3,0.5 ml空气~并立即将大鼠直立旋转~以使药液在双肺内均匀分布。动物清醒后随意进食~将BLM造模组大鼠随机分为模型组、泼尼松组和肺纤方组~每组各24只。造模24 h后开始灌胃给药~1次/d~泼尼松组给予醋酸泼尼松5 mg/kg,药液浓度为0.5 mg/ml,~肺纤方组给予肺纤方颗粒1.25 g/kg,相当于生药4.475 g/kg~药液浓度为0.125 g/ml,~模型组和假手术组给予等量生理盐水。 1.2.2  取材方法  造模后第14天、第28天和第45天分3批取材~假手术组每批5只~其余各组每批8只。取材前24 h禁食不禁水~于末次给药后1 h予10,水合氯醛3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉后仰卧固定于解剖台上分离腹主动脉~用注射器采血~分离血清~臵,30 ?冰箱冻存~备用。取左肺用10%福尔马林固定~常规石蜡包埋~连续切片两张~分别做HE染色和Masson染色。 1.2.3  血清TGF β1和PDGF含量的检测  采用酶联免疫法测定血清TGF β1和PDGF的含量。试剂盒由尚柏生物医学技术北京有限公司提供。 1.3  统计学方法  采用SPSS 11.0进行统计学处理~实验数据采用x〒s表示~组间比较用单因素方差分析~检验水准为α=0.05。 2  结  果 2.1  光镜下肺组织病理学变化  各时间点假手术组大鼠肺组织病理均显示~肺组织结构清晰~肺被膜未见纤维素渗出及炎细胞浸润~肺泡壁完整~肺泡隔无增宽~无肺萎陷及血管壁增厚~支气管腔及肺泡腔内未见炎性渗出物~少数大鼠各级支气管壁及肺泡间隔可见少量炎细胞浸润。模型组造模第14天肺组织可见实变~实变区呈斑片状分布~支气管周围病变尤为明显~且伴有轻度肺水肿和血管周围水肿。肺组织局部可见出血~胸膜下病变牵拉导致胸膜凹陷~肺泡间隔增宽充血~可见炎细胞浸润~以淋巴细胞、单核细胞和组织细胞浸润为主~散在少量的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及浆细胞。局部?型肺泡上皮和细支气管上皮细胞增生~部分肺泡内可见巨噬细胞簇集成团~纤维母细胞及纤维细胞增生。纤维化区可见数量不等的胶原纤维沉积~炎细胞相对较少~可见大小不等的囊性纤维气腔形成~即“蜂窝肺”~部分囊性纤维气腔表面被覆少量支气管上皮细胞~在纤维化区和蜂窝肺区可见呼吸性细支气管、肺泡管以及重建的囊壁内有增生的平滑肌束~残存的肺泡区可见 代偿性肺气肿~肺大泡形成。造模第14天已具备成纤维细胞灶~伴胶原沉积的瘢痕化、蜂窝肺等诊断普通型间质性肺炎或特发性肺间质纤维化的病理改变,2,。造模第28天~上述病变进一步加重~纤维化区增多~面积扩大~可见大量 增生的纤维细胞和胶原纤维沉积~纤维囊性气腔及炎症细胞尤其是嗜酸性粒细胞较第14天明显增多。造模第45天~纤维囊性气腔减少~纤维化程度继续加重~局部可见较多嗜酸性粒细胞浸润~肺泡腔内有大量的巨噬细胞浸润~局部可见陈旧性出血灶。泼尼松组和肺纤方组在用药第14天时~病变程度与模型组相比未见明显差异~第28天时病变达到最重~第45天和第28天时相比病变有所减轻~且肺纤方组胶原沉积、成纤维细胞灶、巨噬细胞灶较模型组和泼尼松组减少~炎性浸润也减轻。 2.2  大鼠血清TGF β1含量  各时间点模型组、泼尼松组和肺纤方组TGF β1水平均显著高于假手术组~差异有统计学意义,P<0.05,。但模型组、泼尼松组和肺纤方组3组TGF β1水平之间比较差异无统计学意义,P>0.05,。同组内各时间点比较差异无统计学意义,P>0.05,。见表1。表1  大鼠血清TGF β1含量,略, 2.3  大鼠血清PDGF含量  第14天~肺纤方组大鼠血清PDGF水平显著高于其他 3组,P<0.01,,假手术组、模型组和泼尼松组组间比较~差异无统计学意义,P>0.05,。第28天泼尼松组和肺纤方组大鼠血清PDGF水平显著高于假手术组,P<0.01,。第45天模型组和泼尼松组PDGF水平显著高于假手术组,P<0.01,,而肺纤方组与假手术组比较~差异无统计学意义,P=0.792,。     同组各时间点比较~模型组第45天PDGF水平与第28天比较~差异有统计学意义,P<0.05,~与第14天比较~PDGF水平升高明显,P<0.01,~呈现出逐渐升高的趋势。泼尼松组PDGF水平第45天与第28天比较无变化,P=0.227,~与第14天比较~差异有统计学意义,P<0.05,~也呈现逐渐升高的趋势。肺纤方组PDGF水平随时间延长逐渐下降~但差异无统计学意义,第45天与第28天比较~P=0.754,第45天与14天比较~P=0.058,。从其变化趋势可以看出模型组和泼尼松组PDGF水平逐渐升高~而肺纤方组PDGF水平却是从一个较高的水平逐渐下降~与模型组和泼尼松组变化趋势相反。见表2。表2  各组大鼠血清PDGF含量,略, 3  讨  论    本实验研究结果显示~BLM诱导的肺间质纤维化大鼠 模型的肺组织病理与假手术组比较有典型的间质纤维化改变,同时血清TGF β1水平在3个时间点也均显著高于假手术组,大鼠血清PDGF水平随时间延长而逐渐升高~第45天时模型组PDGF水平显著高于假手术组。可见BLM诱导的肺间质纤维化大鼠的血清TGF β1和PDGF水平均显著高于假手术组。在肺间质纤维化的发生机制中~TGF β1和PDGF是与纤维化形成密切相关的细胞因子,3 6,~研究表明二者是促进纤维化形成的重要细胞因子~在多个环节与其他因素一起起到促纤维化形成的作用~且二者相互作用~如PDGF可以促进TGF β1表达~增殖期TGF β1也可以通过诱导PDGF的分泌而促进增生。TGF β1参与纤维增殖性病变如动脉硬化和肺间质纤维化~是间叶细胞分化的重要调节因素~是强效的致纤维化因子~在肺间质纤维化发生发展中的多个环节起作用,6,。TGF β1对间叶细胞的增殖作用具有双向性。在肺泡纤维化的增殖期~TGF β1可通过诱导自分泌PDGF而促进纤维增生,随着气腔充满~TGF β1可以直接通过下调细胞周期蛋白依赖激酶2和4导致细胞周期停止。TGF β1能够诱导产生PDGF α受体~从而使PDGF的作用放大,7,。PDGF也是与纤维化形成有密切关系的一种细胞因子。如Melleni等,8,发现PDGF对成纤维细胞具有强烈的趋化作用和致有丝分裂活性~能促进?型肺泡上皮细胞DNA的合成~并使细胞数增加~加入抗PDGF、抗胰岛素样 生长因子1,insulin like growth factor 1, IGF 1,及抗成纤维细胞生长因子,fibroblast growth factor, FGF,抗体则会明显减弱这种作用。肺脏成纤维细胞一旦游走到肺泡腔~则对一系列的促增殖信号有反应~PDGF就是其中一个影响因素~结果导致成纤维细胞群增加~肺泡 毛细血管单位部分或完全消失。成纤维细胞对PDGF的反应取决于其表面受体的多少~和丝氨酸激酶家族的生长因子受体一起~配套结合导致受体二倍聚合、自我磷酸化以及出现信号传导。研究表明~PDGF不仅能促进分离的大鼠成纤维细胞增殖~而且使其?、?、?型前胶原合成增加~可能的调控机制是在转录水平上增强前胶原mRNA表达,9,~PDGF是成纤维细胞增殖的获能因子~还可调节细胞外基质的合成与降解~刺激成纤维细胞产生胶原酶~造成间质胶原断裂~从而导致胶原排列紊乱。     本研究中各时间点模型组、泼尼松组与肺纤方组的TGF β1水平均高于假手术组~但各时间点3组之间比较~差异无统计学意义~同组内各时间点比较~差异亦无统计学意义。血清PDGF含量方面~模型组和泼尼松组均随时间的延长逐渐升高,P<0.01,,且两组第45天的PDGF水平均显著高于假手术组,P<0.01,,而肺纤方组却表现为第14天时血清PDGF含量显著高于其他各组,P<0.01,~然后 逐渐下降~第45天与第14天比较~PDGF含量下降~但差异无统计学意义,P=0.058,~与假手术组比较~差异亦无统计学意义,P=0.792,。这一结果显示出肺纤方作用机制的复杂性。文献报道多认为PDGF是促进纤维化形成的重要细胞因子~而在肺纤方的干预下~BLM致肺间质纤维化大鼠的PDGF呈现先升高后下降的趋势~推测肺纤方抗肺间质纤维化的作用与对PDGF的调节作用有关~但是肺纤方究竟是如何调节PDGF以及如何发挥作用等问题尚不得而知~或许其中有更深层次的机制有待研究。PDGF是一种和纤维化形成关系密切的细胞因子~不仅参与了肺脏和血管的病理性纤维增殖性病变~同时也参与了生理性伤口愈合过程,6,。BLM致肺间质纤维化模型在早期表现为肺急性损伤~肺脏有肿胀、出血等表现~肺纤方在早期能主动调节PDGF水平~使其升高~从而促进其参与血管重建~这对伤口的愈合或许是有益的,而在后期~肺组织逐渐出现纤维化改变~而此时肺纤方则使PDGF水平下调~可能与其抗肺间质纤维化作用有关。     从中医角度认识肺间质纤维化的病因病机~我们认为反复外感、环境毒邪、肺气亏虚与肺间质纤维化的发病有着密切的关系。肺肾亏虚、肾不纳气、气虚血瘀、痰瘀痹阻肺络是肺间质纤维化 的基本病机~内伤基础上的外感将加重病情进展~该病急 性加重期以阴亏痰热为主~缓解期以肺肾亏虚、痰瘀阻肺为主~治疗方法重在补益肺肾、纳气平喘、益气活血、化痰通络。肺纤方全方以冬虫夏草为君药~补益肺肾~纳气平喘~扶正固本~由于冬虫夏草稀有昂贵~故使用人工培育的菌丝粉替代,配伍黄芪益气活血~红景天健脾益气、清肺止咳、活血化瘀~银杏敛肺定喘、祛湿化痰、活血化瘀~三药为臣共奏补气活血、化痰平喘之功,佐以栝蒌理气宽胸散结~清热化痰~润肠通便~能通利大肠以降肺中痰浊~使肺气肃降~喘息得平,佐以血肉有情之品水蛭以逐瘀消癥以及介类海蛤壳共同加强软坚散结之力~从而攻逐深伏痹阻于肺络的瘀浊痰湿,而使药麻黄乃肺经专药~用之辛通宣散以宣肺平喘、破癥坚积聚。全方攻补兼施~契合肺间质纤维化虚实夹杂的病机~共奏补益肺肾、化痰平喘、活血化瘀、通络散结之效。     总之~肺间质纤维化是一种复杂的疾病~人体也是一个复杂的系统~在中医理论指导下的医疗~正是对疾病状态下出现失衡的人体这一复杂系统的调节。在这种理论指导下组成的肺纤方~其作用机制应该是多方面的~作用方式并不单一~通过现代科学技术研究其作用靶点和环节也应不止一处~而现在我们所做的研究只是其中的一个方面~这或许能够对本研究结果中出现的肺纤方对PDGF的影响表现出复杂性做出一定程度的解释。肺纤方治疗肺间质纤维化的机制仍 需要进一步、多角度地去探讨。 【参考文献】   1 Zhang W, Lu XF, Zhang XM, et al. A rat model of pulmonary fibrosis induced by infusing bleomycin quickly through tracheal intubation. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2008; 6(1): 60 67. Chinese with abstract in English. 张伟, 鲁香凤, 张晓梅, 等. 气管插管快速灌注博 来霉素复制大鼠肺间质纤维化模型. 中西医结合学报.2008; 6(1): 60 67. 2 Yi XH. ATS/ERS classification and pathologic diagnosis of the idiopathic interstitial pneumonia. Zhen Duan Bing Li Xue Za Zhi. 2005; 12(6): 401 404. Chinese. 易祥华. 介绍特发性间质性肺炎的ATS/ERS分类及病 理诊断. 诊断病理学杂志. 2005; 12(6): 401 404. 3 Hou XM, Yu RJ. Interstitial pulmonology. Beijing: People's Medical Publishing House. 2003: 33 35. Chinese. 侯显明, 于润江. 间质性肺病学. 北京: 人民卫生 出版社. 2003: 33 35. 4 Iyer SN, Gurujeyalakshmi G, Giri SN. Effect of pirfenidone on procollagen gene expression at the transcriptional level in bleomycin hamster model of lung fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 1999; 289(1): 211 218. 5 Van Hoozen BE, Grimmer KL, Marelich GP, et al. Early phase collagen synthesis in lungs of rats exposed to bleomycin. 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