响应面法优化植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌冻干保护剂研究（可编辑）

响应面法优化植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌冻干保护剂研究（可编辑） 响应面法优化植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌冻干保护剂 研究 第!" 卷 第# 期 四 川 理 工 学 院 学 报! 自 然 科 学 版" -?!"@?# !$%& 年%$ 月 ’*+,-./012,+3+045*6078./105+159:+;0+55*0+; !,7*,-/105+15:070+" A17?!$%& 文 章 编 号!!"#$%!&’"*!$#*&%**$%*’ +,- !!*.$"/0.1223.!"#$%!&’.*!$.*&.**" 响 应 面 法 优 化 植 物 乳 杆 菌 和 凝 结 芽 孢 杆 菌 冻 干 保 护 剂 的 研 究 王 世 宽$ 洪 玉 程$ 袁 先 铃 ! 四 川 理 工 学 院 生 物 工 程 学 院" 四 川 自 贡 "M&$$$$ 55 摘5 要! 采 用 单 因 素 实 验 和 响 应 面 实 验 设 计 联 用 的 方 法$ 筛 选 优 化 植 物 乳 杆 菌 和 凝 结 芽 孢 杆 菌 真 空 冷 冻 干 燥 的 保 护 剂 配 方% 单 因 素 实 验 结 果 明’ 脱 脂 奶 粉& 麦 芽 糖 和 谷 氨 酸 钠& 种 保 护 剂 效 果 较 好$ 能 够 显 著 提 高 菌 种 对 冷 冻 干 燥 环 境 的 耐 受 能 力% 以 细 胞 存 活 率 为 响 应 值$ 混 合 保 护 剂 的 最 佳 配 方 为 脱 脂 奶 粉V?$"W& 麦 芽 糖"?M"W 和 谷 氨 酸 钠"?V$W$ 植 物 乳 杆 菌 冷 冻 干 燥 存 活 率 达 到D!?D#W$ 凝 结 芽 孢 杆 菌 的 冷 冻 干 燥 存 活 率 达 到DM?%W% 关 键 词! 植 物 乳 杆 菌# 凝 结 芽 孢 杆 菌# 真 空 冷 冻 干 燥# 保 护 剂# 响 应 面 法 中 图 分 类 号!Q/!$%?& 文 献 标 志 码!Y @@ 直 投 式 发 酵 剂 是 一 种 不 需 活 化 和 扩 增 便 能 直 接 应 % 材 料 与 方 法 用 于 生 产 的 新 型 发 酵 剂" 具 有 活 菌 含 量 高 菌 种 保 质 期 长 等 优 点" 也 防 止 了 菌 种 退 化 和 污 染" 提 高 了 发 酵 制 品 !6! 材 料 与 设 备 %%& 工 业 的 劳 动 生 产 率 和 产 品 质 量 ’ 由 于 菌 种 对 热 刺 激 凝 结 芽 孢 杆 菌!D9T.UUAVT@90AU9/V $" 四 川 理 工 学 院 的 敏 感 性" 直 投 式 发 酵 剂 工 艺 上 多 采 用 真 空 冷 冻 干 燥 实 验 室 保 藏# 植 物 乳 杆 菌 !;9T!@R9T.UUAV:U9/!9WAH$" 购 法" 冷 冻 和 干 燥 过 程 中 会 使 部 分 细 胞 损 伤 死 亡 及 某 些 于 四 川 微 生 物 菌 种 中 心#iS/ 固 体 培 养 基#iS/ 液 体 培 %!& 蛋 白 酶 分 子 钝 化 ’ 为 了 提 高 菌 种 冻 干 后 的 存 活 率" 冻 养 基#i’N!#$ 生 化 培 养 箱! 上 海 美 谱 达 仪 器 有 限 公 干 前 加 入 保 护 剂 减 少 冻 干 损 伤 是 必 要 的" 使 其 最 大 限 度 司$#FZ’N$! 冷 冻 干 燥 机! 上 海 久 世 环 保 科 技 有 限 公 %&& 发 挥 保 护 功 能" 提 高 发 酵 菌 剂 的 存 活 率 ’ 不 同 的 保 护 司$#$?!!%H滤 膜! 上 海 海 凡 滤 材 有 限 公 司$#QTFN#[ 剂 各 有 优 缺 点" 单 一 保 护 剂 往 往 不 能 满 足 菌 体 抵 抗 外 界 型 离 心 机! 上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂$’ 恶 劣 环 境 的 条 件" 而 复 配 保 护 剂 中 各 保 护 剂 在 冷 冻 干 燥 !6 试 验 方 法 %M& 中 则 发 挥 各 自 的 特 性 并 能 起 到 增 效 作 用 ’ %?!?% 工 艺 流 程 本 研 究 以 凝 结 芽 孢 杆 菌 和 植 物 乳 杆 菌 为 试 验 菌 株" 菌 种 活 化 富 集 培 养 离 心 收 集 菌 体 加 保 护 剂 # # # 活 菌 计 数 预 冻 真 空 冷 冻 干 燥 冻 干 粉 活 菌 计 采 用 单 因 素 实 验 选 择 几 种 效 果 较 好 的 冻 干 保 护 剂" 再 以 # # # # # 植 物 乳 杆 菌 为 试 验 菌 株" 采 用T560;+N:J^5*7 软 件 的 中 数 心 组 合 设 计 方 法 设 计 响 应 面 试 验 对 几 种 保 护 剂 的 最 佳 %?!?! 试 验 设 计 %#& 水 平 和 交 互 作 用 进 行 研 究 探 讨 " 然 后 对 凝 结 芽 孢 杆 菌 通 过 单 因 素 试 验 确 定 对 细 胞 冻 干 存 活 率 影 响 突 出 进 行 冷 冻 干 燥 实 验" 从 而 筛 选 出 适 用 于 两 菌 种 的 优 良 复 的 几 个 因 素# 然 后 利 用 响 应 面 设 计 方 法 中 的 PJN 合 保 护 剂’ P52+b5+T560;+ 进 行 试 验’ 收 稿 日 期!!$%&B$#B%" 基 金 项 目! 四 川 省 教 育 厅 项 目!11%!I$V"# 四 川 理 工 学 院 研 究 生 创 新 基 金 项 目!8!$%%$!!" 作 者 简 介! 王 世 宽!%D"MB "$ 男$ 重 庆 江 北 人$ 教 授$ 硕 士$ 主 要 从 事 农 产 品 贮 藏 与 加 工 方 面 的 研 究$!:BH,0- "K6b665k665L5L1+!M 四 川 理 工 学 院 学 报! 自 然 科 学 版"@@@@@ @@@@@@@!$%& 年%$ 月 %?!?& 菌 体 制 备 半 胱 氨 酸" 其 中 脱 脂 奶 粉 麦 芽 糖 和 谷 氨 酸 钠 对 两 种 菌 菌 种 以#W 的 接 种 量 接 种 于iS/ 液 体 培 养 基 中" 种 都 有 较 好 的 冻 干 保 护 作 用" 存 活 率 均 能 达 到#$W 以 &$_ 下 培 养%CN!!2" 镜 检 无 杂 菌 后" 等 量 分 装 于 无 菌 上" 进 而 对 这 三 种 物 质 组 成 的 复 配 保 护 剂 的 比 例 做 更 深 入 的 研 究’ 离 心 管 中"M$$$*dH0+"M_ 离 心%#H0+" 弃 上 清 液 收 集 菌 6 响 应 面 优 化 设 计 结 果 与 分 析 体’ 根 据 单 因 素 实 验 结 果" 选 取 脱 脂 奶 粉 麦 芽 糖 和 谷 %?!?M 保 护 剂 的 制 备 氨 酸 钠 为 试 验 因 素" 以 植 物 乳 杆 菌 为 试 验 菌 种" 利 用 预 先 将 脱 脂 奶 粉 麦 芽 糖 蔗 糖 可 溶 性 淀 粉 硫 酸 PJNP52+b5+ 中 心 组 合 设 计" 设 计& 因 素& 水 平 的 响 应 锰 甘 露 醇 谷 氨 酸 钠FN 半 胱 氨 酸 分 别 取 一 定 量 溶 解 曲 面 试 验" 以 存 活 率 作 为 考 核 指 标" 试 验 因 素 与 水 平 见 于%$$HF 无 菌 水 的 试 管 中" 其 中" 氨 基 酸 类 和 糖 类 保 护 表!" 结 果 见 表&’ 剂 溶 液 用$?!!%H孔 径 的 滤 膜 过 滤 除 菌" 其 它 保 护 剂 溶 表 响 应 面 试 验 因 素 与 水 平 液%%#_" 灭 菌%#H0+" 备 用’ 实 验 因 素 水 平 %?!?# 活 菌 计 数 Y 脱 脂 奶 粉 P 麦 芽 糖 [ 谷 氨 酸 钠 平 板 混 菌 计 数 法! 参 照ZPdQMVCD?!N!$$&$’ N% #W "W !W $ %$W DW "W %?!?" 真 空 冷 冻 干 燥 % %#W %!W %$W 在 无 菌 操 作 台 上" 将 离 心 所 得 菌 泥 样 品 用 灭 菌 后 的 表$ 响 应 曲 面 实 验 结 果 保 护 剂 溶 液 冲 洗 到 无 菌 培 养 皿 中" 放 在NC$_ 条 件 下 预 Y 脱 脂 奶 P 麦 芽 糖 [ 谷 氨 酸 存 活 率 实 存 活 率 预 序 号 冻!2" 待 样 品 完 全 冻 结 后 迅 速 转 移 到 冷 冻 干 燥 机 中 冷 粉!Kd4 $ !Kd4 $ 钠!Kd4 $ 测 值!W$ 测 值!W$ % %$ %! %$ C%?! C%?$ 冻 干 燥!M2" 菌 粉 含 水 量&WN#W 即 可 收 获 成 品’ ! # D ! VC?& C$?! !6$ 菌 种 存 活 率 的 计 算 & %$ %! ! VM?# V&?# 冻 干 后 样 品 测 得 的 活 菌 数 M %$ D " CD?C D$?# 存 活 率 " &%$$’ 冻 干 前 样 品 测 得 的 活 菌 数 # %# " " C#?" C"?# " %# D ! V"?V VV?D ! 结 果 与 分 析 V # D %$ CD?& CC?$ C # " " D!?% D!?& 6! 保 护 剂 单 因 素 实 验 D %$ D " D%?! D$?# 根 据 保 护 剂 对 菌 体 冷 冻 干 燥 的 保 护 机 理" 结 合 有 关 %$ %# D %$ CM?V C!?C %"BV& 文 献 报 道 " 选 取 脱 脂 奶 粉 麦 芽 糖 蔗 糖 可 溶 性 淀 %% %$ " %$ C"?M CV?M %! %# %! " C%?! C&?M 粉 硫 酸 锰% 甘 露 醇 谷 氨 酸 钠FN 半 胱 氨 酸 作 为 冷 冻 %& # %! " C&?# C!?" 干 燥 保 护 剂" 以 存 活 率 为 指 标" 考 察 对 凝 结 芽 孢 杆 菌 与 %M %$ " ! CV?$ CM?C 植 物 乳 杆 菌 的 冻 干 保 护 作 用" 结 果 见 表%’ @@ 对 表& 中 数 据 进 行 回 归 拟 合 分 析" 得 出 冷 冻 干 燥 存 表! 保 护 剂 单 因 素 实 验 结 果 活 率 对 脱 脂 奶 粉 麦 芽 糖 谷 氨 酸 钠 冷 冻 保 护 剂 的 二 次 植 物 乳 杆 菌 凝 结 芽 孢 杆 菌 保 护 剂 存 活 率!W$ 存 活 率!W$ 多 项 回 归 方 程 模 型* 脱 脂 奶 粉%$W VC?& C!?# Q"GD$?#$%?CC$&?CMDG&?%M#G%?$#D$ 麦 芽 糖%$W V$?M VM?" ! ! ! 蔗 糖%$W !#?" M!?% $?V##G%?C!D#$!?M"$!?MMD$#?VD# 可 溶 性 淀 粉%$W !!?C &M?V 其 中"Q 为 响 应 值 冷 冻 干 燥 菌 种 存 活 率"D# 硫 酸 锰#W &&?V #"?D 分 别 为 脱 脂 奶 粉 麦 芽 糖 谷 氨 酸 钠 单 位 体 积 溶 质 质 甘 露 醇%$W #!?& MV?" 谷 氨 酸 钠#W #%?! "#?& 量 浓 度’ FN 半 胱 氨 酸#W !&?& %V?" 为 了 检 验 模 型 的 有 效 性" 对 模 型 进 行 方 差 分 析 结 果 ! @@ 由 表% 可 以 看 出"C 种 保 护 剂 对 植 物 乳 杆 菌 的 保 护 表 明! 表M$" 多 元 相 关 系 数 为Sa$?D&MM" 对 方 程 的 系 作 用 影 响 大 小 次 序 为* 脱 脂 奶 粉l 麦 芽 糖l 甘 露 醇l 谷 数 显 著 性 进 行 检 验" 结 果 表 明 各 因 子 系 数 均 有 意 义# 表 氨 酸 钠l 硫 酸 锰l 蔗 糖lFN 半 胱 氨 酸l 可 溶 性 淀 粉# 明 冷 冻 干 燥 存 活 率 的 实 测 值 与 预 测 值 之 间 具 有 较 好 的 对 凝 结 芽 孢 杆 的 影 响 大 小 次 序 为* 脱 脂 奶 粉l 麦 芽 糖 l 拟 合 度#U*f!^$lj 值 并 且o$?$$$% 模 型 显 著" 可 用 来 谷 氨 酸 钠l 硫 酸 锰l 甘 露 醇l 蔗 糖l 可 溶 性 淀 粉lFN 进 行 响 应 面 分 析’第!" 卷 第# 期@@@ 王 世 宽 等’ 响 应 面 法 优 化 植 物 乳 杆 菌 和 凝 结 芽 孢 杆 菌 冻 干 保 护 剂 的 研 究 !# 表’ 响 应 面 法 对 冷 冻 保 护 剂 选 择 的L\,]L 分 析 结 果 因 素 平 方 和 自 由 度 均 方 和 j 值 U 值 显 著 性 模 型 MD%?M$ D !$?%" !"?&& o$?$$$% "" Y DC?%& % DC?%& %%?M& $?$%$& " P %&V?C% % %&V?C% !!?#" $?$$M% "" [ %%C?V# % %%C?V# %C?M% $?$$#! "" YP M%?$V % M%?$V M?M& $?%$&% Y[ !!?!# % !!?!# &?!! $?%#&" P[ "&?&! % "&?&! D?%$ $?$MC$ " ! Y ##?M$ % ##?M$ %V?$" $?$!#& " ! #"?$% % #"?$% %"?$$ $?$!C# P " ! %!V?%C % %!V?%C MM?CD o$?$$$% [ "" 残 差 !#?&D M "?&# 失 拟 !M?M% & C?%M #?&$ 纯 误 差 $?DC % $?DC 总 和 &C"?VD %& @@ 图% 图! 图& 是 由 多 元 回 归 方 程 式 所 作 的 响 应 曲 面 三 维 图 和 等 高 线 图’ 可 以 对 任 何 两 个 因 素 的 交 互 作 用 进 行 分 析 和 评 价" 以 确 定 最 佳 因 素 水 平 范 围’ 图 脱 脂 奶 粉 和 谷 氨 酸 钠 对 冷 冻 干 燥 存 活 率 交 互 影 响 的 等 高 线 图 和 三 维 曲 面 图 图! 脱 脂 奶 粉 和 麦 芽 糖 对 冷 冻 干 燥 存 活 率 交 互 影 响 利 用:J^5*7T560;+V?$ 软 件 以 存 活 率 最 大 值 为 目 标 优 化 出 方 案" 得 出 唯 一 最 优 方 案 为* 脱 脂 奶 粉V?$"W" 麦 芽 糖"?M"W" 谷 氨 酸 钠"?V$W 为 组 合 保 护 剂 使 用 时" 能 图$ 麦 芽 糖 和 谷 氨 酸 钠 对 冷 冻 干 燥 存 活 率 交 互 影 响 的 等 高 线 图 和 三 维 曲 面 图 使 植 物 乳 杆 菌 冷 冻 干 燥 存 活 率 达 到D!?D#W’