侧孢短芽孢杆菌S1286海洋溶菌酶的研究（可编辑）

侧孢短芽孢杆菌S1286海洋溶菌酶的研究（可编辑） 侧孢短芽孢杆菌S1286海洋溶菌酶的研究 学校代码: 研究生学号: 上海水产大学 硕士学位 ?海洋溶菌酶的研究 侧孢短芽孢杆菌一 目: 题 英文题目:水产品加工及贮藏工程 专 业: 水生生物资源利用 研究方向: 邹艳丽 姓 名: 孙谧研究员 指导教师: 二五年六月三日侧孢短芽孢杆菌??海洋溶菌酶的研究 摘要 侧孢短芽孢杆菌..海洋溶菌酶发酵液经离心超滤、 . 凝胶柱层析 阳离子交换柱层析和 纯化得到电泳纯的海洋溶菌酶,其中阳离子交换柱层析纯化效果 最为 明显,去除了大部分杂蛋白。海洋溶菌酶发酵液经纯化最后比活 达到 . /,纯化倍数为.,活力回收为.%。 对纯化海洋溶菌酶理化性质研究表明,该酶分子量约为, 氨基酸组成中、、并含量较高。海洋溶菌 酶对溶壁微球菌的最适作用温度为。,最适作用为.,在高 于和低于 时酶活下降都比较缓慢,时仍保持一定活性,相对 酶活为%,因此海洋溶菌酶是一种低温碱性酶。海洋溶菌酶稳定性 ...之间稳定性均较好,相对酶 较好,在 。时最稳定, 活在%以上;海洋溶菌酶在小于。时有较好的热稳定性,? 保温后剩余酶活为%,。保温后剩余酶活仍为%。 和对海洋溶菌酶具有一定的激活作用,和对海洋溶菌 酶略有抑制作用,其它金属离子如、和等对酶活没有 显著影响;化学试剂无水乙醇、、酒石酸等和增稠剂壳聚糖、果 胶、琼脂、阿拉伯胶等对酶活几乎没有影响,其它一些常见化学 试剂 及增稠剂对海洋溶菌酶略有激活作用,说明海洋溶菌酶与大部分金属离子、化学试剂和增稠剂有良好的配伍性。 以多种常见标准菌株、临床分离致病菌株及养殖常见致病菌株作 为检测指示菌株,采用倍比稀释法测定了海洋溶菌酶对这些菌株的作 用。结果表明海洋溶菌酶抑菌谱广,对检测指/?菌株都有不同程度的 抑制作用,尤其对临床分离致病菌株及养殖常见致病菌株都有较强的 作用,因此可以作为抗菌消炎药物或环保型饲料添加剂,部分代替或 代替抗生素以解决抗生素带来的抗药性和药物残留问题。 海洋溶菌酶对实验菌株的生长繁殖和代谢均有影响,抑制作用主 要发生在指数期初期。海洋溶菌酶作用后大肠埃希氏菌的细胞质固 缩,导致质壁分离,部分细胞壁缺失,细胞膜破裂,菌体变形,有些 细胞质解体出现空腔;金黄色葡萄球菌细胞质不均匀,固缩较严重, 中间有颜色较深成团物质出现,细胞壁变薄,有些细胞壁模糊不清, 存在质壁分离现象,但未出现和大肠埃希氏菌类似的明显空腔。 海洋溶菌酶对细菌的作用是一个复杂的过程,最终效果可能是作 用于多个部位产生效果的叠加。推测海洋溶菌酶抑菌主要有以下两种 作用:一种是海洋溶菌酶水解细胞壁中的糖苷键,破坏了细胞壁结构 使细胞壁出现部分缺失,失去了对细胞的保护作用,细胞质解体出现 空腔;另外一种作用是海洋溶菌酶渗透进入细胞内吸附细胞内的细胞 质,发生絮凝作用,扰乱细胞正常的生理活动。因为两种细菌的细胞 壁结构不同,两种作用对其影响程度也不同,对于大肠埃希氏菌前一 种作用占主要地位,而对于金黄色葡萄球菌后一种作用占主要地位。 海洋溶菌酶与蛋清溶菌酶及其它动植物来源溶菌酶和其它微生物来源的溶菌酶相比具有独特的优势,最适作用温度较低,稳定性好, 溶茵谱广泛,对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌和真菌均有不同程度的抑 制作用,尤其是对多种致病菌有较强的作用。海洋溶菌酶来源于从东 海底泥中筛选得到的侧孢短芽孢杆菌.,海洋的恶劣环境导致 海洋微生物在基因组成、生态功能、代谢系统和防御系统上的多样性, 所产生的代谢产物与陆生生物的代谢产物相比具有独特的性质。由于 不同来源的溶菌酶性质不同,混合使用具有协同作用,将大大拓宽溶 菌酶的应用领域。 为了开发海洋溶菌酶产品在临床上应用治疗阴道炎,通过大鼠阴 道混合感染金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的动物模型,观察了海洋 溶菌酶对细菌性阴道炎的治疗效果。大剂量/、中剂量/ 及小剂量./对大鼠阴道金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌混合 引起的细菌性阴道炎均能达到不同程度的转阴,治疗作用明显,治愈 程度分别为.%、.%和%,且有一定的量一效依赖性。 关键词侧孢短芽孢杆菌,海洋溶菌酶,纯化与性质,抑菌效果, 抑菌机理,阴道炎 . .? ,???.% ?. ?.、、、 , . 。,%。, , 。, .?.,. .。,% . 。, , , . ,,,. , %,.,,, . 、。. .., , . , , . 。,, . , ,. . . ., ,. , . ? ‘, , . , , ’. , .’ , . ? ,’ . /,/, /..%..% ? ‘% /,/ ./.. , , , , ,上海水产大学研究生学位论文 引 言 海洋微生物资源丰富种类繁多,生活环境的特异性导致其在物 种、 基因组成、代谢系统和机体防御系统上的多样性,是研究开发新 型酶 制剂的重要资源。目前已从海洋微生物中筛选得到多种新型酶, 有的 已获得其基因结构并专利保护,海洋微生物酶已成为发达国 家寻 求新型酶制剂产品的重要来源。我国关于海洋微生物酶的研究开发刚 刚起步,基础研究薄弱,面对国际上激烈的竞争,必须加强基础研究 和应用研究的投入,为长期合理地开发利用海洋微生物及其代谢产物 资源提供科学依据。 溶菌酶是专门作用于微生物细胞壁的水解酶,广泛应用于食品、 医药和生物工程中。目前,我国尚缺乏生产溶菌酶的规模化企业,溶 菌酶年产量不过几十吨。溶菌酶的高端产品主要被加拿大、美国、日 本等国的大公司所垄断,我国的溶菌酶产品只能作为低端的粗品原料 出口,当需要高端产品时还需要依赖于高价从国外进口,这些事实严 重阻碍了我国溶菌酶产业的发展。所以,寻找一个有利的突破口,尽 快使我国的溶菌酶产业与国际并轨,已成为一个亟代解决的重要课题。 本论文对一种新型海洋溶菌酶进行了初步研究,为海洋酶的基础 研究和应用研究奠定了基础,对依靠我国海洋生物资源,发展我国溶 菌酶制剂行业和提高相关企业的生产水平具有重大的经济和社会效 益,同时对海洋资源的可持续发展也具有重要的战略意义。侧孢短芽孢杆菌..海洋溶菌酶的研究 第一章文献综述 第一节海洋微生物酶研究进展 酶具有高效的催化能力、反应条件温和、底物专一性和立体选择性高等特点, 广泛用于食品、洗涤剂、制药、诊断试剂和精细化学工业等领域中。世界酶制剂 市场有约亿美元的消耗量,其中食品工业占%,洗涤剂工业占%,化学工 业仅占%。酶作为大分子的活性物质,在应用过程中常常出现不稳定的现象,尤 其在高温、强酸、强碱和高渗等极端条件下更容易失活,限制了酶在工业上的应 用。近年来,生物科学家在酶工程的研究中开拓了一个崭新的领域一极端酶的研 究。,希望开发出新的酶种,使其在极端条件下仍保持高的活性和稳定性,拓展 酶的应用范围。海洋微生物代谢过程中产生的酶类在性质、功能上与陆地生物有 很多不同,因此从海洋生物中筛选提取有应用价值的酶类,成为海洋生物资源开 发的一个重要方面。年 等将海洋细菌 .产生的蛋 白酶分离纯化,并进行了酶学性质的研究】,这可能是关于海洋微生物酶的第一篇 报道,从此开始了对海洋微生物酶的研究。 .海洋微生物研究进展 浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮,它覆盖地球表面积的%,海水总体积占 地球总水量%,尚未被利用的海洋与海岸的有效面积比陆地大.倍。海洋微 生物是海洋生物的重要成员,但是我们对海洋微生物的了解远远落后于陆地微生 物。从海洋环境分离的微生物,特别是沿岸海域中分离的微生物,常常是陆源微 生物的稀有种属。关于海洋微生物的研究,早在年写出了第一部 有关深海微生物的专著,之后等发表了有关深浅海的海洋微生物学的巨著 ”。海洋微生物资源丰富种类繁多,几乎包括所有的微生物类型, 其生物多样性远 远超过陆地生物的多样性“。在海洋中所有深度和纬度都有微生物存在,其数量 可由每毫升仅几个至几亿个,在海底的沉积物中一般每克湿重含有.个细 菌。已发现的类群主要包括:病毒、占菌、细菌、粘细菌和真菌等,在海洋微生 物中假单胞菌和弧菌是主要的细菌属,黄杆菌的数目也相当大,假丝酵母、球拟 酵母、隐球酵母等是主要的酵母菌。 一一上海水产大学研究生学位论文 海洋的生态环境十分独特,包罗了高盐、高压、低温尤其是深海、低光照、 寡营养等特点,还有无光照以及局部高温的极端环境,来自海洋的微生物大部分 都是适应了极端环境的极端微生物,往往能产生不同于陆地来源的分子结构新颖 独特的新活性物质,而且其活性一股大大超过陆栖微生物,是研究开发海洋微生 物活性物质的重要资源 ‘”。海洋微生物的多样性为人类提供了种类繁多、分子结 构新颖、化学组成复杂和生理活性特异的海洋天然产品,它是药 物、保健食品和 生物的巨大宝库,所以开发利用海洋微生物具有重大的意义。仅在过去年 中,有近种新的海洋天然产物被发现。从文献篇目数量分析,有关海洋微生 物的研究进展十分迅速,?年问,有篇文章是报道海洋天然产物,只 有篇%是有关微生物的。这些文献共列述了种代谢产物,其中有种 .%源自细菌和真菌。以后十年间?文献总数量篇及分离得到 的代谢物数量种都增长了%,篇文章报道种化台物,文献总数 量及代谢产物数量分别增长了%和%剀。 海洋微生物作为活性物质的来源比海洋高等生物更有意义,微生物本身所具 有的生长周期短,代谢易于调控,可以完全在人工控制条件下以惊人的速度生长 繁殖,可通过大规模发酵实现工业化【?。海洋微生物种源丰富,未知者众多,变 异性大,容易选育出高产菌株,是获得生物活性物质的新来源,另外由微生物发 酵产生的胞外物质通常比高等生物产生的物质容易纯化,也是许多活性物质的来 源。据报道已成功地分离到多种具有生物活性的海洋天然产物, 但由于其产 量较低,分离提取的生产成本较高,使得许多研究成果的应用推广受到一定的限 制。以前有些被认为是海洋动、植物产生的生物活性物质,实际上是由与动、植 物宿主共生的微生物所产生的?’ ‘。因此,人们已经把注意力转向对海洋微生物 的培养与发酵技术以及其代谢产物的研究上【”。丰富的海洋微生物新资源以其广 阔的应用前景,吸引了世界各国和组织投入大量财力和物力,预计今后几十年里, 海洋微生物将成为新的海洋天然产物的主要来源。 .海洋微生物酶研究进展 海洋微生物所处环境具有很大的特殊性,可开发出很多新的极端酶。嗜冷菌 能产生很多种在低温下才显示高效的酶,已被提取出来的嗜冷酶有.淀粉酶、蛋 白酶、脂肪酶、胶原酶、嗜冷碱性蛋白酶,在工业洗涤剂、保持食品营养和风味 起着重要作用。从嗜热微生物中已筛选到多种热稳定性的酶,如淀粉酶、蛋白酶、 葡萄糖苷酶、木聚糖酶及聚合酶,这些酶在.?之间具有良好热稳 定性。 ~一侧孢短芽孢杆菌一海洋溶菌酶的研究 新发现一种耐高温菌如烈火球菌 甲获得一种聚合酶,称之为 疗聚合酶,在。下能有效发挥酶功能反应,此酶有可能取代第一个进入商业 化的聚合酶,在聚合酶链反应技术方面发挥重要作用。米以上深海 嗜压微生物是嗜压酶重要来源,高压增加了酶活性和热稳定性,且使酶具有良好 的立体专一性,在高温和高压下,底物溶解度增加,溶剂粘度减少,提高了物质 的传输速率和反应速率,决定了嗜热嗜压酶在化学工业上有着良好应用前景。嗜 酸酶和嗜碱酶,如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶,许多碱性酶已应用于医药等方面, 碱性蛋白酶也已应用于洗涤剂工业。从高温、高压、高酸的火山口附近环境中获 得嗜酸微生物产生的酶,作为食品添加剂可帮助食物在胃内高酸性坏境中进行消 化。嗜盐微生物内在高盐浓度下保持稳定性的海藻嗜盐氧化酶,具有耐有机溶媒 的嗜盐酶在化学工业的化合物合成、石油工业的原油精炼及污水 处理等方面的应 用翻开了新的~页。 迄今为止人们已经从海洋生物中分离得到了碱性蛋白酶、碱性磷酸酶、琼脂 糖酶、溶菌酶、脂肪酶及几丁质酶等多种酶类,有的还已获得了基因,并进行了 基因及蛋白质工程改造研究。近些年来,海洋生物酶得到了广泛研究,发现了许 多具重要价值的酶,其中几种重要的海洋生物酶有: 碱性蛋白酶 年代初. 发表了一篇关于从海洋嗜冷杆菌获得一种新型海洋碱 性蛋白酶的文章,引起学术界和酶制剂公司的高度重视。目前,酶的新特性已成 为蛋白酶 研究开发的重要前提,如低温碱性、高温碱性等。海洋 的独特环境自然成了碱性蛋白酶开发的新源地。等从海洋细菌/ 中获得了新型碱性金属型内肽酶,该蛋白酶的最适反应 ...,。保温 酶活损失%, 全部失活,存在下具有最大酶活性。等报道 了 .产生的胞外蛋白酶,受的抑制,为典型的金属蛋白酶,‘ 位于活性中心,已对该酶进行了纯化与氨基酸分析,并有望实现应用‘。 我国在特性蛋白酶方面也已有很大进展,年邱秀宝等筛选到~株产碱性 蛋白酶的海洋微生物,该菌所产生的碱性蛋白酶最适作用温度为。,最适 为.“”。陈秀兰等从渤海表层海水中分离到~株产碱性蛋白酶的菌株假单胞菌属 ,该酶的最适为,最适酶活温度为。,最适生长温度为。。 孙谧等从我国黄海的杆菌中分离到一种蛋白酶,分子量左右,其最适为 ,作用范围,,最适反应温度为。,但活性随温度的降低而下降缓慢, 在?下仍能保持%的活性。 .碱性磷酸酶 碱性磷酸酶 是一种专~性较广的磷酸酯水解酶,可以催 ????上海水产大学研究生学位论文 化所有的磷酸酯的水解反应和磷酸基团的转移反应,在水生态系统的磷循环中具 有重要功能。海洋微生物已成为碱性磷酸酶的重要来源。美国科 学家 等研究了碱性磷酸酶的工程菌对海洋环境磷循环的影响,证明它具有相当重要的 作用】。俄罗斯科学家等年申请的专利中报道了海洋新菌株 一产生的碱性磷酸酶,以及该酶的生产及制备方法,该菌株具有较 高的产酶能力,可望作为工具酶应用于分子生物学研究?。 等从海洋 细菌 分离了热稳定性的碱性磷酸酶,其最适反应 , .?,,具有较好的热稳定性,。保温无失活,具有良好的应用潜力。 琼脂酶 琼脂酶的研究在近年来已逐渐兴起,陆生生物对于琼脂的水解是相当 困难的,海洋微生物是琼脂酶的主要来源。从海洋微生物中提取的琼脂酶可分为旺一 琼脂酶和一琼脂酶两种类型。其中【.琼脂酶主要来自假单胞菌属、单胞菌属和弧 菌属,分子量范围大约是.。琼脂酶主要来自弧菌属和交替单胞菌属。 等较为系统地研究了海洋细菌啪, 日本科学家 .的琼脂酶, 年他们纯化了该菌的,其分子量,可水解琼脂糖的., 糖苷键,不具有海藻酸酶及胶质酶活性。年他们又报道该菌还产生 旺一,分子量,有个亚基,最适和温度分别为.和?。随后 又对该酶的.酶基因及.酶基因进行了序列分析“。一种来自 】。另外, 的?.琼脂酶含有两个亚基,其为.,酶的最适为. 年韩国科学家 等研究了 .的琼脂酶在 , 中表达,并进行了重组酶的纯化及性质研究,分子量为,其最适为 / 最适温度较广,为?。,. 时有最大活性,可用于海藻破壁制备 原生质体?。 .溶菌酶 有关海洋微生物溶菌酶的具体报道较少。其中等从海洋生物中分离 到一种溶菌酶,其最适作用为.,可分解微球菌、大肠柯菌和枯草 杆菌的细胞壁,但能分解几丁质和金黄色葡萄球菌的细胞壁“。等从海 洋生物中分离到一种低温溶菌酶,在 尚能保持较高的活性。日本科学家从海洋 微生物中、英国科学家在海岸边蟹的颗粒血细胞里也都获得了对革兰氏阳性菌及 阴性菌都有灭活作用的海洋溶菌酶。王跃军等从一株海洋杆菌中分离纯化出低温 溶菌酶,该酶的分子量为,等电点为.。该酶的最适温度为?,最适 为.,摇瓶发酵的酶活为/”。 .脂肪酶 从上世纪七十年代,国外就开始对产脂肪酶海洋微生物进行了筛选.同本、 一一侧孢短芽孢杆菌海洋溶荫酶的研究 美国等报道了从冷海水区域分离得到的微生物可产生耐低温的脂肪酶,挪 威的.将海洋碱性磷酸单酯酶经过高度纯化后成为分子生物学试 剂,用于的测序和分子克隆。从深海中分离到一株代号为一的细 菌,其脂肪酶即耐低温又耐碱,其最适反应温度为,?仍有很强的酶活力, 最适为。 我国海洋微生物脂肪酶研究起步较晚,仅有杨从发等人从海水、 海泥、海洋生物的消化道分离到碱性脂肪酶产生菌。 .几丁质酶 海洋中富含几丁质,海洋微生物几丁质酶是人们关注的重点酶之一。 近几年柬,海洋微生物几丁质酶有大量的报道。产酶菌株多为阳 .与 .,酶的分子量多在万万之间,酶反应的最适多在.?.之 间.最适温度多在.。,一般海洋微生物的几丁质酶的活性与有关,如 等从鱼肠道中发现的 .所产生的几丁质酶,在%%的下 具有高活性,而太高、太低都抑制酶活力。年美国等报道了 .利用不同几丁质作底物产生的几丁质酶并进行了酶基因克隆。但海洋生物几丁 质酶可与陆生微生物几丁质酶在端氨基酸序列上具有很好的同源性【”。 褐藻胶裂解酶 褐藻胶裂解酶的研究自年代以来已有许多报道,主要来自海 首先提出了应用酶法 洋微生物及海洋动植物,法国国家科学研究中心的 建立大规模制各褐藻和红藻原生质体的生产技术,褐藻胶裂解酶的应用取得进展, 开始应用的为海螺等海洋动物酶,现在早已被微生物酶所取代”。日本、法国、 德国等各国科学家报道了大量的海洋微生物的褐藻胶裂解酶,有的已进行了克隆、 表达与基因序列分析。如年日本科学家报道了海洋细菌产生的一种新的 褐藻胶裂解酶,胞外酶分子量为,同时具有、的降解活性。 年法国科学家发现海洋细菌的酶在高盐下具有活性,酶基因可在 中表达。 等在大肠杆菌中表达了特异性水解.甘露糖的基因,为藻酸盐 结构的研究及富含甘露糖醛酸的藻酸盐的修饰提供了酶源【。 .卡拉胶酶 卡拉胶是不均一多糖,多糖的相对含量和成分随海藻来源的不同而变化,目 前已发现卡拉胶有种类型,如一卡拉胶、一卡拉胶和一卡拉胶等。目前己 从交替单胞菌属和属分离到一卡拉胶酶和一卡拉胶 酶。.等从海洋细菌 中得到了一卡拉胶 酶,分子量为。该酶有个氨基酸,端有个的信号肽。 一一上海水产大学研究生学位论文 第二节海洋微生物抗菌活性物质研究进展 据统计,自年发现微生物可产生青霉素以来,人们已从微生物中 发现.种天然产物,其中多种具有生物活性,多种是抗菌和 抗肿瘤化合物.而且近来越来越多的研究表明,许多具有不发前景的活性物 质并不是由海绵、海藻、海胆、海葵等动植物产生的,而是由与其共生或附生的 海洋微生物产生的。日本近年来对海洋微生物进行了广泛研究,发现约有%的海 洋微生物具有抗菌活性,其中.%的真菌、.%的细菌和.%放线菌都具有不 同程度的抗菌作用。 .海洋真菌产生的抗菌活性物质 根据等调查,已鉴定种海洋真菌,包括种子囊菌、种担 子菌和种无性念真菌。随着新菌体的发现和描述,数量在不断增大。不少科研 结果统计证明:从海洋真菌分离出的次级代谢产物%.%具有生物活性。 等从印度洋中的真菌 .的培养液中分离到一株新型环缩二 和 具有抗菌活性。 氨酸,它对幻, 中发现一种与陆地真菌 等从一株海洋真菌.代谢物一样的具有抗菌活性的倍半萜。丹麦 中发现一个对硝基苯酸酯倍半萜。一些海 从真菌 洋生物体上附生的海洋真菌也可产生新型生物活性物质。 等 采集日本福冈海岸蟹 壳上的真菌 .,并从该真菌的培养 液中先后分离出种新拮抗物。等从佛罗罩达沿海采集到一株真菌,培 养液的粗提物同时具有抗细菌和抗真菌活性。等【 从海绵 、 分离得到一株真菌 ,得到种化合物对 和西曲幽 有抑菌作用。 王书锦等【】从中国黄、渤海、辽宁近海地区分离得到海洋真菌株,已鉴 定的有多株,主要有青霉属、曲霉属叫、木霉属 镰刀菌属等,%以上发酵产物具有抗细菌或抗真菌生物活性。年 刘晨临等从青岛侧花葵和绿海葵上分别分离到株真菌,并对其产生的活性抑 菌物质进行了初步测试,从株真菌中筛选出株有较好抗病原真菌活性的菌株, 其中青的代谢产物对立枯丝核菌拓 有较强的抑制作用。 等【州报道住我国深圳近海沉积的红树林上分离获得一株海洋真菌 一一侧孢短芽孢杆菌??海洋溶菌酶的研究 一,在其代谢物中发现一种新的作用于真菌细胞壁合 成新靶位的脂肪类抗真菌物质 ,在温室实验中抑制真菌类植物病害的发 生,并能抑制人的真菌病菌。 .海洋细菌产生的抗菌活性物质 海洋细菌是所有海洋微生物中生物活性物质研究报道最多的。革兰氏阴性细 菌是海洋化能异养原核生物中最大、最多样化的组群,在海水培养基上生长迅速, 是可观察到的细菌菌落的大多数;而通常在各种物体表面生活、开放海水中不常 见的、具有独特形态发生特征的细菌则相对生长缓慢,在普通海水琼脂平板上不 易观察到。但作为生物活性物质产生菌,后者却具有更为重要的意义。 第一个鉴定的海洋细菌代谢物是从加勒比海草表面分离得到的菌 .产生的一种五溴毗咯化合物,表现强烈的抗革兰氏阳性菌活性【”。 共栖细菌产生的生物活性物质包括被囊动物分离菌 产生 的和 .”,嗜盐农杆菌产生的对耐药革兰氏阳性细菌表现 .产生的对一些耐短杆菌酪 活性的,从一种蠕虫的组织分离的 肽的菌株有效的新型环十肽抗生素 等。 多属海洋细菌可产生抗生素,其中包括芽孢杆菌属、黄杆菌属 、微球菌属、着色菌属、钦氏菌属 等及许多未定菌,有些种类的抗生素从未在陆生菌中见过?。藤黄紫交 替单孢菌似 代谢产物中含两种抗生素,其中一种类似于 酸性多糖的多糖胺类化合物。这种抗菌物质会被过氧化氢酶分解。另一种则是含 溴的小分子化合物,具有防腐活性。此属细菌的 菌及 会产生多胺类抗生素,对金黄色葡萄球菌有抑制活性。 某些海洋细菌产生的活性物质对海洋微生物具有专一性抑制作用。 等【卅从绿藻 .分离到的交替假单孢菌在%人工海水培养基中可产生 ,该物质能抑制海洋细菌的生长而对陆地微生物不起作用。与海洋动 植物体共存的细菌可产生具有细胞毒性和杀菌活性的化合物。 据统计,海绵中的共存微生物约占海绵体积的%,可从中获得多种生物活 性物质。王书锦等剐通过对辽宁近海海域海洋细菌的组成与数量分布研究表明, 在分离得到的株的海洋细菌中,其中约有%左右的海洋细菌具有不同程度 的抗病原真菌、病原细菌的能力,同时还发现与红鳍东方豚共生存的海洋细菌也 能产生抗菌活性物质。海洋细菌是海洋微生物的优势类群,同时能够产生抗菌活 一一圭塑查主盔堂盟窒竺兰焦堡苎 、 性物质海洋细菌比例也很高。有人检测了海洋微生物对, ,口、 等种细菌和真菌的拮抗作用,结果发现,海 洋微生物中.%的细菌具有不同程度的抗性。刘全永等】从辽宁渤海水域分离 得到广谱抗真菌活性物质的海洋细菌?,对人体病原真菌 有较强的抑菌作用。 .海洋放线菌产生的抗菌活性物质 在海洋生态系统中.放线菌不是主要的微生物区系,但近几年来研究表明海 洋环境中的放线菌和放线菌代谢产物却是寻找新抗菌物质的重要来源。适应了海 洋环境的放线菌是工业微生物中一个重要的待开发资源,并且发 现了许多独有的 特性。 .能 报道从日本相模湾的浅海淤泥中分离的 够产生,对革兰氏阳性菌有强抑制作用,体内实验可抑制疟原虫 ,对动物毒性小。土霉素原是一种由陆生微生物龟裂链霉菌假 分泌产生的抗生素,如今从海洋底泥的放线菌中也被分离到。红树林植物 是一类生长在海岸潮问带的高等植物,从红树林底泥的放线菌中获得抗生素,对 鱼类病原均有一定的抗菌作用。厦门大学生物系在研究红树林根系微生物时,从 中分离到多株产生新型抗生素的放线菌。 不同海域的海洋放线菌种群组成不同,其产生的抗菌活性物质结构和拮抗对 象也有差异。王书锦 从中国黄海、渤海、辽宁近海个地区个定位点的海 水及海泥中分离到株放线菌,通过初步鉴定发现以链霉菌属为主,占放线 菌总数的%,其中多株具有抗菌活性,其中.、.等对病原真菌、病 原细菌、病原弧菌等有很强的抑制和杀灭作用,。生物制剂对防治重茬大豆 连作障碍抗病减毒有明显作用‘】。黄维真等【自福建沿海海泥分离到多株海 洋放线菌,经初步鉴定表明,在各采集地区海泥里放线菌的组成都是以小单孢菌 属居绝对优势,至少占所分离的菌株总数的%以上,且相当一部分还高达%。 其次是链霉菌属,与此同时还能分离到一些稀有放线菌,如小四孢菌、马杜拉放 线菌等。其中一株代表性的菌株鲁特格斯链霉菌鼓浪屿亚种 .能产生一种新的抗生素,还产生个次要组分, 鉴定为肌醇胺霉素和春日霉素。另一有代表性的、宜于生长在碱性培养基里的 海洋放线菌,能产生一种典型的氨基苷类抗生素,经过氢谱、碳谱和快中子轰 击质谱等的研究鉴别为丁酰菅菌素。 一一侧孢短芽孢杆菌.罐海洋溶菌酶的研究 第三节溶菌酶研究进展 ...是一类专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶 溶菌酶 解酶【,广泛存在于各种生命体中。首次对溶菌酶进行研究的是英国人, 他在人的眼泪、唾液中发现了这种具有溶解细菌细胞壁能力的蛋 白质,此后溶菌 酶在多种生物体中发现,研究也越来越深入,以至于在生命科学的多种领域尤其 是在酶学研究中溶菌酶都是作为一种模式酶来进行研究,它是第一个进行氨基酸 序列测定的蛋白质‘“,是第一个借助一射线衍射确定出立体构造的酶‘”,也是第 一种详细阐述作用机制的酶,在免疫学及物理化学研究方面,溶菌酶也是一种模 式物质】。 .溶菌酶的分布 目前已知溶菌酶在自然界中分布极为广泛,研究人员已经发现高等动植物组 织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中都有溶菌酶存在。 .动物溶菌酶 自然界中,鸡蛋清溶菌酶的含量最丰富,约为.%,即使在蛋壳膜中也含有 .%的溶菌酶。目前,由食品厂废弃蛋壳的残留蛋清中提取溶菌酶,回收率可达 ‰一.‰,溶菌酶产品的活性为/,最高时可达/。鸟类如鹌 鹑蛋清溶菌酶的活性与鸡蛋清溶菌酶非常相似。对于哺乳动物溶菌酶,目前仅从 牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶,其化学性质与人溶菌酶相似,但结构 尚不清楚,其溶菌活性也远低于人溶菌酶约倍。人及哺乳动物溶菌酶的作用 机制与鸡蛋清溶菌酶相同。 植物溶菌酶 在动物界发现溶菌酶后不久,在植物界中也发现了溶菌酶,许多植物如木瓜、 风梨、芜菁、大麦、无花果中均有溶菌酶的存在,只是其含量差异较悬殊。植物 中的溶菌酶通常比动物来源的溶菌酶具有较大的分子量。 .微生物溶菌酶 人们从年代发现微生物也产生溶菌酶,并且进展很快。溶菌酶可以用溶菌 谱来作为酶专~性的主要指标,但由于这类酶的作用机制十分复杂,所以这种分 类并不能反映酶的作用本质,现在以酶的作用性质来进行分类。已知参与微生物 细胞壁溶解作用的酶大致可分为作用于糖苷键的和作用于肽和酰胺部分两大类。 一般把微生物产生的溶菌酶分为类:内..乙酰己糖胺酶;酰胺酶;内肽酶和蛋 一?上海水产大学研究生学位论文 自酶;?,、?,葡聚糖酶和甘露糖酶葡甘露糖酶;磷酸甘露糖酶;壳多糖酶 脱乙酰壳多糖酶。 溶菌酶的种类 溶菌酶按其所作用的微生物种类不同可以分为细菌细胞壁溶解酶、酵母细胞 壁溶菌酶和霉菌细胞壁溶菌酶【】。细菌细胞壁溶解酶有两种,一种是作用于., 糖苷键的细胞壁溶解酶,另一种是作用于肽和酰胺部分的细胞壁溶解酶。 .细菌细胞壁溶解酶 内..乙酰壁酰胺酶与内一.乙酰氨基葡萄糖苷酶均为作用于一,糖苷键的 细胞壁溶解酶。微生物细胞壁溶解酶生产酶大多是以鸡蛋清溶菌酶所不能作用的 细菌作底物而筛选得到的。例如可生产溶解金黄色葡萄球菌的真菌、 白色链霉菌和灰色链霉菌等。它们所产壁酰胺酶除.乙酰壁酰胺酶外,尚含, .二乙酰壁酰胺酶。有些菌株的酶属鸡蛋清溶菌酶型,除溶解溶壁微球菌外,也 可以溶解龋齿病原菌变异链球菌或铜绿假单胞菌、大肠杆菌。 鸡蛋清溶菌酶对金黄色葡萄球菌以外的许多革兰氏阳性菌有着强烈的溶菌 性,对它最敏感的细菌是溶壁微球菌己作为测定溶菌活性的试验菌、枯草杆菌、 巨大芽孢杆菌和藤黄黄八叠球菌,但对于革兰氏阳性菌如大肠杆菌、铜绿假单胞 菌等无作用,就是在有些溶壁微球菌和枯草杆菌中也存在着抗溶菌酶的菌株。 作用于肽与酰胺部分的细胞壁溶解酶主要是内肽酶和酰胺酶,已经发现多 种具有溶菌作用的微生物内肽酶,如葡萄球菌 产生的葡 萄球菌素、白色链霉菌所产生的内肽酶、粘杆菌.的内肽酶等都是内肽酶。 白色链霉菌所产生的溶菌酶系中含有酰胺酶,可以将肽聚糖与肽之间的键切开, 在微生物细胞的自溶作用上起着重要作用。 .酵母细胞壁溶懈酶 酵母细胞壁溶解酶的主要成分是.,葡聚糖酶,许多微生物可以生产酵母细 胞壁溶解酶,例如环状芽孢杆菌、藤黄节杆菌、黄杆菌等细菌,担子菌、薄膜革 菌、薄青霉、根霉和木霉等各种真菌,藤黄节杆菌、木霉、梨孢霉等的内..,. 聚糖酶已经精制和制成商品,并已有不少综述。酵母细胞壁溶解酶是~种诱导酶, 培养基中添加酵母、,葡聚糖等可刺激产酶。藤黄节杆菌用酵母为碳源的产酶 效果最好,酵母细胞浓度以%为佳,“对产酶有良好作用。从厄氏菌、帚霉 属菌株分离得到的酶,对酵母细胞有强烈的溶菌作用,这类酶的组成成分为?. 葡聚糖酶、甲壳质酶以及蛋白酶等,在细胞壁溶解作用中起作用的酶是前二种。侧孢短芽孢杆菌一海洋溶菌酶的研究 .霉菌细胞壁溶菌酶 大部分植物溶菌酶多属于霉菌细胞壁溶菌酶类型。细胞壁由甲壳质和葡聚糖 构成的霉菌,能在,葡聚糖酶和甲壳质酶的协同作用下溶解,其中一,葡聚 糖酶起主要作用。细胞壁由壳聚糖与甲壳质所构成的根霉或毛霉,可受壳聚糖酶 和中性蛋白酶的作用而溶解,如有中性蛋白酶共存,溶菌效果显著增加。例如芽 孢杆菌生产壳聚糖酶和中性蛋白酶,若单独用壳聚糖酶作用于根 霉细胞悬液, 则悬液浓度下降%;若单独用中性蛋白酶处理,则浓度下降%;但若二种酶 同时作用,则可使菌体悬液的浓度下降%,如再用甲壳质酶作用,则细胞壁几 乎完伞溶解。 环状芽孢杆菌 是真菌细胞壁溶解酶.,葡聚糖酶的重要生 产菌种,研究较多的甲壳质酶的生产菌是放线菌。生产壳聚糖酶的微生物为放线 菌、霉菌和芽孢杆菌。一,葡聚糖酶和甲壳质酶均为诱导酶,培养基中必须添加 细胞壁、甲壳质等物质。芽孢杆菌生产的壳聚糖酶不是诱导酶,添加根霉细胞 壁或壳聚糖反而有抑制作用。 .溶菌酶的作用机理 .鸡蛋清溶菌酶结构及作用机理口列 鸡蛋清溶菌酶是第一个.射线衍射法阐明其全部结构与功能的酶,其生物功 能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解,从而溶解这些细菌的细胞壁。鸡蛋清溶菌 酶的最适小分子底物为一乙酰葡糖胺州和.乙酰胞壁酸洲交替的六糖。 鸡蛋清溶菌酶为具有个氨基酸残基的单肽链蛋白质,含有四对二硫键。从酶 的表面结构来看,酶的结构不很紧密,大多数极性基分布在酶的表面卜,便于与 溶剂水结合;而非极性基则隐藏在酶的内部,整个酶分子中有一狭长的凹穴。最 适小分子底物与酶结合时,正好是与酶分子中的长行凹穴相嵌合,酶凹穴中的; 及是活性中心的氨基酸残基。 鸡蛋清溶菌酶对细菌细胞壁的破坏过程如下:首先鸡蛋清溶菌酶的分子接触 细胞壁,与六个暴露在外的氨基酸残基结合,这时糖构象发生变形,从正常的 椅式变形为能量较高的半椅式或船式构象。然后起着广义酸碱催化剂的作用, 提供一个质子给糖苷键的氧原子,使得氧原子与环。间的糖苷键断开,而, 带上正电荷.成为一个萨碳离子。处于极性区的在通常下都是离子化的 形式存在,甚至在很低的情况下也是如此。起着稳定环正碳离子的作 用:协调,一间的糖苷键的断裂,在的负电荷影响下,正碳离子,可 以稳 一一上海水产大学研究生学位论文 定,直到环境中水分子’与它结合为止,在水中矿则与结合,使恢 复非离子化形式。至此,一次反应完成,细胞壁被打开一个缺口。 认为鸡蛋清溶菌酶催化活性有个影响因素:一般性催化作用; 底物变形作用;静电力作用。其中以静电力最为重要。溶菌酶分解底物时,首 先寡聚糖分子因氢键及其他作用力吸附在酶分子上,酶活性中心的片层形成的 裂缝两边的及的羰基和底物分子之间形成分子间的电子转移,由于这 种转移导致分子键的变化,使底物.,键断裂,底物被酶裂解成两部分。 细菌细胞壁是由骨架物质和胞壁间质组成的,溶菌酶主要作用于骨架物质肽 聚糖部分,肽聚糖是由和以一,糖苷键连接起来的多聚体,并通过 连接在上的短肽链之间的肽键使聚糖部分交联成网状,以维持细胞稳定性。 各种溶菌酶作用于肽聚糖的不同部分。例如,胞壁质酶作用于 位碳原子和 位碳原子之问形成的一,糖苷键,自然界中存在的溶菌酶多属于此类,我 们通常所说的鸡蛋清溶菌酶,就是一种一乙酰胞壁质酶。另外,酰胺酶作用于 连接与短肽链之间的一乙酰胞壁酰.一丙氨酸键,内肽酶、蛋白酶作用于形 成短肽链的肽键等等。溶菌酶发生作用后,由于骨架物质的裂解,细胞壁结构发 生塌陷、脱落,细菌细胞即形成原生质体结构,该结构受到内外渗透压变化影响 较大,很容易造成胞内物质泄漏,最终导致菌体细胞破裂、溶解,直至死亡。 .溶菌酶的抑菌谱 不同溶菌酶的抑菌谱不同,一般地对革兰氏阳性菌的抑菌效果最为显著,研 究证实鸡鸡蛋清溶菌酶对溶壁微球菌、黄色八叠球菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌 等有良好溶菌作用。其中,溶壁微球菌是目前用来检测溶菌酶生物活性的模式试 验菌株。鸡蛋清溶菌酶的抗菌谱还不广泛,若单独使用则对革兰氏阴性菌的抑制 作用并不明显,如果能将溶菌酶与甘氨酸或等结合使用,则对抑制或杀灭 大肠杆菌、普通变形杆菌、副溶血弧菌等有显著作用”。 微生物来源的溶菌酶大多数能够溶解金黄色葡萄球菌和革兰氏阳性细菌,但 有些菌株只能溶解阴性的铜绿假单胞菌。同时,各种细菌细胞壁中的肽聚糖对细 胞壁溶解酶的敏感性是因细胞壁的组成与构造而异的。同一种酶对同一种微生物 细胞壁的作用,也受到该微生物的培养条件的影响,处于对数生长期的的菌体, 细胞壁中肽聚糖含量最低,对溶菌酶最敏感,同时细胞与离体细胞壁对溶菌酶的 抵抗性也不同。将细胞用酸、碱、加热、冰冻或表面活性剂、丙酮等处理,可使 许多对溶菌酶有抵抗性的细菌变成容易溶解,尤其对革兰氏阳性菌更为明显,例 如添加碱可大大促进溶菌酶的作用,使不少抗性菌株象沙门氏菌、志贺氏菌、铜 绿假单胞菌和大肠卡菌等充分溶解。 一一侧孢短芽孢杆菌.’海洋溶菌酶的研究 第四节溶菌酶分离纯化研究进展 随着各种新的生物分离技术的出现,用于溶菌酶分离纯化的方法也愈来愈多, 从最初的直接结晶法到亲和色谱法、离子交换法,特别是现在采 用的新技术如亲 和膜色谱、超滤、反胶团萃取、双水相萃取和亲和沉淀等。 .传统溶菌酶分离纯化方法 结晶法 等于年发表关于溶菌酶分离和纯化的,等以大致相同 的方法,也获得了溶菌酶结晶状标准品,但是其质量和收率仍不理想。直到 年,等改用新方法,即用膨土岩吸附,再用吡啶洗脱,从鸡蛋白中得到了 收率高、结晶好的溶蔚酶;接着,他们又改用了直接结晶法,将含有%氯化钠 的蛋白调至蛋白溶菌酶的等电点.,加入溶菌酶晶种,获得其结晶品【”。年 代以来,对此法又进行了一系列的改进,使产率达到%.%。这种方法操作简 便,应用于蛋白溶菌酶结晶品的工业生产,使产品成本大大降低,为其医药应用 .的缓冲液中不能 作出了贡献。但是蛋白质在其等电点不稳定,溶菌酶在 长期保存;同是处理后的蛋白中因含有其它添加剂,降低了利用价值;此法的另 一缺点是不能用以分离微量的溶菌酶。 亲和色谱法 从七十年代起,开展了亲和色谱法 分离纯化溶菌酶的 研究。最初,利用溶菌酶在特定条件下兼具甲壳质酶的功能,直接采用其底物 甲壳质作为分离纯化溶菌酶的吸附剂”,取得了较好的收率。但甲壳质可被酶缓 慢水解,亲和色谱分得的酶易被其水解产物多糖污染,这是甲壳质作为吸附剂的 一大缺点。为了降低溶菌酶对甲壳质的水解能力,对甲壳质进行了修饰,获得了 一系列甲壳质的衍生物。它们的基本结构与甲壳质类似,但酶对它们的水解能力 则大大降低。如羧甲基甲壳质一甲壳质【】、甲壳质包被纤维素.羧甲基纤维 素、脱乙酰甲壳质、脱氨基甲壳质,均可用作亲和色谱的吸附剂。 除甲壳质及其衍生物可作为配体外,还可用溶菌酶分解细胞壁所得消化物作 为配体【 。将消化物与用溴化氰活化的琼脂糖连接,得到琼脂糖一配体衍生物。用 含有/氯化钠的./甘氨酸.氢氧化钠缓冲液 洗脱,一步即可将 酶提纯~倍,而失活及经修饰的溶菌酶则不被吸附而流走。琼脂糖本身亦 可作为亲和吸附的配体【?。这是由于它的结构与溶菌酶底物类似。用琼脂糖作配 一】一上海水产人学研究生学位论文 体,分离提纯的溶菌酶不含杂蛋白,~次可将蛋白提纯倍。 亲和色谱分离提纯的倍数较高,质量较好,且可广泛应用于各种来源的溶菌 酶,还能分离纯化经化学修饰而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶,亦能用于检 测酶与底物相结合的氨基酸残基。但由于亲和吸附剂的制作较为复杂,限制了它 在工业上的大规模利用.然而用于浓缩与精制微量的溶菌酶、区分天然溶菌酶和 修饰酶或探索与底物结合的酶分子氨基酸残基状况等是很有效的方法。 .离子交换法 离子交换法? 是利用溶液中各种带电粒子与离子 交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术,由于具有简便、高效、成本 低,且可自动化连续操作的优点,因此一直以来都是溶菌酶生产 所常用的方法。 常用的离子交换剂有 一、磷酸纤维素、羧甲基纤维素干羧甲 等等用 .从性质均一的蛋清溶液中分离 基琼脂糖等。 溶菌酶,建立的一种简便而有效的工艺过程,可使溶菌酶的回收率高达.%。 同时采用一分离纯化溶菌酶适合于连续自动化操作。李蓉等】采用硅胶 基质弱阳离子交换剂?.作为填料制作的色谱分离纯化蛋清中的溶菌 酶克服了上述的弊端,获得了良好的分离效果,活性回收率为%,蛋白的比活 为 /,纯化倍数提高了.倍。 .溶菌酶分离纯化新技术研究进展 .亲和膜色谱 膜色谱技术是将液相色谱与膜分离结合起来的一种新技术,具有快速、高效、 高选择性、易于放大的特点,能满足生物大分子高效分离与纯化的要求,作为一 种高效的分离纯化技术已受到人们的高度重视,广泛应用于大分 子物质的纯化。 世纪年代末出现亲和膜色谱技术 .兼具膜分 离与亲和分离的特点,与传统的膜分离、亲和色谱相比,不仅具有纯化倍数高, 压降小,分离时间短,生物大分子在分离过程中变性几率小,允许较快的加料速 度等特点,而且比柱亲和色谱更易实现规模化生产?。人们将固定离子亲和色谱 与膜分离结合制各具有分离性能的固定金属亲和膜用于分离纯化蛋白质, 用改性的玻璃中空纤维膜固定金属离子,从.胰凝乳蛋白酶原中分离溶菌酶科。 郑字、李静】、柴红等用自制的金属螯合亲和膜亚氨二乙酸一亲和 膜分离纯化混合酶和蛋清中的溶菌酶,在适当的操作条件下,提取的溶菌酶纯度 大于/,如果能进一步提高溶菌酶的收率,则该亲和膜纯化新工艺有可能 一侧孢短芽孢杆菌..海洋溶菌酶的研究 取代传统的工业生产工艺。等采用一种新型亲和染料一配基复合膜 对溶菌酶的吸附及动力学特征进行研究,结果表明这种染料.配 基复合膜与普通膜 对溶菌酶的吸附能力分别是./和./,提高了.倍。 .超滤 超滤技术与传统的生化分离技术相比主要的优点是产品的高产 出量,然而尽管超滤技术在反渗析及浓缩等过程中得到广泛的应用,但是它作为 在生物工业领域中潜能很大的一种蛋白质分离技术仍然未被得到充分利用。运用 超滤技术可以很好地通过调节而获得高产量和高纯度的产品,如果在无菌条件下 操作,可以直接生产无菌的溶菌酶溶液,直接用于临床治疗。 ”等使用经肌血球素预先处理的超滤系统,,聚砜膜 分离溶菌酶。利用这种经预先处理过的膜可使溶菌酶的通过量比未经处理的膜提 高大约%,而其他的蛋清蛋白质的通过量依赖于透膜压。随着透膜压的升高,通 过量下降,因此通过表面预处理和透膜压调节两种方法综合使用,可使溶菌酶全 【 部通过而其他蛋清蛋白质几乎全部截留。同样是 】等采用小型的中空纤 维超滤系统,,聚砜膜从蛋清干粉中分离溶菌酶。溶菌酶选择性透 过膜,而其他大分子的蛋清蛋白质被膜所截留,改进系统的液体动力学可增加溶 菌酶透过量,从而获得较高的收率。用这种超滤方法只能得到中等纯度的溶菌酶, 可用于食品行业,如果要在医药行业上使用,则需要经过进一步的精制。 等【】】于年报道过使用超滤与亲和色谱相结合的二步分离纯化方法。经过第一 步超滤与反渗析过程可回收%的溶菌酶活力,第二步可得至蛋白,总的溶 菌酶回收率可达%。 .反胶团萃取 是近年发展起来的一种新的萃取方法, 反胶团萃取 它是利用有机溶剂中加入少量表面活性剂形成的反胶团来提取的方法,为一些不 能使用有机溶剂萃取的酶和活性蛋白质等生物活性物质开拓了一种新的分离技 术.扩大了有机溶剂萃取的适用范围【『“。 等副采用一种亲和染料基质反胶 团系统从鸡蛋清粗溶液中纯化溶菌酶,这种反胶团是由辛巴蓝?与改良的大豆 蛋磷脂在正己烷中反应制得。用粗蛋清溶液进行分离纯化,呵使溶菌酶的纯度提 高~倍,达到.?./蛋白,这种亲和反胶团系统可以重复使用三次, 加入聚氧乙烯去水山梨糖醇三油酸酯 作为辅助表面活性剂可以提 .的前水相中,使用含有 高反胶团系统的容量。在 /的反胶 团可以使溶菌酶的产率超过%。张伟等设计出滚筒式填料筛板萃取器,并用 该萃取器反胶团法萃取蛋白质。萃取溶菌酶和的实验结果表明,该萃取器萃 取效果良好,可有效解决反胶团萃取法萃取蛋白质过程中分相困难的问题。 一上海水产大学研究生学位论文 .亲和沉淀 亲和沉淀法 采用在物理场、离子强度和温度等改变时 发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为亲和配基的载体,从而利用目标分子与其亲和 配基的特异性结合作用及沉淀分离的原理进行目标大分子的分离纯化,是蛋白质 等生物大分子的新型亲和技术之一。由于生物亲和相互作用的选择性高,离心分 离法操作简便、易于放大,因此亲和沉淀法不仅具有接近于亲和层析法的纯化效 率,而且可弥补亲和层析法放大困难的缺点。此外亲和沉淀操作中目标分子与配 基的亲和相互作片在水溶状态下,传质阻力小、吸附速率快、可处理高粘度甚至 等 报道采用一异聚丙烯酰胺与酸单体的共聚物 含微粒的粗原料口“。 从蛋清中热沉淀溶菌酶,得至%的收率。他们认为使用此共聚物从蛋清中热沉淀 溶菌酶比使用敏感聚合物具有更多的优点,因为后者通常只有较低的收率。 溶菌酶分离纯化方法的选择 综上所述,用于蛋白质分离和纯化的技术几乎全部可以用于溶菌酶的研究, 然而在具体研究某~种溶菌酶的纯化技术时会随实际情况而异。大多数情况下, 单~的色谱方法无法获得所需纯度的溶菌酶,因此常常需要将多种色谱技术搭配 起来使用。离子交换色谱是一类最常用的色谱纯化方法,亲和方法一般应用于初 期的纯化操作,但是这种方法的造价比较昂贵。相比较而言,常常 在沉淀操作之 后选择成本比较低的离子交换和凝胶过滤方法进行配合操作。尽管凝胶过滤的蛋 白质载量比较低,但该方法一般应用于纯化的初期或者是在整个纯化策略的收尾 阶段以提高产品的最终纯度。通常纯化操作比较繁复而耗时,从而导致最终的产 率较低,最近~些全新的纯化技术已经应用于溶菌酶的纯化中,为溶菌酶的纯化 提供了新的途径。总之,一条有效的溶菌酶纯化策略不仅仅在于利用蛋白质分离、 纯化技术的最新技术成果.更重要的是要针对所研究溶菌酶自身的性质设计出合 理、有效的分离和纯化策略。 ?侧孢短芽孢杆菌.?海洋溶菌酶的研究 第五节溶菌酶的应用 溶菌酶是一种无毒、无害安全性很高的高盐基蛋白质,能专一性地作用于肽 聚糖的糖苷链使之断裂,使细菌细胞壁变得松驰,失去对细胞的保护作用,最后 细胞溶解死亡,对枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和藤黄八叠球菌等有强烈的抗菌 作用,而对没有细胞壁的人体细胞不会产生不利影响,因此人们研究利用这些酶 来代替有害健康的化学防腐剂和抗生素等,在食品、医药工业中得到了广泛的应 用。 .溶菌酶在食品中的应用 食品在加上、运输和保藏过程中,常常由于受到氧气、微生物、温度、湿度 等因素的影响而使食品的色、香、味及营养发生变化,甚至导致食品败坏,降低 食品的食用价值。因此,如何尽可能地保存食品原有的优良品质特性始终是食品 加工、运输和保存过程中的一个重要环节。食品腐败时,早期出现的微生物通常 是该食品特有的微生物。如果通过某种手段杀死或抑制这些特定微生物生长,便 能延长食品的保质期。近年来发现,化学合成杀菌剂都有一定的毒性,因此不宜 向食品中添加,所以用安全性高的溶菌酶进行食品防腐将与日俱增。由于溶菌 酶能选择性抑菌,在含食盐、糖等的溶液中稳定,