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钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用研究(可编辑)

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钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用研究(可编辑)钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用研究(可编辑) 钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞 毒性作用研究 ? 论文作者签名:盗豳豳 指导教师签名: 论文评阅人1: 评阅人2: 评阅人3: 评阅人4: 评阅人5: 答辩委员会主席: 委员l: 委员2: 委员3: : 委员4 委员5: 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写...
钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用研究(可编辑)
钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用研究(可编辑) 钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞 毒性作用研究 ? 论文作者签名:盗豳豳 指导教师签名: 论文评阅人1: 评阅人2: 评阅人3: 评阅人4: 评阅人5: 答辩委员会主席: 委员l: 委员2: 委员3: : 委员4 委员5: 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 或撰写过的研究成果,也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或 证而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 签字日期:2。12年。3月。3日 学位论文作者签名:荔奇孔相 学位论文版权使用授权书 有权保留并向国家有关部门 或机构 本学位论文作者完全了解逝鎏盘茔 送交本论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿态堂可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播,可以采用 影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 导师签名: 豸赢稠 签字日期:2012年03月03日 签字日期:2012 年03月03日 致 谢 衷心感谢我的导师严杰教授两年多来给予的精心指导和严格要 求,他深厚的学术造诣、敏捷的思维、渊博的知识和严谨的工作态度 使我终生受益! 衷心感谢其他老师的悉心指导! 真诚地感谢浙江大学医学院病原生物学教研室全体同学!他们在 我的实验和生活中给予很大的帮助和关心,在此致以深深的谢意! 最后特别感谢我的亲人朋友在我繁忙的学习、科研中给予的理解、 支持和帮助! 钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性 作用的研究 浙江大学医学院 微生物学 硕士研究生 辛晓阳 师 严 杰教授 导 中文摘要 目的 了解钩端螺旋体毒素一抗毒素系统中毒性蛋白V印C的功能及其对宿 主细胞的毒性作用( 方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PcR 扩增全长删(螂(阳叫贮基因并构建其原核表达系统(采用SDS(PAGE检 活性(分别采用实时荧光定量RT(PCR和we妣mBlot试验,检测问号钩体赖株 感染THP(1细胞前后唧口和v印C基因转录及表达水平的变化(采用免疫荧光激 光共聚焦显微镜法检测VapB和VapC蛋白在问号钩体赖株感染THP(1细胞中表 (8试剂检 达情况(构建vq加和嘟基因真核表达载体并转染细胞,采用CCK 测VapB和VapC蛋白对细胞活性的影响( 结果所克隆的咖和v掣C基因核苷酸及氨基酸序列与文献报道完全相 不水解DNA(问号钩体赖株感染THP(1细胞后,',印曰和嘟基因转录及表达 ? 水平均显著上调,部分毒性蛋白V印C外分泌(问号钩体赖株感染细胞内可检出 毒性蛋白VapC,转染唧C基因的人肾小管上皮细胞HEK293大量死亡( 结论 问号钩体赖株vapC蛋白为I酬A酶,可在感染宿主细胞过程中外分泌 并对细胞有明显毒性( 关键词 致病性钩端螺旋体;毒素一抗毒素系统;毒性蛋白;核酸酶 活性; 细胞毒性 ?l and host Nuclease cellsoftoxic ac“Vitycytotoxicit ,to protein V|apCproduced by,Ep卸办?species of and Departmentmicrobiologyparasitology Medical of Science,Zh College ejiangUniVersi哆 Xin PostgraduateXiaoyang Tutor Pro,YanJie Abstract Todete肌ine山ef(unctionoftoxic i11toxiIl ,锄titoxiIl objective proteinVapC tlle hostcellsoft11e toxic system of,印fD(妒妇?species锄dcytotoxic时t0 protein( Methods DNAof L( Usinggenomic pathogellicinterrogaIlsSerogroup Lai弱tlle PCRswerc Icteroh北mo砷agi??r0V盯Lai蛐商n template,seVeral pe雨册edto锄pli匆enth唧E唧C锄dVq阳C of proka巧oticexp托ssionSystemsV印鼠V印C觚d唧8Cgen懿we他 conStllJcted( ofthe recombinaIlt w嬲detected Expressionta唱et protei船rV印B锄drvapC by SDS―PAGE锄dt11e we陀ex仃讹tedNi―NTA expresSedrv印B锄drVapC by a硒n时 t0 the 0r DNAsI斟Asf而m厶 chromatography(ActiV时of rVapB锄drVapClySc Lai卸dTHP-1cellsweretllendete肌ined(Theof 拥,P,rDg口脚S仃aill ch 锄ges of of,( Lai n彻Scription锄dexpression M邮锄d崛pCgenes 咖g口舾s缸试n befo陀锄d心eriIlf(ectionof11 P-lcellswe他detected n?陀scent by陀d-time RT-PCR觚dWestem of q啪titative Blot鹤豫y(neex畔豁ionV印B柚d VapC L THP―lcellsw勰ex锄ined Lai-in矗篙ted 州ei璐iIl加饱rr0:g口凇stmin by immunofluoresCencecoIlf(ocal Vecto璐ofthe IIlicr0Scopy(TheeIll【a巧06cexp陀ssion fortra船氏tionofhoStcells卸dCCK一8 V印曰锄dv口pCgenes we陀genemted agent w弱usedt0detectthe e仃,tof ofhoSt leptospiraIVapB趾dVapCpmtei璐onactiVit r cells( IV and Results’I’henucleotide acid ofthe putatiVe锄ino sequencescloned唧 曰 and were identicalwiththe completely V印Cgenes reportedcorrespondinggenes(The constlllcted could and prokaD,oticexpressionsystems express rVapC, rV印B RNase butdid not DNA(WhenL rVapCdisplayed aVtiVity lyse respectiVely( Laiinfected THP―l of cells,the 加fP,(厂Dg口瑚strain tr锄scription锄 dexpressionvq阳 and w弱secretedf如mtlle genes、?e佗upregulated锄d V印C partialVapCprotein couldbedetectableinthe,( leptospiralcells(VapCprotein 切fP,(阳g口玎(譬straill Lai-infectedTHP??1cells锄dt11em淞s inHEK293h啪anrenal monalit ,w舔obserVed cells tubulaur t11e transfection( epithelialcontainingV印Cgenethrough Conclusion Lai isaRNaSea11dissecreted VapCproteinof上(伽胞,(rDg口凇s们in infectionofhoStcells谢th obVious during c”otoxici吼 AntitoxinToxic words T0xin- Key Pathogenic三印r唧抛species;syStem; protein;Nucle硒e?tiVit ,;Cytotoxicit , V 逝延厶堂亟?堂位论塞 目i筮 目 次 !l《: 谢„„„„„„„„„„„„„„(„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(„(I 中文摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„II 英文摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„? 目次 弓l?占„„(„„„„„„„„„„„„„„„(„„„„„„„„„„„„„„„„„„(„„„„((1 第一章问号钩体感染细胞前后毒性-抗毒性系统v印B(mRNA和v螂-mI?A 水平变化研 究„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 第二章问号钩体毒素-抗毒素系统基因',伽、1,印C和v口阳C原核表达载体构 O 建及抗血清制 备„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 第三章问号钩体毒素??抗毒素系统毒性蛋白^rapc核酸酶活性检测结 j 暴„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(:19 第四章问号钩体感染细胞前后V(apc和VapB表达和分泌检测结果研 究„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(33 第五章伽和唧C细胞转染及其细胞毒性检测„„„„„„„„„„一40 讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(44 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(46 综 述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„48 作者简历及在读研期间所取得的科研成 果„„„„„„„„„„„„„„59 钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性 作用的研究 浙江大学医学院 微生物学 硕士研究生 辛晓阳 导 师 严杰教授 引言 1(1研究背景 毒素前毒素系统 toxin―antitoXin system,TA 广泛存在于原核细胞及部分 病原菌中,该系统由两个共同表达的染色体基因组成,其中一个基因编码抗毒性 蛋白 锄titoxin ,另一个基因编码可能具有DNA或l?A酶活性的毒性蛋白 toxin ,正常状态下抗毒性蛋白与毒性蛋白结合而形成无毒性的复合体 ,21(在 【1 营养缺乏、细菌应激等条件下,抗毒性蛋白表达抑制或被酶解,毒性蛋白游离, 导致细菌生长抑制或引发细菌程序性细胞死亡 bacterial celldeatll progr锄med 【2,31(在感染过程中,不少病原菌能侵入多种宿主细胞,同时也可被吞噬细胞吞噬。 因此,病原菌TA系统中毒性蛋白能否对宿主细胞产生毒性作用,是令人感兴趣 的研究课( 致病性钩端螺旋体 简称钩体 感染引起的钩体病是全球流行的人兽共患病, 但其致病机制至今未完全明了14卅(在问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因 组中,有 一个命名为v口加 抗毒性蛋白 ,v印C 毒性蛋白 的TA系统【刀(目前仅发现问 号钩体赖株唧C基因的表达产物对大肠杆菌有毒性‘踟,但未有其他研究报 道(本 研究中,我们重组表达了问号钩体赖株V却B和VapC蛋白并制备了抗血清,检测 了问号钩体赖株感染宿主细胞前后VapB和vapC蛋白及分泌情况、钩体唧C基 因转染对宿主细胞活性的影响,同时对重组问号钩体赖株VapC蛋白核酸酶活性 进行了鉴定( 1(2研究内容 1( rVapB和懈表达及纯化 2( 钩体感染THP(1细胞前后vapB(mRNA和vapC-Hlf汛A水平检测 ( 3 blot检 测 钩体感染THP(1细胞前后VapC和VapB蛋白表达和分泌weStem 4(钩体感染THP(1细胞前后VapC和VapB表达和分泌激光共聚焦显微镜检 测 5(VapC对细胞活性的影响检测 1(3技术路线: 1(rV却B和rVapC表达及纯化 1 目的基因PcR扩增 2 重组表达质粒构建 3 重组蛋白质诱导表达及纯化 2(rVapC毒性蛋白核酸酶活性检测 1 DNA酶活性检测 2 RNA酶活性检测 3( 钩体感染细胞前后v印B―mI?A和vapc??mRNA水平检测 4(钩体感染细胞前后VrapC和VapB表达和分泌检测 1 W已stemB10t检测 2 激光共聚焦检测 5(vapC对细胞活性的影响检测 2 第一章问号钩体感染细胞前后毒性(抗毒性系统vapB(mRNA和 vapc(mRNA水平变化研究 l材料 1(1实验菌株 1 问号钩端螺旋体黄疸出血群赖 国内编号:56601 1(2实验细胞株 1 人单核巨噬细胞株THP(1:中国上海细胞生物学研究所细胞库 1(3实验试剂 1 EMJH培养基:自配 2 I冲MIl640培养液:GIBCO 3 新生小牛血清:中国杭州四季青生物有限公司 4 Trizol:美国Invitrogen公司 5 无水乙醇:国药集团化学试剂公司 6 异丙醇:国药集团化学试剂公司 RT(PCRKit ReaL Time :大连宝 Takara 7 SYBR@PrimeScripimII PerfecI 生物工程有限公司 8 Triton X―lOO:美国Sigma公司 9 DEPC水:上海泽衡生物技术公司 1(4实验仪器 1 Foma Scientific公司 C02恒温培养箱:美国Foma 7500 Real-Time 2 ABIFAST PCR Biosystems公司 System:美国Applied 3 微量移液器:英国Dragon公司 3 4 QL(86l旋涡振荡器:哈尔滨其林贝尔电子技术开发有限公司 5 RNase―f把e无菌吸头:美国AXygen公司 2方法 2(1问号钩体黄疸出血群赖株的培养 问号钩体黄疸出血群赖株于豚鼠体内增毒后,取增毒后的钩体采用EMJH培 养基,以lO,的比例传代接种问号钩体,传代应少于5代(经28?5(7天培养, 培养物作400×暗视野显微镜检查,若菌体形态典型、运动活泼,菌体数?200条, 每暗视野时可供实验用( 2(2细胞株的培养 THP(1细胞株均采用含lO,灭活新生小牛血清 Fcs 的RPMIl“0培养 基, 于5,C02培养箱37?条件下培养(THP(1在实验前加入终浓度为50nM佛 波酯 PMA 刺激分化48h后,使成单层贴壁巨噬细胞( 2(3 RT-PCT引物 DNA基因的RT(PCT 用Primer5(0软件分别设计泐2和作为内参的钩体16S 引物( 上述引物委托上海英俊 ?i仃09en 生物有限公司合成( 4 2(4钩体感染实验 1640 37?培养24 培养基5,C02 h,使成单层细胞。THP(1在实验前加入终浓度为50 nM佛波酯 PMA 刺激分化48h后,使成单层贴壁单核巨噬细胞。 2 取新鲜的钩体培养物12000 min,弃上清。 94?离心15 mM min, 3 沉淀用O(Ol 4?离心15 pH7(4无菌PBS缓冲液洗涤三次,12000g 弃上清( 4 沉淀用37?预热的含2,小牛血清的l冲MI1640培养基重悬,调整菌体浓 m1( CFU, 度为lO‘7 5 弃去培养瓶中旧培养基,放入15ml含2,小牛血清的RPMI1640培养基, h、2h、4 h( 按lOO:l的比例加入钩体,分别孵育1 h和8 6 分别收集上述各个时间点的钩体。粘附在细胞表面及进入细胞内的钩体用 l,Triton X(100破碎细胞后lOOO min后收集上清中的钩体,弃去沉淀 细 g离心5 胞残体 。实验中相同时间点设钩体在含2,小牛血清的l冲MI1640培养基中孵 ?培养,并收集菌体。 育;另设一瓶钩体在EMJH培养基中37 2(5问号钩体总RNA的提取 1 12000 4?离心15min收集各时间点感染细胞后的钩体及阴性对照,彻底 g 去除上清,每份样品加入lml嘶zol试剂,充分混匀( 2 将上述样品于15(30?静置5min,使核蛋白充分解离。 在加入氯仿之前, 该样品能于(60~(70?保存至少一个月 Sec ml TROzlo试剂中 氯仿,盖紧盖子,充分剧烈振荡15 3 加入200山 1 后于15(30?静置3(5min,使其自然分层( 4 于4?12000min(离心后样品分层,上层水相中含l斟A,下层有 g离心15 机相中含蛋白和DNA( min 后,在 5 取上层水相,加入500“l异丙醇,轻轻混匀,于15(30?静置lO 管底会出现胶状沉淀,即为l州A( 6 于4?12000g离心lOmin后弃去上清( ml 7 向沉淀中加入175,乙醇 用l?aSe(fbe水配制 ,轻轻混匀,悬浮沉 淀( 在75,乙醇中于4?能保存至少一周,于(5―(20?能保存至少一年。 8 于4?7500mill后弃上清 g离心5 促溶lOmin ,(70?保存备用( 2(6 RNA的定量 取一定量l?A提取物,用l?aSe(触水稀释,在核酸蛋白检测仪上 测定 I?A的OD2?值,按下列公式计算l?A的浓度及纯度确定: I?A m咖L 40×OD260×稀释倍数 n ,1000 RNA纯品OD260,OD280F2(0 2(7反转录反应RT RT(PCRKitlI PerfectRem Time 试剂,按 下 1 采用SYBR?PrimeScriptlM 表配制RT反应液: 反应配制在冰上进行 2 反转录反应条件: 第一步:37?15min 反转录反应 第二步:85?5scc 反转录酶失活反应 PCR 2(8实时荧光定量PCR ReaI一雨me 6 1 按下表配制PCR反应液: 反应配制在冰上进行 2xsYBIPPremisEx TaqTM 25pl PCR Fonvard Primer 10“M 2山 PCRReverse Primer 10“M 2“l 50XROXReferencelI Dye l肛l 模板 cDNA溶液 5山 dH20 to up 50“l 7500FASTReal―TimePCR 2 应用ABI System进行RT(PCR反应,反应采用 二步法,参数为: 。‘i一。。j―i。”„:j(1‘|一+‘’jI’|魈 rIuluL―u‘ j 一l?々IlII口-oyol口I * I ThermalProfile Autolncr Rate Ramp I I ((。 , ,。( ,„,0 1 2 3 StageStage Stage Reps:匝]Reps:圈Reps:口 950 950 l l l 0。05 _0:30 l 11 , l:预变性 Stage l Reps: 95?30Sec 2:PCR反应 Stage Reps:40 95?5?c 60?34sec 设Dissociation Stage 熔解曲线 7 3 反应完成后确认RT(PCR反应的扩增曲线和熔解曲线,并用2‘丛cT法计算 RQ值( 3实验结果 在RPMI l“O培养液中,问号钩体赖株v印B(mI斟A和v印C(mI喇A水平均 有上调,但在8 h孵育过程中菌维持在同一水平(问号钩体赖株感染THP(1细胞 2 h时,VapB??mI?A和vapC-mRNA水平明显高于I冲MI1640培养液中钩体 P O(05 ,在8 3(1 ( 5 1 0 感染时间 h 图5 问号钩体赖株感染THP-l细胞前后vapB-mRNA和vapC(mI喇A水平变 化 leVeIs Laibef0豫 and疵r Fig(5Ch柚g豁of V印B-锄dvapC-mRNAOf厶砌锕99册,sn面n inf(ectionof1'HP(1cens 8 养液内等量钩体vapB(mRNA及vapc-mRNA水平比较尸?0(05 4实验讨论 RT(PCR是用来量化一个基因表达水平的重要手段118】。众所周知,原核细胞 的蛋白表达主要在转录水平上调控,为了探讨问号钩体感染细胞后vapB(mI矾A 及vapC(mRNA转录水平的变化,我们建立了问号钩体感染细胞模型,利用 RT(PCR技术检测了ml酬A转录水平,我们的研究显示,问号钩体分别感染THP(1 细胞后,vapB(mRNA及vapC(ml?A转录水平都有明显升高,提示?衄和’,印C 可能在钩体的致病过程中可能发挥重要作用( 5小结 问号钩体感染细胞后唧B和’,印C基因转录水平发生显著提高,提示 可能是 重要的致病毒力因子。 9 第二章问号钩体毒素(抗毒素系统基因删、印C和v印曰C原 核表达载体构建及抗血清制备 l材料 1(1实验菌株 1 问号钩端螺旋体黄疸出血群赖株 国内编号:56601 2 大肠杆菌克隆株DHlop:美国Invi仃ogen公司 3 大肠杆菌表达株BL2l DE3 :美国Invitrogen公司 1(2实验质粒 1 pMDl8一T:大连宝 Taka阳 生物工程有限公司 2 pET42a:美国Invi仃ogen公司 1(3实验培养基 1 LB固体培养基:英国OxOID公司 蛋白胨 lOg 酵母提取物 59 NaCl 109 ml溶解后,用10 加去离子水800 mol,LNaOH 约0(27m1 将调节 培养基 min( 12l?灭菌15 ml, pH值至7(0后,用去离子水定容至1000 2 LB液体培养基:英国OXOlD公司 1000ml miIl LB液体培养基中加入15 g琼脂粉 Bacto(agar ,12l?灭菌15 后,待温度降至60?左右时,加入 或不加 相应的抗生素,倾注9cm平板( 10 3 5XEMJH培养基: ml, 上述试剂适量ddH20充分溶解并调pH值至7(2,7(4后,用ddH20定容至 500 0(22岬孔径滤器过滤除菌,分装后冷冻保存(使用时用无菌ddH20稀释5 倍( 1(4实验试剂 1 细菌基因组DNA提取试剂盒:上海捷瑞 Generay 生物技术有限公司 2 诎aRaEX PCR试剂金:大连宝生物 儆ara 工程有限公司 Taq I、 ho 3 限制性内切酶Nde I:大连宝生物 做ara 工程有限公司 4 T4 DNALig弱e:大连宝生物 诎ara 工程有限公司 5 lKb DNAMarker:FementaS公司 6 中分子量蛋白Marker:上海生工生物工程有限公司 7 T-A克隆试剂盒:大连宝生物 诎ara 工程有限公司 8 100 m‖ml氨苄青霉素:用双蒸水配制,除菌过滤后,分装(20?避光保存( 9 lOO m‖ml卡那霉素:用双蒸水配制,除菌过滤后,分装(20?避光保存( 10 20 200 m‖mlX―gal 5-嗅-4-氯-3-吲哚??p―D一半乳糖苷 :X-galmg,用二甲 基甲酰胺 DMF lOml配制,分装(20?避光保存( 11 DNA胶回收试剂金:上海申能博彩生物公司 12 质粒提取试剂盒:上海申能博彩生物公司 LTD G-10 :西班牙Gene 13 琼脂糖 RegularAgaroseComp锄y 14 0(10M 后,4?保存 Illl 15 0(10M ml,用85 CaCl2 含15,甘油 :CaCl2 Si舯a 1(119,甘油15 去离子水溶解,滤过除菌后,4?保存 16 100mM IPTG:用双蒸水配制,滤过除茵后,分装(20?避光保存( 17 三羟甲基氨基甲烷 Hs :上海泽衡生物技术公司 18 lO,SDS:用双蒸水配制,室温保存( 19 甘氨酸 Glycine :上海泽衡生物技术公司 20 丙烯酰胺:上海泽衡生物技术公司 21 甲叉双丙烯酰胺:上海泽衡生物技术公司 22 lO,过硫酸铵:用双蒸水配制,室温保存( 23 四甲基乙二胺 TEMED :Si肿a公司 24 浓盐酸:国药集团化学试剂公司 25 30,丙烯酰胺:丙烯酰胺29 g,甲叉双丙烯酰胺1(Og,适量水加热助 溶后, 定容至100ml,过滤后用棕色瓶4?保存( l50 26 5X上样缓冲液:SDs ml,澳甲酚兰25mg,喇s mg,p―DTT 1(og,甘油5 1(O ml,加双蒸水至lOml,室温保存( 8(35X 15(1 5 Tris一甘氨酸电泳缓冲液:Tris g,甘氨酸94g,SDSg, 27 pH 适量双蒸水溶解,定容至1000ml,室温保存( O(25 ml,双蒸水 45ml, 28 染色液:考马氏亮蓝l也50 ml,冰乙酸lO g,甲醇45 过滤后,室温保存( 29 脱色液:lO向冰乙酸,45ITIl甲醇,45Illl双蒸水,混匀室温保存( 8(81(5M 18(2 TriS-Hcl分离胶缓冲液:,s 30 pH g,适量双蒸水溶解,用 浓 ml,滤菌后4?保存( 盐酸调pH至8(8,定容至100 6(8 1(0 12(1 M嘶s-HCl浓缩胶缓冲液:Tris 31 pH g,适量双蒸水溶解,用 浓 IllI,滤菌后4?保存( (8,定容至100 盐酸调pH至6 32 NTA树脂:上海申能博彩生物公司 12 1(5实验仪器 1 PCR扩增仪: 美国Perkin(Elmer公司 2 DYY-6C型电泳仪:北京六一仪器厂 3 电泳玻璃板:美国Bio(Rad公司 4 核酸蛋白测定仪:美国Bio(Rad公司 Doc 5 Gel XR凝胶成像系统:美国Bio(Rad公司 6 超纯水处理系统:美国Millipore 7 Delta320酸度计:上海Mettler-ToledoInstnlmentsCO(L1’D 8 sw二CJ(2F洁净工作台:苏州安泰空气技术有限公司 9 DK(S12电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司 10 HZ(9211KB摇床:华利达实验设备有限公司 11 WGP(300细菌恒温培养箱:重庆车达实验仪器厂 12 THZ(82型恒温水浴振荡器:江苏金坛富华电器公司 13 FD20l稳压稳流电仪系统:上海医用仪器厂 14 QL(86l型微型旋涡振荡器:太仓市科教器材厂 15 JY92(II型超声破碎仪:宁波新芝仪器公司 16 微量移液器:英国Drogan公司 17 O(22岬滤器:美国Millipore 18 Fresco高速台式离心机:美国Heraeus公司 19 高速台式离心机:美国Sigma公司 20 电磁炉:中国苏泊尔公司 21 TU(18l型紫外分光光度计:北京普析通用仪器实验公司 22 玻璃层析柱:国产 23 780Hw二1型恒磁力搅拌器:杭州仪表电机厂 SoaviS(P(A 24 细菌破碎仪(:意大利Nir0 2方法 2(1问号钩体的培养 采用EMJH培养基,以lO,的比例传代接种问号钩体,经28?5(7天 培养, 培养物作400×暗视野显微镜检查,若菌体形态典型、运动活泼,茵体数芝 200条, 每暗视野时可供实验用( 2(2问号钩体基因组DNA提取 1 取1(5―3(0ml钩体培养液,12000 4?离心lOmin,去上清液( g 2 加95TE悬浮沉淀,并加0(5 pl pl mg干 粉 蛋 lO,SDS,5山20m咖l 或l h( 白酶K,混匀,37?保温l 3 加155mol,L NaCl,混匀( pl 4 加15 min( plCTAB,NaCl溶液,混匀,65?保温20 min,将上清水相 移 5 用等体积酚:氯仿:异戊醇 25:24:1 抽提,12000g离心lO 至干净离心管( 6 用等体积氯仿:异戊醇 24:1 抽提,取上清水相移至干净管中( 7 加l倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止lOmin,沉淀DNA( 8 12000 g离心lOmin,弃上清( 9 70,乙醇漂洗DNA沉淀一次,挥干,沉淀溶解于适量TE缓冲液中,加 入 h( 37?消化l-2 lO一20鹇RN撇, 10 重复步骤 5 ( 8 ( 11 70,乙醇漂洗DNA沉淀一次,吸干,沉淀溶解于50“lTE缓冲液,取少量 DNA通过核酸蛋白测定仪和电泳检测钩体基因组DNA的浓度和纯度,其余(20? 保存备用( ml 注:CTAB,NaCl溶液:4(1 NaCl溶解于80ddH20,缓慢加入10 g g十六烷基 IIll( 三甲基溴化铵 CT蛆 溶解后,定容至100 14 2(3大肠杆菌DHlop和BL2l DE3 感受态细胞的制备 h左右( 1 分别接种DHlOp和BL2l DE3 于LB固体培养基,培养12 ml LB液体培养基37?振 荡 1 分别挑取单菌落DHlOp和BL21 DE3 于lO 培养约12h以上。 m1 2 取lml过夜培养物转接于100LB培养基中,在37?摇床上剧烈振荡培 h 250(300 养约2(5(3 g ( M 3 将O(1 CaCl2溶液置于冰上预冷( 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 min( 4 将培养好的菌液移至50ml无菌圆底离心管中在冰上冷却lO min( 5 4?下3000 g冷冻离心5 M 6 弃去上清,加入30ml预冷O(1CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀, 使细胞重新悬浮,在冰上放置30min。 min( 7 4?下3000 g冷冻离心5 8 弃去上清,加入30ml预冷O(1M CaCl2 含15,甘油 溶液,用移液枪轻轻 上下吸动打匀,使细胞重新悬浮( 9 细胞悬浮液可立即用于转化实验或一70?超低温冷冻贮存备用。 2(4问号钩体唧曰(唧C(唧BC基因的PCR扩增 2(4(1引物设计 引物 基因的限制性核酸内切酶图谱后,自行设计引物,核酸内切酶位点分 别为 NdeI CAT I CTC ATG 和xhoGAG (引物序如下表: 上述引物由上海英俊 Invi们gen 生物技术有限公司合成( 2(4(2问号钩体?衄(唧C(v印BC基因的扩增 以问号钩体基因组DNA为模板,扩增三爹基因,按下表配制PCR反应 体系( PCR反应条件: 2(5 PCR扩增产物电泳 1 配制lXTAE级冲液1000血( mllx 2 取50TAE级冲液配制1(5,琼脂糖凝胶( 16 3 将PCR扩增产物加入lOxBu腩r后,进行琼脂糖凝胶电泳。 Loading 2(6 PcR扩增片段的纯化 1 在紫外灯下从琼脂糖凝板上切取含目的片段的胶块,胶块要尽量小,以免影 响回收率( ml SN。 2 将凝胶放入1(5 EP管中,并将胶块切小,加入500“l溶胶液Solution 3 将EP管放入55?水浴锅中,保温5min,其间混匀2(3次,使凝胶溶解, Solution B,混匀。 胶完全融化后,加入lOO斗l 4 将3S柱放入2 min, ml废液管中,将上述混合液转移至3S柱中,室温放置2 min( 室温lO000 g离心l WaSh 5 取下3S柱,弃去废液管中液体,重新放回3S柱,并在3S柱中加入600“l Solution后,lOOOOmin( g离心l 6 重复步骤 5 一次( min( 7 取下3S柱,弃去废液管中液体,重新放回3S柱,lOOOO g离心2 8 将3S柱放入一无菌的1(5ml EP管中,加入30pl洗脱缓冲液,室温放置 2min min。 后,10000 g离心1 ml 9 弃去3S柱,1(5EP管中的液体即为回收的目的扩增DNA片段( 2(7目的基因与pMD-18T的连接 T-A克隆 在0(5 ml微量离心管中制备下列连接体系: 8一TVector pMDl 1(O“l 目的基因DNA片段 4(O“l Solution I 5(0“I h( 混匀,16?连接2 17 2(8连接产物的转化 1 配LB固体培养基平板 含lOOp‖ml氨苄青霉素 ( 2 将上述lO IIl连接液加入至冻融的DHlop感受态细胞中,轻轻混匀,冰中 min(( 放置30 min( 3 42?水浴热激90sec后,再在冰中放置l min( 4 立即加入890肛l37?预热的LB液体培养基,37?180巾m振荡培养60 5 吸取200 20 pl培养的复苏菌液均匀涂布在事先涂有40pl mg,mlx(gal 和20 100 IIl mg,ml IPTG的含lOOp咖l氨苄青霉素LB固体培养基平板上,室温待 涂布 的液体基本吸干后,37?倒置培养12(16 h,可见菌落出现,重组子呈现白色 菌落, 非重组子为蓝色菌落( ml 1 挑取平板上的单个分离良好半透明的白色菌落,接种于lOLB液体培养 基 含lOO h( p咖ll氨苄青霉素 中,37?220g振荡培养16 2 取3 ml培养过夜的菌液于EP管中,5000 min后弃上清( g离心5 3 取90 min( pl溶液I,可加入5mg溶菌酶,强烈振荡混匀,冰上放置20 4 加入120 pl溶液II,轻轻混匀后加入15 pl氯仿,轻轻颠倒数次,冰上 放置 lO min,溶液变粘稠 如无此现象请停止实验 ( 5 加入180 min,出现沉 pl冰预冷的溶液III,温和颠倒混匀,冰上放置10(30 淀( 6 4?12000 g离心lO一20min后取上清 上清中含质粒DNA ( 7 上清中加入2倍体积的无水乙醇或O(6倍体积异丙醇,于(20?放置2h,以 沉淀DNA( 8 12000 RNA g离心20 含20p咖l min后弃上清,倒置干燥,沉淀用30山TE 酶A 溶解,37?放置15(30min( 9 用等体积酚、酚:氯仿 1:1 及氯仿各抽提一次,静置5miIl后12000 g 高 心5 min,并取上清 沉淀主要为蛋白 ( I矗 ―――――――――――――――――,―――――――――――――――――――――――――――――――――――一 10 加入l,10体积的3 6(5 ( mol,L乙酸钠 pH h后12000 11 加入两倍体积的无水乙醇,于(20?静置2 min并弃上 g离心15 清。 12 用15 pl75,乙醇洗涤一次后干燥。 TE溶液并于(20?保存( 13 加入30“l 溶液I:50mM葡萄糖 25 mM嘶s-HCI pH8(0 lOmM EDTA pH8(O 溶液I可成批配制高压下蒸气灭菌15min,贮存于4?( MNaOH 溶液II:O(2 1,SDS ml 溶液III:5(OM乙酸钾80 冰乙酸12ml 水8mI( TEBu仃er: 5m11(O 8(O M,s pH l mlO(5M 8(0 EDTA pH 494 ml双蒸水 1 将提取的目的基因重组质粒按下表配制酶切反应体系: lOXKBuffer 2山 Nde I lpl XhoI lpI 重组质粒DNA lOpI t0 DDH20 up 20山 19 37?水浴酶切4h( Bufrer在1(5,琼脂糖凝胶上电泳, 确认 2 将酶切好的反应液加入10×Loading 切出的目的基因片段的位置。 2(1l插入的目的基因DNA片段序列测定 取酶切结果阳性的上述培养菌液1(5 ml,委托上海英俊 1nvitrogen 生物 技 chajn te咖ination method 测定插 术有限公司采用双脱氧链末端终止法 dideoxy 入片段的DNA序列( 2(12三个基因原核表达体系的建立 2(12(1质粒提取 DHlOp重组克隆茵于含100pg,ITll氨苄青霉素LB固体培养基上;接种含 有pET42a 的大肠杆菌DH5a于含50“咖l卡那霉素LB固体培养基上,37?培养过夜( ml 2 分别挑取上述平板上的单菌落于lO LB液体培养基中,需加相应浓度 的 抗生素,37?2209振荡培养过夜( 3 分别提取质粒,步骤同2(9 2(12(2目的质粒和pET42a的双酶切 1 将提取的目的基因重组克隆质粒按下表配制酶切反应体系: K 10XBu仃er 2(O山 NdeI 1(O“l Xho I 1(0pl 重组质粒DNA 10(O山 to ddH20 up 20肛l h( 37?水浴酶切4 2 将酶切好的反应液加入lOxLoadingBu艉r在1(5,琼脂糖凝胶上电泳 并确认 切出各目的片段的位置。 2(12(3目的基因片段和线性表达质粒pET42a的纯化 确认切出各目的片段的位置后,有洁净的手术刀切割下所要回收的目的条 带,用3S柱离心式琼脂糖DNA回收试剂盒,回收目的基因片段和线性化pET42a, 操作步骤同2(6( 2(12(4目的基因和表达质粒pET42a的连接 在O(5ml微量离心管中制备下列连接体系: T4DNABuffer 。lOX LigaSe 2(5pI 目的基因片段 1(0pl 1(0“l 线性化pET42a T4DNA Opl LigaSe 1( to ddH20 25pl up 16?连接过夜。 2(12(5连接产物转化 亚克隆 操作步骤同2(8,但培养基抗性为50p咖l卡那霉素,且不加X(gal和IPTG( 感受态细胞为E(cD疗BL2lDE3( 2I 操作步骤同2(9 操作步骤同2(10 2(12(7插入的目的基因DNA片段序列测定 操作
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