紫茎泽兰提取液对两种植物病原真菌的抑制作用研究

紫茎泽兰提取液对两种植物病原真菌的抑制作用研究 摘要：用生长速率法测定紫茎泽兰（ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ）的４种有机溶剂提取液对禾谷镰刀菌（ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｃａｒｕｍ）、大豆炭疽菌（ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｙｃｉｎｅｓ ｈｏｒｉ）的抑制作用。结果表明，４种溶剂提取液对２种植物病原真菌有良好的抑制作用，提取溶剂的差异影响提取液的抑菌效果，同种溶剂提取液的抑菌作用随浓度降低而减弱。１００．００ ｍｇ／ｍｌ乙醇、丙酮、乙醚提取液对２种病原真菌的抑菌率为１００％。低浓度乙醇、丙酮提取液对２种病原真菌仍有良好的抑制作用。乙醇和丙酮可以作为溶剂用于提取紫茎泽兰有效杀菌活性物质，其提取物可用于植物源杀菌剂的研发。关键词：紫茎泽兰；植物病原真菌；抑菌活性；生物农药inhibition effect of eupatorium adenophorum extract on two kinds of plant pathogenic fungiｚhao ｃｈｕｎ-ｆｕａ，ｗang ｙｏｎｇ-ｙａｎｇa，ｌiu ｒｕｉ-ｈｕａａ，ｘie ｘｉａｎｇ-ｍｉｎｇb（ｂｅｉｊｉｎｇ ｆｏｒｅｓｔｒｙ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ａ．ｌｉａｎｇxｉ ｐｉｌｏｔ ｃｌａｓｓ；ｂ． ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ： ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｓ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ 4 kinds of ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ organic reagent ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｎ ２ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ of ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｃａｒｕｍ and ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｙｃｉｎｅｓ ｈｏｒｉ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄｓ． ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅd ｔｈａｔ ４ ｏｒｇａｎｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ had ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙｐｈａ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ２ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｇａｎｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｈａd ｓｏｍｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ． ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｄｅｃｒｅａｓｅd ｗｉｔｈ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔ reducing． ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ethanol， acetone and diethyl ether ｅｘｔｒａｃｔｓ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ １００％ ａｔ １００．００ ｍｇ／ｍｌ． ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ａｃｅｔｏｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｓｔｉｌｌ ｈａd ｇｏｏｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｔ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ａｃｅｔｏｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｅ． ａｄｅｎｏｐｈｒｕｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｔｈｅ ｎｅｗ ｐｌａｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ｂｉｏ－ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ．ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｕｐａｔｏｒｉｕm ａｄｅｎｏｐｈｒｕｍ； ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ； ａｎｔｉ－ｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｂｉｏ－ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ当前，植物源杀菌剂的研究、开发和利用成为解决化学农药所产生诸多问题的重要途径［１］。植物源杀菌剂作为生物合成农药，具有低毒、选择性高、易降解等特点［２］。寻找植物中的天然杀菌、抑菌活性物质成为新型无公害杀菌剂的研究热点［３］。紫茎泽兰（ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ）属于菊科（asteraceae）泽兰属（eupatorium）多年生草本植物，原产于中美洲的墨西哥和哥斯达黎加，大约于２０世纪４０年代由中缅边境通过自然扩散传入我国云南省，目前在我国西南地区大范围蔓延，对农业生产和生态环境造成极大危害［４］，已成为我国重要的入侵物种。对于紫茎泽兰，目前尚无有效防治。由禾谷镰刀菌（ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｃａｒｕｍ）引起的小麦赤霉病是世界性流行病害，由大豆炭疽菌（ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｙｃｉｎｅｓ ｈｏｒｉ）引起的大豆炭疽病是我国大豆产区的重要病害，这２种病害对我国农业造成巨大损失。目前这２种病害难以用化学农药防治，而且过量使用农药存在环境污染、农药残留等问题。研究表明，紫茎泽兰中含有苯丙素酚类、黄酮类和三萜类等生物活性物质［５，６］。其有机溶剂提取物对番茄青枯病菌、棉花枯萎病菌和苹果腐烂病菌等植物病原真菌具有良好的抑制作用［７，８］。但关于紫茎泽兰提取物对禾谷镰刀菌和大豆炭疽菌的抑制作用研究尚未见报道。本研究用乙醇、丙酮、乙醚和乙酸乙酯为提取剂，从紫茎泽兰中提取抑菌活性物质，检测不同浓度提取液对禾谷镰刀菌和大豆炭疽菌的抑菌率，为利用紫茎泽兰开发植物源杀菌剂提供参考。１  材料和方法１．１  试验材料１．１．１  病原物  禾谷镰刀菌、大豆炭疽菌菌种由中国农业科学院植物保护研究所惠赠。１．１．２  紫茎泽兰样品  由北京市农林科学院卢向阳提供，样品采自云南。阴干后置于烘箱中６０ ℃烘至恒重，小型高速粉碎机（ｚｎ－０２）粉碎后过４０目筛制备粉末，４ ℃密封保存备用。１．１．３  有机溶剂  提取所用溶剂乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯为市售纯。１．２  试验方法１．２．１  紫茎泽兰提取液的制备  称取紫茎泽兰粉末１０ ｇ，加有机溶剂１００ ｍｌ，超声波振荡３０ ｍｉｎ，抽滤，滤渣反复浸提３次，合并滤液于旋转蒸发仪（ｌａｂｏｒｏｔａ ４０００）中制成浸膏，然后用无菌水定容至１００ ｍｌ，即为紫茎泽兰粉末１００．００ ｍｇ／ｍｌ的试验母液。按等比稀释法，将母液用无菌水稀释至５０．００、２５．００、１２．５０、６．２５ ｍｇ／ｍｌ，移入具塞的刻度试管中，加塞于冰箱中０～４ ℃保存备用。１．２．２  病原菌菌饼的制备  将禾谷镰刀菌、大豆炭疽菌菌种接种到培养皿中制备好的ｐｄａ平板上，置于２８ ℃恒温箱内培养６～７ ｄ，待菌落长满培养皿，用打孔器制取菌饼。１．２．３  抑菌率测定  共设６个处理３个重复。分别取１００．００、５０．００、２５．００、１２．５０、６．２５ ｍｇ／ｍｌ ５个浓度梯度的紫茎泽兰提取液５ ｍｌ与４５ ｍｌ的ｐｄａ培养基在６０ ℃下混合均匀，５ ｍｌ无菌水与４５ ｍｌ ｐｄａ培养基混合作为对照，制备平板，冷却后在超净工作台中将菌饼放于平板中央，２８ ℃恒温箱中培养４～５ ｄ。十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。抑菌率＝（对照菌落直径－加提取液平板菌落直径）／（对照菌落直径-菌饼直径）×１００％。２  结果与分析２．１  紫茎泽兰提取液对禾谷镰刀菌的抑制作用各处理对禾谷镰刀菌生长的影响见表１。从表１可见，紫茎泽兰提取液对禾谷镰刀菌有良好的抑制作用。当提取液浓度为１００．００ ｍｇ／ｍｌ时，除乙酸乙酯提取液外，其他提取液的抑菌率均达到１００％。在４种不同溶剂系统的提取液中，在较高浓度时以乙醚提取液抑菌效果最好，１００．００ ｍｇ／ｍｌ和５０．００ ｍｇ／ｍｌ时抑菌率均达到１００％；紫茎泽兰乙酸乙酯提取液的抑菌效果较差，其浓度为１００．００ ｍｇ／ｍｌ时，抑菌率为８２％。当提取液的浓度为６．２５ ｍｇ／ｍｌ时，乙醇提取液的抑菌率最高，为４８％；丙酮提取液次之，抑菌率为３６％。２．２  紫茎泽兰提取液对大豆炭疽菌的抑制作用不同紫茎泽兰提取液对大豆炭疽菌生长的影响见表２。从表２可见，４种不同溶剂系统的紫茎泽兰提取液对大豆炭疽菌的生长均有抑制作用。当提取液的浓度为１００．００ ｍｇ／ｍｌ时，除乙酸乙酯提取液外，其他提取液的抑菌率均达到１００％。丙酮提取液的抑菌效果最好，其浓度降至６．２５ ｍｇ／ｍｌ时抑菌率仍可达到７３％，乙醇提取液次于丙酮，浓度降至６．２５ ｍｇ／ｍｌ时抑菌率为６１％。３  小结与讨论紫茎泽兰的４种有机溶剂提取液对禾谷镰刀菌、大豆炭疽菌有良好的抑制作用，除紫茎泽兰的乙酸乙酯提取液外，其他３种溶剂的提取液浓度为１００．００ ｍｇ／ｍｌ时对２种植物病原真菌的抑菌率均达１００％。不同溶剂提取液对同种植物病原真菌的抑菌效果不同，同种溶剂提取液对植物病原真菌的抑菌效果随浓度的降低而下降。综合来看，乙醇和丙酮提取液对２种植物病原真菌的抑制作用较强，在其较低浓度时仍具有较好的抑菌效果。乙醇和丙酮可以作为溶剂用于提取紫茎泽兰有效杀菌活性物质，其提取物可用于植物源杀菌剂的研发。禾谷镰刀菌、大豆炭疽菌是常见的植物病原真菌，长期以来造成严重的危害。目前以化学农药为主的防治方法有污染环境、造成农药残留、使病菌产生抗药性等诸多缺点，而植物源杀菌剂能克服这些不足［９］。目前利用外来入侵植物紫茎泽兰进行植物源杀菌剂的研究已取得一些成果，李丽等［１０］利用紫茎泽兰研究生物农药获得了发明专利；张妙直等［８］利用紫茎泽兰６种有机溶剂提取液对苹果腐烂病菌等４种真菌进行抑菌试验，结果表明提取液对植物病原真菌有良好的抑制作用；张培花等［１１］的研究表明，紫茎泽兰汁液对马铃薯晚疫病菌有较强的抑制作用，这些为利用紫茎泽兰开发植物源杀菌剂提供了良好的基础。紫茎泽兰的提取物是一种混合物，可能其中某些物质对病原真菌的生长有促进作用，其抑菌活性物质仍需进行分离，对于抑菌活性物质的杀菌谱、作用方式、作用机制及在活体植物上的杀菌效果有待进一步研究。相信随着对紫茎泽兰的化学成分和其用于植物病害防治研究的深入，紫茎泽兰将可以变害为宝，利用于开发植物源杀菌剂。参考文献：［１］ 王大鹏，王进忠，孙淑玲，等． 植物源农用杀菌活性物质研究与应用前景［ｊ］． 北京农学院学报，２００１，１６（３）：７５－７９．［２］ 顾海莎． 植物源农药研究进展综述［ｊ］． 安徽农业科学，２００７，３５（２４）：７５２０－７５２１．［３］ 张  兴． 试论无公害农药［ｊ］． 西北农业大学学报，１９９５，２３（６）：９０－９５．［４］ 鲁  萍，桑卫国，马克平． 外来入侵种紫茎泽兰研究进展与展望［ｊ］． 植物生态学报，２００５，２９（６）：１０２９－１０３７．［５］ ｄｉｎｇ ｚ ｈ， ｄｉｎｇ ｊ ｋ． ｅｕｐａｔｏｒａｎｏｌｉｄｅ， ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ ｌａｃｔｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ ａｄｅｎｏｐｈｏｒｕｍ［ｊ］． ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９９，１０（６）：４９１．［６］ 闫乾胜，杨  婕，李华民，等． 入侵物种紫茎泽兰化学成分及生物活性研究进展［ｊ］． 北京师范大学学报（自然科学版），２００６，４２（１）：７０－７３．［７］ 李丽萍，谢响明，宋洪英，等． 紫茎泽兰提取物对番茄青枯菌的抑菌作用及其机理［ｊ］． 生物技术通报，２０１０（７）：１４６－１５２．［８］ 张妙直，田兆丰，刘佳磊，等． 紫茎泽兰提取物对几种植物病原真菌的抑制作用［ｊ］． 安徽农业科学，２０１０，３８（１２）：６０９０－６０９１．［９］ ｌｙｏｎ ｇ ｄ， ｒｅｇｌｉｎｓｋｉ ｔ， ｎｅｗｔｏｎ ａ ｃ． ｎｏｖｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ： ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｉｍｍｕｎｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［ｊ］． ｐｌａｎｔ pａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９５，４４（３）：４０７－４２７．［１０］ 李  丽，尹  芳，张无敌．紫茎泽兰不同部分水提液抑制植物病原真菌的研究［ｊ］． 农业技术与装备，２００８（４）：２２－２３．［１１］ 张培花，罗文富，杨艳丽．紫茎泽兰汁液及其萃取物对马铃薯晚疫病菌的抑制作用［ｊ］． 西南农业学报，２００６，１９（２）：２４６－２５０．