SHR大鼠前额叶皮层基因表达谱特征的初步分析

SHR大鼠前额叶皮层基因达谱特征的初步 SHR大鼠前额叶皮层基因表达谱特征的初 步分析 388中国儿童保健杂志2007年O8月第15卷第4期CJCHCAug.2007.Vol15,NO.4 文章编号:1008—6579(2007)04—038803 SHR大鼠前额叶皮层基因表达谱特征的初步分析 池霞,郭锡熔,洪琴,费莉,郭梅,潘晓琴,陈荣华 【基础科研论着】 (1南京医科大学附属南京妇幼保健院儿保科,江苏南京210004;2南京医科大学儿科研究所,江苏南京210029) 中图分类号:R749.94文献标识码:A 摘要:【目的】探讨注意缺陷多动障碍 (attention-deficithyperactivitydisorder,ADHD)动物模型SHR(sponta— neouslyhypertensiverats)大鼠与对照组WKY(Wistar-Kyotorats)大鼠前额叶组织基因表达谱差异,试图从基因网络角 度全面理解ADHD的分子机制及差异表达基因与其生物学特征间的关系.【方法】提取SHR/WKY大鼠前额叶组 织mRNA,反转录成cDNA,体外转录并生物素标记cRNA,片断化后,分别与Affymetrix公司制备寡核苷酸RAE230A 基因芯片杂交,对二者差异表达基因进行生物信息学分析.【结果】 SHR大鼠与对照组WKY大鼠前额叶皮层组织 中差异表达2倍以上的探针组数209个.对代表已知功能的67个独 立基因进行分类,结果发现差异表达基因以神经 发育相关,代谢相关,信号转导,免疫相关,转录调节相关基因为主,同 时还涉及突触可塑性,髓鞘形成,学习记忆,高血 压,细胞凋亡等不同层次,不同功能的基因群.【结论】SHR大鼠前额 叶皮层组织的基因表达谱存在神经发育相关 基因的表达异常,免疫相关基因的表达下调,多个转录因子的普遍上 调和部分单胺类神经递质相关基因表达上调等 特征. 关键词:基因芯片;注意缺陷多动障碍;SHR/WKY;前额叶皮层 GeneexpressionprofilesintheprefrontalcortexofSHRusingmicroarrayanalysis.CHIXia一,GUOXi—rong一.HONG Qin,FEILi,GUOMei,PANXiaoqin,CHENRonghua.(1ChildrenHealthCareCenter,NanjingMaternaland ChildrenHealthHospital,Nanying,Jiangsu210004,China;2InstituteofPediatrics,NanyingMedicalUniversity, Nanjing,Jiangsu210029,China) Abstract:【Objective】 Toinvestigatethedifferenceingeneexpressionprofilesbetweentheprefrontalcortexof spontaneouslyhypertensiverats(SHR)andWistarKyotorats(WKY)byusin gmicroarrayanalysis,andtoanalyzethe featureofgeneexpressionprofilesintheprefrontalcortex(PFC)ofSHR.【Methods】ThetotalRNAwasextracted fromtheprefrontalcortexofSHRratsandWKYandgeneexpressionwasanalyzedusingAffymetrixoligonucleotidemi— croarraytechnology(RAE230A).Thefunctionsofthedifferentiallyexpressedgeneswereanalyzedbybioinformatics. 【Results】 209,60,23probesetsgeneswerefoundsignificantlydifferentiallyexpressedover2,4,8foldsrespectivelybe— tweentheprefrontalcortexofSHRandWKY.Amongthe67unigeneswithknownfunctioninthedifferentiallyexpressed genes.differentclustersofgenesassociatedwithneurodevelopment,metabolism,signaltransduction,DNAtranscription, immune,etcwereconcerned.【Conclusion】 Dysregulationofsynaptictransmission,impairedtheformationofthemylin ofaxons,upregulationofDNAtranscriptionrelatedgenes,decreasedimmunityrelatedgenesetcarethefeaturesofgene expressionprofilesoftheprefrontalcortexofSHR. Keywords:cDNAmicroarray;attention-deficithyperactivitydisorder;SHR/WKY;prefrontalcortex 注意缺陷多动障碍(attentiondeficithyperactivitydisor der,ADHD)是儿童常见行为问题,病因及发病机制复杂. 本研究以ADHD动物模型SHR(spontaneouslyhypertensive rats)/WKY(Wistar-Kyotorats)大鼠为研究对象,一,取其 前额叶皮层组织,应用Affymetrix公司RAE230A(RatEx— pressionSet230)芯片,检测基因表达情况,并对差异表达基 因进行生物信息学分析,试图从基因网络角度全面理解 基金项目:江苏省自然科学基金资助项目(BK2006009) 作者简介:池霞(1973),女,江苏人,主治医师,讲师,博士学位,主要 研究方向为儿童保健及小儿神经心理. ADHD分子机制及差异表达基因与ADHD生物学特征之 间的关系. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1试验动物及主要试剂雄性5周龄清洁级SHR大 鼠,WKY大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司提供). TRIzolReagent(InvitrogenLifeTechnologies,美国),Su perScriptII(InvitrogenLifeTechnologies,美国),RT-PCR 试剂盒(Promega,美国). 1.1.2寡核苷酸芯片美国Affymetrix公司制备的寡核 苷酸RAE230A(RatExpressionSet230)芯片,含15866个 中国儿童保健杂志2007年O8月第15卷第4期 CJCHCAug.2007.Vol15,NO.4389 探针组. 1.2方法 1.2.1RNA提取和表达探针的制备sHR大鼠,WKY大 鼠各4只,每只大鼠分别取右侧前额叶皮层30mg,迅速置 RNAlater中一2O?冻存.组织匀浆后,采用TRIZOI一步法 提取总RNA,用RneasyMiniKit纯化,1甲醛变性琼脂糖 凝胶电泳进行RNA鉴定,紫外分光光度计分析RNA样品 纯度和浓度.按SuperScript?试剂盒操作反转录cD NA,并以Affymetrix公司RNATranscripLabelingKit合成 生物素标记的cRNA. 1.2.2基因芯片的杂交,洗脱,染色和扫描预先采用 Test3Array进行预实验以确定cRNA探针质量.合成后的 cRNA探针经片断化后加入基因芯片内,置入杂交炉640,在 基因芯片工作站400中洗脱,染色. 1.2.3基因芯片检测数据的处理GeneArrayScanner扫 描杂交后的芯片所得数据由”基因芯片检测工作站”应用 “ affymetrixmicroarraysuitesoftware5. 0”分析软件自动进 行计算和处理.样品基因检测结果,包括经过化处理的 “报告信号值”,各基因或EST在样品中表达结果的判定(P, M,A)以及多动组与正常组比较差异表达倍数,以数据形式 报告. 1.2.4部分差异表达基因表达水平的验证采用RT—PCR 技术检测部分差异基因的表达水平,对芯片结果准确性进行 验证. 2结果 2.1各组RealChipArray结果在WKY芯片的扫描图 中,可见--/J,处信号缺损,经过检测分析,在检测到的基因或 序列表达标签(ExpressedSequenceTag,EST)的探针对均 大于9对,达到有效的检测对,因此对芯片结果无明显影响. 2.2正常组与多动组表达的比较散点图纵坐标为多动组 的基因或EST表达信号值,横坐标为对照组的基因或EST 表达信号值,各点代表基因或EST在多动组和正常组中的 表达.斜线自上而下分别代表多动组与正常组3O,1O,4,2, 一 2,一4,一1O,一3O倍的表达差异.结果显示:多动组与正常组基 因表达谱比较,差异表达多为2,4倍,少数达1O,3O倍以 上.见图1. 图1SHR与WKY组基因表达的比较散点图 2.3差异表达基因的数据分析多动症与对照组大鼠前额表1受验证基因在前额叶联合皮层中的表达水平(?s) 叶脑组织中差异表达2倍以上的探针组数209个.除去在 SHR和WKY组表达水平均为A(不表达)的探针,余下有 16O个探针组,上调探针数为59个,下调为101个.其中 EST片段66个,功能未知蛋白或假设蛋白21个,余下的探 针组经分析代表已知功能的独立基因67个.按照基因功能 分类标准,对已知功能的独立基因进行分类,结果发现差异 表达基因以神经发育相关,转录调节,免疫相关,代谢相关, 信号转导相关基因为主,同时还涉及突触可塑性,髓鞘形成, 学习记忆,高血压,细胞凋亡等不同层次,不同功能的基 因群. 2.4RT—PCR验证所选验证基因的表达趋势基本符合在 基因表达谱中的变化规律,提示本研究中基因表达谱的实验 结果具有较好的可信度和可靠性.见表1. 3讨论 ADHD病因及发病机制涉及神经发育,生化代谢及功能 异常,遗传学,免疫学和环境因素等多种理论和学说.本研 究以ADHD动物模型sHR/wKY大鼠为研究对象,应用寡 核苷酸RAE230A芯片,寻找两者之间的差异表达基因,分 析SHR大鼠前额叶皮层基因表达谱的特征,试图从全局微 观水平探讨ADHD的病因与发病机制.根据实验结果,可 以认为SHR大鼠前额叶皮层的基因表达谱存在以下几个 特征. 3.1神经发育相关基因的表达异常本研究发现芯片中 有多个差异表达基因与神经系统发育相关,涉及突触传递 神经元生长,髓鞘形成等数个方面.?SV2B基因及Ho— merl,Homer2基因在SHR大鼠前额叶皮层中的表达显着 下调.SV2B基因是编码位于突触囊泡膜表面的糖蛋白,与 390中国儿童保健杂志2007年08月第15卷第4期CJCHCAug.2007.Vol15,NO.4 synaptotagmin形成复合体后,可直接调节synaptotagmin的 活性,从而影响突触前膜囊泡的融合Ea].Homer蛋白家族 与突触后膜内细胞骨架蛋白,信号蛋白之间的联系有关,调 节代谢性谷氨酸受体在突触后膜定位,并对谷氨酸功能产 生影响].在癫痫,高频刺激,发育过程中海马或皮层神经 元的兴奋性突触活动均可快速诱导HomerlamRNA的表 达,提示ADHD发病机制不仅涉及突触前膜传递异常,还 可能涉及突触后过程的异常;?MOBP基因在SHR大鼠前 额叶皮层显着下调,其广泛存在于少突胶质细胞中,与神经 髓鞘发育相关的_5]基因,编码的蛋白与髓磷脂碱性蛋白,脂 质蛋白共同参与中枢神经系统的髓鞘形成.结合近年研究 发现ADHD儿童的前额叶,胼胝体体积减小,前额叶皮层 的白质体积也明显低于正常对照组_6],白质存在不同水平 的下降],完整性受到损害_8],而白质主要由有髓神经纤维 组成,提示髓鞘形成障碍影响了髓鞘结构和功能的完整性 在ADHD病理机制中起重要作用;?STAT3,Camk4, Lgals3,Opem,Nr4a3,Bhlhb2等基因是本研究中发现的与神 经轴突,树突生长调节及突触形成相关的差异表达基因. 其中Stat3,Camk4,Lgals3基因在SHR大鼠前额叶皮层表 达水平显着下调,而Opcm,Bhlhb2,Nr4a3基因表达水平却 显着上调,6个差异表达基因表达变化趋势并不一致,但提 示有必要进一步从神经轴突或树突生长调节异常,突触形 成异常等角度深入探讨ADHD的病理生理机制. 3.2转录因子的差异表达差异表达于SHR/WKY大鼠 前额叶皮层中转录因子基因中即刻早期基因占其大多数. 现已知,即刻早期基因是转录因子的特殊类型,又称第三信 使,在外界刺激信息传人的数分钟内可迅速表达,编码特异 的DNA结合蛋白,通过影响靶基因的转录,发挥其转录调 节功能].目前,IEGs基因的表达水平已被认为是一种反 映神经细胞功能状态的指标,广泛应用于神经科学研究中. 本研究中多个即刻早期基因在SHR大鼠前额叶皮层中普遍 表达上调,提示ADHD大鼠前额叶皮层的神经功能可能处 于非常活跃的状态. 3.3免疫相关基因的表达异常有学者提出ADHD与感 染及变态反应相关的假说_l”],亦HLA基因的改变与 ADHD相关的报道.本研究发现参与编码大鼠主要组织 相容性抗原I类分子RT1一Aw2,RT1一Bb,RT1一Da,RT1.A (n)基因差异表达于SHR/WKY大鼠前额叶皮层中.同时 与IgE相关的Fcerla,Ms4a2,Lgals3基因及其他一些与免疫 相关的基因在SHR大鼠前额叶皮层中表达显着下调,总体 上呈现了免疫相关基因在SHR大鼠前额叶皮层下调的趋 势.虽然德义尚不清楚,但提示ADHD的发生发展可能与 免疫学变化有关,为ADHD与免疫之间的联系提供了进一 步的支持依据. 3.4单胺类神经递质相关基因本砑究中,发现与单胺类 神经递质密切相关的肾上腺素受体基因(Adrald),Nr4al基 因,Arc基因在SHR大鼠前额叶皮层中表达上调,其差异达 4倍以上,由于Nr4”al基’因,Arc基因分别能反映DA,5-HT 的神经功能状态,因此间接支持DA,5-HT能神经元活性增 强与ADHD之间的关系,提示有关单胺类神经递质与 ADHD之间的关系仍值得进一步的探讨. 综上所述,SHR大鼠前额叶皮层组织的基因表达 谱存在神经发育相关基因的表达异常,免疫相关基因的表达 下调,多个转录因子的普遍上调和部分单胺类神经递质相关 基因表达上调等特征,为进一步研究ADHD的发病机制提 供了新的线索. 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