【doc】低密度脂蛋白对高糖状态下血管内皮细胞脂质过氧化物和细胞间黏附分子-1的影响

【doc】低密度脂蛋白对高糖状态下血管内皮细胞脂质过氧化物和细胞间黏附分子-1的影响 低密度脂蛋白对高糖状态下血管内皮细胞脂质过氧化物和细胞间黏附分子-1的影响 lll0实用医学杂志2007年第23卷第8期 低密度脂蛋白对高糖状态下血管内皮细胞脂质 过氧化物和细胞间黏附分子一1的影响 周琳高方薛耀明 摘要目的:观察高糖状态下低密度脂蛋白(LDL)对体外培养的血管内皮细胞(ECV.304)脂质过氧化物 (LPO)代谢变化中丙二醛(MDA)和细胞问黏附分子一I(ICAM.1)分泌的影响.方法:不同浓度(5.5,20mmol,L)葡萄糖 (Glu)的培养液细胞中,分别加入不同浓度LDL(0,50,l00g/mL)进行氧化损伤48h,采用倒置显微镜观测细胞形 态学,MIrr法检测细胞活性,硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA的含量,细胞ELISA法测定ICAM.1的分泌.结果: (1)高糖状态下ECV一304细胞脂质过氧化的量明显增加(P<0.05或P<0.0者),加入LDL后,MDA含量显着增加. 脂质过氧化损伤显着加重,现出明显协同作用(P<0.05或P<0.01).(2)高糖状态下高浓度LDL抑制内皮细胞 的活力(P<0.05),且呈浓度依赖性;(3)高浓度Glu和LDL具有正协同作用.促进ICAM.1的分泌.结论:高浓度 Glu和LDL对血管内皮细胞具有协同损伤作用,高糖状态下LDL可直接导致内皮 l产生增多. 细胞损伤,引起ICAM— 促进糖尿病血管并发症的发生,发展. 关键词内皮细胞脂蛋白类葡萄糖胞间黏附分子l Theeffectsoflow-densitylipoproteinOHlipoperoxideandICAM-linvascularendothelialc ellsunderhiIgh glucoseconditionZHOULin.GA0Fang,XUEYao?ruing.DepartmemtofEndocrinology,N anfangHo~hd.Southern MedicalUniversity,Guangzhou510515,China 【Abstract】0bjectiveToexploretheeffectsoflow— densitylipoprotein(LDL)onMDAinlipoperoxide metabolismandthesecretionofICAM-linvascularendot}lelialcellsfECV.3041underhighglucosecondition.Methods ECV一 304cellswereculturedwithglucoseindifierentconcentrations(5.5and20mmol/L).andthenoxidatedfor48h withLDLinvariousconcentrations(0,50,andl00mL).MTrassaywasusedtodetecttheeellactivity,TBAto measuretheMDAcontent,andELISAtodeterminetheICAM— lsecretion.Results(1)Asignificantelevationin lipoperoxidationofthecellsoccurredunderhighglucosecondition(P<0.05orP<0.01)andtheMDAcontentand lipoperoxidationweremarkedlyincreasedafterthecellsweretreatedwithLDL,showingasynergeticactionofhigh glucoseandLDLlevel(P<0.05orP<0.O1).(2)HighLDLlevelinhibitedthecellactivityinaconcentration—dependent mannerunderhighglucosecondition(P<0.05).(3)GlucoseandLDLinhighconcentrationhadasynergeticeffecton stimulatingtheICAM-lsecretion.ConclusionsHighconcentrationsofglucoseandLDLplayasynergeticrolein damagetotheendothelialcells.LDLcandirectlyleadtotheendothelialeelliniuryandenhancetheICAM—lsecretion. whichacceleratesthedevelopmentofdiabeticvascularcomplications. IKeywords】EndothelialcellsLipoproteinsGlucoseIntercellularadhesionmolecule.1 糖尿病fDM1大血管并发症是DM患者的主要死 亡原因.其病理变化主要是动脉粥样硬化(AS),但DM 患者促发AS的机制尚未完全明了.研究发现DM患 者大血管并发症的产生与糖代谢和脂质代谢异常密 切相关…,高胰岛素可以增加细胞间黏附分子一1 (ICAM—1)表达,使内皮细胞分泌的血小板血管黏附分 子和中性粒细胞的内皮穿透移行明显增加.从而参与 AS病理过程[2】.DM患者除有高血糖及高胰岛素血症 等代谢紊乱外.常同时存在明显的,持续的脂代谢紊 乱,体内低密度脂蛋白(LDL)明显增加.本研究应用体 外培养的血管内皮细胞,探讨高糖状态下LDL对血管 内皮细胞脂质过氧化物代谢变化中丙二醛fMDA)和 ICAM一1分泌的影响,为预防及早期防治DM大血管 基金项目:广东省医学科学研究立项项目(编号:A2003458) 作者单位:510515广州市,南方医科大学南方医院内分泌代谢科 并发症提供理论依据. 1材料与方法 1.1主要试剂及仪器人脐静脉内皮细胞(ECV一304 细胞株)购自上海细胞生物研究所,LDL购自中国医 学科学院研究所,DMEM培养液购自Gibco公司;新生 胎牛血清购自HyClone公司,MDA试剂盒购自南京建 成生物有限公司,?因子相关抗原免疫组化测试盒购 自中山生物工程公司.ICAM一1试剂盒由晶美生物工 程有限公司提供;其余试剂为国产分析纯. 1.2内皮细胞的培养与鉴定复苏冻存的ECV一304 细胞株.用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液接 种于细胞培养板中,置于37oC,5%CO2,95%空气饱 和湿度培养箱中培养.细胞生长融合成致密单层.倾 去培养液.用0.25%胰蛋白酶与0.2%EDTA—Na等量 混合消化,l:2传代培养.实验采用生长融合成单层 的细胞,内皮细胞鉴定采用?因子相关抗原免疫组化 实用医学杂志2007年第23卷第8期 染色. 1.3实验方法和剂量分组取同批单层培养细胞.分 成3组,每组6孑L,吸去原培养液后,分别加入不同浓 度LDL(0,50,100j~g/mL)的培养液,置于37?,5% CO,95%空气饱和湿度培养箱中培养,同步留取培养 液,分装,储存.在各LDL剂量组损伤前分别加入含不 同浓度的葡萄糖(Glu)(5.5,20mmol/L)培养液,共培养 48h.终止培养,收集细胞,测定ECV一304内有关指标. 1.4指标检测采用倒置显微镜观测细胞生长形态 状况,M1Tr法检测细胞活性I,ICAM一1测定采用细胞 ELISA法,硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA的含量, 具体操作严格按照试剂盒进行. 1.5统计学处理实验数据以均数?差(?s)表 示,采用SPSS10.0统计软件包进行处理,交互作用的 判断采用析因设计的方差分析.以P<0.05为差异有 统计学意义. 2结果 2.1不同浓度LDL和Glu对ECV一304细胞株MDA 代谢的影响各组细胞培养上清液MDA含量见表1 高糖组(Glu20mmol/L)作用24h后细胞脂质过氧化 的量明显增加(P<0.05或P<0.O1),也随作用时问 的延长(48h)呈增加趋势,但两个时点的差异无统计 学意义(P>0.05).加入LDL后,MDA含量显着增加, 脂质过氧化损伤显着加重,表现出明显协同作用(P< 0.05或P<0.O1).. 表lECV一304细胞培养上清液MDA含量?s.nmol/mL 5.5mmol/LGlu+0I.LmLLDL组 20mmol/LGlu+0I.LmLLDL组 5.5mmo1/LGlu+50mLLDL组 5.5mmol/LGlu+100mLLDL组 20mmol/LGlu+50?g/mLLDL组 20mmol/LGlu+100Wc4mLLDL组 0.73?0.050.82?0.02 2.01?0.18'2.08?0.27' 3.08?0.27'3.15?0.29 4.57?0.41—4.70?0.65— 4.69?0.46'''4.85?0.55''' 5.33?0.24'''5.87?0.65'' 注:与Glu5.5mmol/L组比较,AP<0.05.?AP<0.O1:与LDL0 ~.g/mL组比较.}P<0.05.}}P<0.O1 2.2不同浓度LDL和Glu对ECV一304细胞株形态学 的影响对照组(Glu5.5mmol/L)细胞为多角形.呈 单层铺路石状,紧密贴壁,细胞边界清楚;高糖组(Glu 20mmol/L)作用24h后细胞形态仍大致正常.48h后 细胞内颗粒增多,核仁清楚.各损伤组细胞在24h后 变圆,略浮起的细胞增多,但未脱壁.高浓度LDL (100g,L)组在高糖状态下48h后较多细胞肿胀变 圆,细胞膜模糊,细胞空泡增多,核仁消失,并可见部 分细胞脱落变圆.悬浮在培养液中.形成小片脱失区. 2.3不同浓度LDL和Glu对ECV一304细胞株M1Tr 值的影响见表2ECV一304细胞以20mmol/LGlu加 不同浓度LDL的混合条件液培养48h后,M1Tr法测 得各损伤组OD值较对照组细胞活力明显下降fP< 0.O1). 表2不同浓度LDL和Glu对ECV一304细胞株 M下丁值的影响? 组别ECV.304细胞MT丁值 5.5mmo忱Glu+0咖LLDL组 5.5mmo忱Glu+50咖LLOL组 5.5rllmo儿Glu+lO0LLDL组 20mmo儿Glu+0咖LLDL组 20mmo儿Glu+50咖LLDL组 2Ommo儿Glu+1O0咖LlL组 283?23 239?37' 201?18' 261?17.? 206?12 183?32 注:与Glu5.5mmol/L+0mLLDL组比较,?P<0.05;与相同浓 度Glu+LDL0~.g/mL组t-Lg~.}P<0.O1 2.4不同浓度LDL和Glu对ECV一304细胞株ICAM—l含 量的影响见表3.高浓度Glu和LDL均能促进ECV一304 细胞生成ICAM.1(P<0.05或P<0.O1),且这种促进作 用随着LDL浓度的增高而增加,具有浓度依赖性:高浓 度Glu和LDL促进ICAM一1的分泌具有正协同作用随着 作用时间的延长,/CAM一1的分泌也呈增强的趋势.但 两个时点的差异无统计学(P>0.05) 表3不同浓度LDL和Glu对ECV一304细胞株 ICAM一1含量的影响?s.ng/mL 组别24h48h 88.53581.73?75.11 5.5mmol/LGlu+OLLDL组528.63? 20mmol/LGlu+0mLLDL组624.87?73.22'650.73?65.42' 55mmol/LGlu+50咖LLDL组678.95?114.57695.12?96.87' 5,5mmol/LGlu+l00LLDL组729.77?10L4.86—753.42?110.23— 20mmol/LGlu+50LLDL组769.05?82.78一'768.65?121.23一' 20mmol/LGlu+l00/珈LLDL组943.53?143.06"一989.75?l24_88"一 注:与Glu5.5mmol/L组比较,?P<0.05,??P<0.O1:与LDL0 I~g/mL组比较.}P<0.05}}P<0.01 3讨论 DM大血管病变的发病机制至今尚未明了.目前 认为是多种危险因素f长期慢性高血糖,高胰岛素血 症,脂肪代谢紊乱等)作用于不同环节所导致的多因素 疾病,而这些因素之间可能存在复杂的交互作用促成 了DM状态下血管病变的发生,发展.研究表明,血管 内皮细胞的损伤被认为是形成DM及其血管并发症 的基础I41.OX—LDL是LDL经氧化修饰的产物,生理状 态的血浆中可能仅存在少量轻度氧化的LDL,而DM 患者LDL易被氧化修饰形成OX—LDL.本实验中采用 不同浓度LDL在高糖状态下对正常的内皮细胞进行 干预损伤.结果显示高糖能够促进细胞介导的LDL过 氧化,随浓度增加,作用时间延长,脂质过氧化损伤显 着加重.表现出明显协同作用,与Maziere等【5_研究所 得结果一致.高浓度LDL对血管内皮细胞的活力具有 抑制作用,且这种抑制作用随着LDL浓度增加而增 加,表明LDL对血管内皮细胞活力抑制呈浓度依赖 性,高浓度LDL在高糖状态下对血管内皮细胞活力抑 1112 制作用明显增强.提示在高糖状态下能加重LDL对血 管内皮的损伤. DM患者还存在着明显的血管内皮功能失调, Okouchi等l2_发现高胰岛素可以增加ICAM一1表达.同 时由高血糖导致的OX.LDL增多可使内皮细胞分泌更 多的ICAM一1,从而促进了白细胞与血管内皮细胞的 黏附,浸润等一系列炎症反应.参与AS的发生.本研 究显示.高浓度Glu和LDL具有正协同作用.显着促 进ICAM一1的分泌,且这种作用具有浓度依赖性.提 示DM患者显着加重的脂质过氧化,作为体内存在 的一个重要损伤因素,通过损伤血管内皮.引起血 管内皮细胞结构和功能的改变,促进DM患者大血 管并发症的发生,发展,且高糖状态下这种损伤作 用明显增强. 实用医学杂志2007年第23卷第8期 4参考文献 lljMakimattilaS.LiuML,VakkilainenJ,eta1.Impairedendothelium— dependentvasodilationintype2diabetes【JI.DiabetesCare,1999, 22(6):973—981. [2]OkouehiM,OkayamaN,lmaiS,eta1.Highinsulinenhances neutrophiltransendothelialmigrationthroughincreasingsurface expressionofplateletendothelialcelladhesionmolecule—lvia activationofmitogenactivatedproteinkinasefJJ.Oiabetologia,2002, 45fl0):1449一l456. [3]司徒镇强,吴军正.细胞培养【M】.北京:世界图书出版公司出版, 1996:l86一l87. 14JHsuehWA, QuinonesMJ.Roleofendothelialdysfunctionin insulinresistancefJj.AmJCardiol,2003,92(4A):IoJ—I7J. L5jMaziereC,AuclairM,RobertF.eta1.Glucoseenrichedmedium enhancescellcell—mediatedlowdensitylipoproteinperoxidation…. FEBSLett.1995,363(3):277—279. (收稿:2006一l2—07) 轻型胎盘早剥54例临床分析 胎盘早剥是妊娠中晚期严重的并发 症,发病率为0.51%,2.33%r'1,起病急,进 展快.轻型胎盘早剥如不能早期诊断和 及时处理,可迅速发展为重型,危及母婴 的生命安全,而轻型胎盘早剥极易漏诊 和误诊.我院从1998年1月至2006年9 月共收治54例轻型胎盘早剥的患者,对 其进行回顾性分析.旨在探讨轻型胎盘早 剥的早期诊断,以期及时治疗. 1临床资料 1.1一般资料患者年龄22—38岁,平 均26岁.初产妇31例,占57%,孕20,40 周,平均孕34.2周,经阴道分娩16例,剖 宫产38例胎盘早剥面积均小于1/3,产 前确诊39例,人院时妇高征者18例,外 伤史3例,骑摩托车者8例,性生活9 例.早破水12例(5例有妇高征),其他因 素9例,如羊水多,脐带缠绕,双胎等. 1.2诊断方法产后常规检查胎盘,胎 盘有血块压迹,且面积小于1/3,产前确 诊39例.其中B超诊断阳性者31例,23 例B超未诊断,15例为后壁胎盘,5例为 侧壁胎盘,3例前壁胎盘未诊断者,检查 胎盘后血肿小,剥离面小于1/5. 1.3临床表现以无痛性阴道出血为主 要症状者25例,出血伴腰背酸胀15例, 胎动消失3例,血性羊水8例,无症状者 作者单位:43l700湖北省天门市第一人 民医院 张申华 3例.以子宫高张状态为主要体征的有28 例(其中3例为胎动消失,8例胎心遥 远).下腹软,轻微压痛者11例,15例无 明显阳性体征. 1.4辅助检查B超诊断阳性31例,查 血红蛋白和血小板计数,2h内进行性下 降的有8例. 1.5结果31例经B超确诊和另外2 例阴道出血较多.2例血性羊水.3例腹 痛明显者人院即行剖宫产术,16例经阴 道产.产后检查胎盘均证实为轻型胎盘早 剥.38例剖宫产患者中,子宫胎盘卒中的 有2例.经积极治疗,预后较好,死胎3 例.死产6例,其中4例孕周小于28周, 1例孕31周,1例孕35周,新生儿窒息 12例,苍白窒息5例,经抢救后,2例死 亡.其余新生儿均正常. 2讨论 胎盘早剥发病机制尚不完全清楚,有 人认为母体高血压,外伤,突然子宫减 压,脐带过短,子宫异常和肿瘤或者增大 的子宫压迫下腔静脉,子宫静脉瘀血有 关.但妊高征是主要的发病原因,因而孕 妇仰卧过久,半卧位,孕晚期性生活,外 伤,胎膜早破,脐带过短均可为胎盘早剥 的诱因.分析本组资料,发现有以下几 个特点:(1)轻型胎盘早剥的主要诱因仍 是妊高征,这是由于妊高征患者微小动脉 痉挛.易造成底蜕膜出血,形成胎盘后血 肿.致胎盘早剥.(2)胎膜早破后,羊水流 出.致宫腔压力骤减,胎盘与子宫分离. (3)轻型胎盘早剥早期症状不典型.易漏 诊和误诊,其主要原因为后壁胎盘,侧壁 胎盘,B超阳性率低.且轻型胎盘早剥易 与先兆早产,足月临产,前置胎盘等混 淆.因此对于疑有胎盘早剥者应注意以 下几点:(1)要仔细询问病史,如外伤,性 生活:(2)注意有无发病诱因,如妊高征, 羊水过多,巨大胎儿,多胎,脐带缠绕,子 宫畸形或肿瘤;(3)重视难以解释又不能 缓解的腰酸背痛,或者子宫局部压痛; (4)胎心变化以及血性羊水;(5)重视不 明原因的早产和死胎;(6)原因不明的阴 道出血和流水;(7)B超检查发现胎盘增 厚,胎盘与宫壁间有液性暗区,后壁胎 盘,侧壁胎盘,胎盘血管瘤等,应考虑到B 超的局限性和时机性,技术因素,仪器因 素,排除假阴性.结合临床,如仍不能确 诊胎盘早剥者,应追踪复查或行彩超检查 胎盘血流,有利于诊断. 加强围产保健宣传工作,做好围产检 查,早期发现和治疗孕高症,可有效降低 胎盘早剥的发生率,减少围生儿死亡. 3参考文献 [1]丰有吉,李荷莲.妇产科学fM】.北京:人 民卫生出版社.2002:79. [2]刘侠君,杨凤英,董薇,等.胎盘早剥5O 例临床分析….实用医学杂志,21(6): 634—635. [3]李大慈.现代产科治疗学fM1.广州:广 东科技出版社,1997:33. c收稿:2006一l2—18修回:2007-02—07)