溶血反应实验报告

溶血反应实验报告 篇一:溶血实验 溶血性实验 实验目的:通过本实验认识溶血现象～并掌握溶血性实验常规的体外试管法的基本操作 实验原理:溶血是指红细胞破裂、溶解的一种现象。药物制剂引起的溶血反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血～为II型和III型变态反应,非免疫性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起的血液稳定性改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。溶血实验室观察受试物是否会引起溶血和红细胞聚集等反应。 有些药物由于含有溶血性成分或物理、化学、生物等方面的原因～在直接注射入血管后可产生溶血现象,有些药物注入血管后可产生血细胞凝聚～引起血液循环功能的障碍等。有些中草药含有皂苷等成分～具有溶血作用。凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血的药物制剂～均应进行溶血性实验。 实验 1. 2%红细胞悬液的制备 取新鲜鼠血10 ~ 20ml～放入盛有玻璃珠的三角烧瓶 中振摇10分钟～或用玻璃棒搅动血液～除去纤维蛋白质～ 使成脱纤血液。加入生理盐水100ml～摇匀～1000~1500r/min 离心15分钟～除去上清液～沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2~3次～至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2%的混悬液(红细胞2ml～加生理盐水至100ml)～供试验用。 2. 取10ml干净玻璃试管7支～编号～1至5号管为供试品～6号管为阴性对照 管～7号管为阳性对照管(完全溶血对照)。按表1所示～依次加入2%红细胞悬液。0。9%氯化钠溶液或蒸馏水～混匀后～立即臵(37?0。5)?的恒温水浴中进行温育～观察并记录各管的溶血情况。开始每隔15分钟观察1次～1小时后～每隔1小时观察1次～一般观察3小时。 表1 溶血实验设计表 表2 溶血试验结果判断标准 全溶血 溶液澄明～红色～管底无红细胞残留 部分溶血溶液澄明～ ～红色或棕色～底部有少量红细胞残留;镜检红细胞稀少或变形 不溶血红细胞全部下沉～上清液体无色澄明;镜检红细胞不凝聚 红细胞凝聚 溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀～振摇后不分散 当阴性对照管无溶血和凝聚发生～阳性对照管有溶血发生时～若受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚～则受试物可以注射使用～若受试物中的溶液在3小时内发生 溶血或聚集～则受试物不能注射使用。 注:—表示无溶血～+表示部分溶血～++表示全溶血 注意事项: (转 载 于:wWw.zAIdian.cOM 在 点 网) 溶血反应发生机制复杂～目前尚无标准的临床前体内实验方法全面评价药物制剂的溶血反应～因此在长期毒性研究中应该兼顾考虑制剂的溶血性～注意观察溶血反应的有关指标和体征,如网织红细胞、红细胞数、胆红素、尿蛋白、肾炎、脾脏淤血等,～如出现溶血是～应进一步研究。 篇二:溶血实验 溶血实验 1.浓度 2.溶液配制 D-PBS:Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 3.方法 ?新鲜血液2ml至用抗凝剂肝素预处理的采血管中。 ?加入4ml D-PBS～10000g离心5min。 ?弃上清～补加D-PBS至10ml～混匀后10000g离心5min。 ?重复?4次～至上清澄清透明。 ?加入20ml D-PBS重悬红细胞。 ?将0.2ml红细胞悬液与0.8ml材料工作液混合。以加0.8ml水作为阳性对照组～0.8ml D-PBS为阴性对照组。 ?各组设4个平行～4h后～10016g离心5min～各取样品 100ul至96孔板测定577nm吸光度～以655nm吸光度为参考。 溶血率% =[(OD样品-OD阴性)/(OD阳性–OD阴性)]×100% 取健康非吸烟男性志愿者静脉血3 ml。取2 ml血液～加入4 ml PBS～ 涡旋混匀。4 ?～10020 g离心10 min。小心移除上清～补加PBS至10 ml～混匀后离心～PBS重复处理5次至上清澄清透明。最后将红细胞用PBS定容至20 ml重悬混匀。用PBS配制三种HAP纳米粒子的梯度工作液:100 μg/ml～50 μg/ml～25 μg/ml～12.5 μg/ml～6.25 μg/ml。用0.2 ml上述红细胞重悬液与0.8 ml纳米粒子工作液混合～得到纳米粒子的终浓度为80 μg/ml～40 μg/ml～20 μg/ml～10 μg/ml～5 μg/ml。0.2 ml红细胞悬液与0.8 ml PBS混匀为阴性对照～0.2 ml红细胞悬液与0.8 ml无菌三次水混匀为阳性对照～各组设3个平行。涡旋混匀后～于37 ?孵育3 h～10020 g离心10 min～各样取100 μl上清～于570 nm处测吸光度值。溶血率计算方法如下:溶血率% = [(OD样品-OD阴性)/ (OD阳性 – OD阴性)] × 100%。 篇三:新生儿溶血病检测的设计性实验 新生儿溶血病检测的设计性实验 一(发病机制: 1.胎儿期妊娠后期胎盘出血～胎儿红细胞进入母体循环 系统。 2.胎儿红细胞被母体免疫系统识别。 3.刺激母体产生抗体。 4.抗体通过胎盘引起新生儿溶血病 Rh新生儿溶血病: 1.2. 3. 二 实验原理 由于母婴Rh血型不合～母体产生相应的IgG类Rh抗体～经过胎盘进入胎儿体内～与胎儿红细胞发生特异性的抗原抗体反应～从而破坏胎儿红细胞并引起一系列的临床症状。运用直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验可检测出婴儿体内是否有来自母体的与婴儿相对应的IgG类Rh抗体。 三 标本、试剂与器材 1 标本 ,1, 待检标本 取婴儿抗凝血3~5ml～分离出血清和红细胞。用生理盐水洗 涤红细胞～混匀～以1000×g离心1min～去除上清液～再加入生理盐 水～充分混匀～离心洗涤～如此反复洗涤4次。第四次洗涤后尽量去除上清液～取试管底部的婴儿压积红细胞2滴用生理盐水配成2%~5%婴儿红细胞悬液～余下的婴儿压积红细胞备用, ,2, 阳性对照 IgG抗D抗体致敏的2%~5%RhD阳性红细胞悬液; ,3, 阴性对照 正常人2%~5%红细胞悬液; 2 试剂 多特异性抗球蛋白试剂、但特异性抗IgD试剂、单特异性抗C3d试剂、0.5%菠萝酶或1%木瓜酶、谱红细胞、5%,A、B,指示红细胞、生理盐水、化学纯乙醚、0.2mol/L巯基乙醇货0.01mol/L二硫苏糖醇, 3 器材 试管、滴管、37水浴箱、56水浴振荡箱、台式离心机、显微镜等 。 ,一, 婴儿红细胞直接抗球蛋白试验 1) 实验目的 检测新生儿红细胞上是否存在不完全抗体。 2) 实验原理不完全抗体多与其相应的红细胞结合～在盐水介质中不出 现凝集反应。Coomb试验利用抗球蛋白抗体作为第二抗体～通过连 接致敏红细胞表面的特异性Rh抗体～使致敏红细胞出现特异性凝 集。 3) 操作步骤 1 取三只试管～表明待测标本管、阳性对照管、阴性对照管, 2 待测标本管加入1滴2%~5%婴儿红细胞悬液～阳性对照管加入 IgG抗 D抗体致敏的2%~5%RhD阳性红细胞悬液～阴性对照管加入1滴 正常人 2%~5%红细胞悬液, 3 各管加入抗球蛋白试剂2滴～混匀～1000r/min离心1min, 4 判断结果斜持试管轻轻摇动或轻轻弹动～肉眼观察红细胞凝集情况。若有可疑的～可讲混悬液倒在玻片上～在显微镜下观查结果。如阳性对照管出现凝集～阴性对照管不出现凝集～说明被检测管的结果可信,若被检测管出现凝集～为RhD阳性～反之为RhD阴性。 5 报告方式 直接抗球蛋白试验阳性或阴性。 ,二, 婴儿血清中游离抗体检查 1, 实验目的 检测新生儿血清中是否存在不完全抗体。 2, 实验原理不完全抗体多与其相应的红细胞结合～在盐水介质中 不出现凝集反应。Coomb试验利用抗球蛋白抗体作为第二 抗 体～通过连接致敏红细胞表面的特异性Rh抗体～使致敏红细 胞出现特异性凝集。 3, 检测方法 有酶介质法、聚凝胺试验、间接抗球蛋白试验、人源 盐 水 介质抗D试验、低离子强度溶液实验 等。 4, 间接抗球蛋白试验操作步骤 : 1 谱红细胞1滴加入试管中～再加入婴儿的血清2滴 ～ 混 匀, 2 温育 37?温育30~60min, 3 离心 以1000r/min离心1min, 4 观察观察 是否有溶血和凝集～并记录结果, 5 洗涤红细胞用生理盐水洗涤3~4次。最后一次洗涤后～ 倒掉全部的盐水～加抗球蛋白试剂2滴～充分混匀, 6 离心 以1000r/min离心1min, 7 观察 轻轻悬浮细胞～观察有否溶血和凝集～溶血和凝集 为阳性～否则为阴性, ,三, 1, 2, 3, ,四, 1, 8 复核 阴性者应加IgG抗D抗体致敏的2%~5%RhD阳性红细胞悬液～离心并观察结果:凝集表示阴性结果可靠,不凝集表示试验无效～必须重做。 9 报告方式间接抗球蛋白试验阳性或阴性。 婴儿红细胞抗体释放试验 实验目的 检测新生儿红细胞上的致敏的血型抗体。 实验原理利用特殊的方法将致敏在新生儿红细胞上的抗体放散下来～然后再检测放散液中的抗体。只有当放散液中检出抗体～同时新生儿红细胞上又存在相应抗原是才认为释放实验是阳性。 操作步骤 1 取洗涤后婴儿压积红细胞1~2ml于试管中～加等量生理盐水和双份乙醚～用玻璃纸封口～颠倒混匀10min, 2 待红细胞全部破坏后～打开封口～以2000g离心5min～离心后分三层～取下层红色层液体,放散液,转移到另一试管中, 3 37?温育30min, 4 取两只试管～标记为待测标本管～阴性对照管～各加入放散液～待测标本管加入待检标本红细胞1滴～阴性对照管加入谱红细胞, 5 混匀～放于37?温育1h, 6 洗涤红细胞 取出～用生理盐水洗涤3~4次。最后一次洗涤后～倒掉 全部的盐水～加抗球蛋白试剂2滴～充分混匀～以1000r/min离心1min。 7 观察结果 8 报告方 式红细胞抗体释放试验阳性或阴性。 母亲血清中IgG抗体效价检查 实验目的 检测血清中IgG抗体效价。 2, 试验原理血清经连续倍比稀释后与选定的红细胞进行反应～通 常以肉眼可见的1+凝集程度的最高稀释度倒数来表示效价。这个半定量的方法能够提供血清中抗体或红细胞上抗原量的情况。 3, 操作步骤 1 去除血清中IgM抗体, 2 取试管10支～各管加生理盐水10ul～第一管加经0.01mol/L DTT处理后的血清100ul～然后进行倍比稀释～通常稀释到 第十管, 3 各管加2%~5%相应的红细胞悬液50ul～放于37?温育 60min, 4 取出观察有无凝集～不凝集管用生理盐水洗涤3~4次。最后 一次洗涤后～倒掉 全部的盐水～加抗球蛋白试剂2滴～充分 混匀～以1000r/min离心1min。 5 结果判断在盐水中不凝集～加入抗球蛋白试剂后出现 凝 集～表明有IgG抗体存在,通常以肉眼可见的1+凝集程度的 最高稀释度倒数来表示效价。 ,五, 婴儿血中红细胞计数 新生儿溶血一般伴有外周红细胞减少。 ,六, 网织红细胞和有核红细胞计数 新生儿溶血一般伴有网织红细胞和有核红细胞计数。 四 诊断 诊断:溶血性贫血伴有核黄疸 诊断依据: 一般情况:产后5天胎患儿～皮肤发黄～嗜睡抽搐。 实验室检查:Hb:70g/L,血清游离胆红素359.8umol/L～母亲B型RhD阴性～婴儿B型RhD阳性～父亲B型RhD阳性～红细胞直接抗球蛋白试验阳