细胞色素P450

细胞色素P450 细胞色素P4502C19在中国汉族人群不同组织中的分布差异研究 吴敏良,吴晓虹,陈枢青(1.浙江大学医学院附属第二医院,浙江杭州310009;2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院,浙江杭州 310016;3.浙江大学药学院生物制药研究室,浙江杭州310031) 摘要:目的调查中国汉族人群中不同组织中CYP'2C19mRNA表达情况.方法运用半定量RT-PCR方法检测了包括肝脏在 内的l1种组织中CYP'2C19mRNA的表达情况,并运用WestemBlotting技术检测了CYP'2C19mRNA表达产物即蛋白质的表达. 结果l1种组织除肝脏以外均未有CYP'2C19mRNA的表达,对有CYP'2C19mRNA表达的肝细胞组织及不同的细胞株进行的 WestemBlotting结果显示.只在肝细胞组织和肝癌细胞株上清液中有CYP'2C19酶蛋白的表达.结论通过对不同组织中 CYP2C19mRNA分布情况的调查,可以了解组织对外来化合物经CYP2C19酶蛋白的代谢情况,为I床用药提供直接的实验资 料. 关键词:CYP'2C19mRNA;Rrr_PCR;蛋白质;组织 中图分类号:R969文献标识码:A文章编号:1001—2494(2005)03—0215—04 studyont~lledistributiondi~erenceofcytochromeP4502C19inChinesepopulationHan WUMin—liang,WUXiao—hong2, CHENShu—qing3(1. DepartmentofClinical[ztborato,2ridAffaio~edHospital,&zof Medicine,慨University,Ha,~u310009,China;2.De~rttofRespiratoryMedicine,SirRunRunShawHosp ital,Schoolof Medicine,University,HangZhou310016,China;3.DepartmentofBiopharmaceutics,Colle geofPharmacerticalSciences,ZhejiangU- niversity,u310031,Ch/un) ABSnCT:OBJEL3"IVETodetectCYP'2C19mRNAandCYP'2C19enzymeproteinexpressionin11normaltissues,includinglivertis. sue,inChinesepopulationHan.METHODSC'dr2C19mRNAexpressionlevelwasdetected in11normaltissues,includingliver?colon, stomach,breast,esophagus,lung,uterus.brain,pancreas,ovary,kidney.Severalhepaticcarci nomacelllines,colorectalcancercelllines anduteruscancercelllineweredeterminedbysemi.quantitativeRT-PCR.CTP'2C19enzym eproteinwasdetectedbyqualitativewesternblotting technology.RESULTSTheresultsshowedthatCYP'2C19mRNAonlyexpressedinlivertiss ueandhepaticcarcinomacelllines,CYP'2C19 方剂的药动学研究提供很好的参照.但由于中药成 分复杂,临床治疗又以复方为主,所产生的药理作用 是各种成分的共同作用,不能简单地用单一成分解 释,而各种成分之间的相互影响,也必然会反映到药 动学特征上.本实验虽未观察到复方制剂脂肝宁胶 囊中其他中药对龙胆苦苷药动学的直接影响,但龙 胆药材本身所含的其他成分使龙胆苦苷的吸收增 大,消除速率减慢,生物利用度提高,说明中药材中 或复方中的其他成分对其"标识成分"或"药效成分" 的体内过程有较大的影响,单用中药或复方中某一 纯组分(品)进行药动学研究,不能代表单味药 材本身及其在复方中的药代特征,研究中药的药动 学,应该以药材本身或复方为研究对象,并考虑到其 在复方中的作用及配伍关系,如君药,臣药,才能得 到较为准确的数据. 致谢:本研究承蒙河北医科大学第四附属医院姚树坤教授的 指导,在此深表谢意. 参考文献 [1]郑虎占,董泽宏.中药现代研究与应用(第二卷)[M].北京: 学苑出版社,1997:1398—1408. 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KEYWORDS:CSt3~2C19mRNA;RT-PCR;protein;tissue 细胞色素P4502C19(CytochromeP4502C19. CYP2CI9)是人体内进行药物代谢的主要代谢酶,其 参与代谢的药物包括美芬妥因,奥美拉唑,地西泮, 氯胍,普萘洛尔和一些抗抑郁药等.根据其基因型 改变而引起酶代谢活性的改变,可以将人群根据对 S一美芬妥因的4羟化能力很清楚地分为二大类:强 代谢(extensivemetaboliser,EMs)和弱代谢(poor metabolisers,PMs).在正常人群中,其基因型就预示 着相应的表型.到目前为止已经有l5种导致PM 表型的变异等位基因(CY3Y2CI9*2到CYP2CI9* l5)得到证实….影响CYF2CI9酶活性的因素除了 基因多态性以外,还有饮食因素,环境因素,药物间 的相互作用以及疾病状况等.同时EM和PM基因 型与表型的分布存在很大的民族差异性,东方人群 的PMs发生率明显高于其他民族_2j. 中国人群的CYP2CI9PMs表型与其基因多态 性的研究已经有很多学者进行了研究,也已经阐明 PMs的发生率明显高于西方人群.由于中国人群的 饮食结构与西方人群相比存在着很大的差异,同时 又受到地理环境等因素的影响,有可能使CYP2CI9 mRNA在不同组织的分布情况与西方人群有所不 同.为了调查中国汉族人群不同组织中CYP2CI9 mRNA表达情况,我们采用外科手术中新鲜的病理 标本,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测 了包括肝脏在内的11种组织中CYP2CI9mRNA的 表达情况,并运用蛋白免疫印迹(westernblotting)技 术检测了CYP2CI9mRNA表达产物即蛋白质的表 达,探讨中国汉族人群中CYP2CI9mRNA在不同组 织的分布规律. 1 1.1实验对象 正常的组织标本均取自浙江大学医学院附属第 二医院普通外科手术患者,且均经术后病理证 实.其中肝l4例,胃lO例,大肠11例,乳腺8例, 宫颈8例,卵巢4例,肺l5例,食道6例,胰腺5例, 脑2例,肾2例.下列细胞系(株):正常永生化肝 细胞系LO2,7721肝癌细胞系;HEPG2,HEPGA肝癌 细胞株;Lovo大肠癌细胞株;HeLa宫颈癌细胞株(浙 江大学肿瘤研究所). ' 216'ChinaJ,2005February.Vo1.40No.3 1.2主要试剂 总RNA提取试剂盒,PCR引物,SUPERSCRIPT II,dN(A,T,C,G)rIP,Tag酶,OligodT~18),琼脂糖(上 海博亚生物工程公司),DI200ODNAMarker(大连宝 生物工程公司);CYP2CI9单抗及辣根酶标记羊抗 兔IgG(BDGentest);PVDF膜(Bio.Rad公司);其他试 剂均为Sigma产品. 1.3主要仪器 PE9600DNA热循环仪(PerkinElmer公司),紫 外分光光度计GeneQuant?(PharmaciaBiotech公 司);高速冷冻离心机HIMACCR22(Hitachi);ISOIO00 凝胶数字成像~(AlphaInotechCo.);水平,垂直电 泳仪和电转移仪(Bio—Rad公司). 2方法 2.1组织,细胞总RNA提取及鉴定 采用TRIZOL方法对正常组织及细胞株(系)的 总RNA进行提取后,用紫外可见分光光度计检测其 260nm/280nm比值,舍弃比值小于1.8的RNA样 本,并对RNA进行定量,RNA浓度(Pg'ttL)= A26o×8;用甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整 性. 2.2cDNA的合成 取RNA1ptg,加SUPERSCRIPTII1ttL,按常规 方法进行逆转录,所得cDNA置一20?保存,用于 PCR扩增. 2.3PCR扩增 CYP2CI9引物为上游5>Ar不GAATGAAAA CATCAGGATTG<3,下游5>GAGGGTTGTTGA TGTCCATC<3(理论扩增片段为182bp);内参照 ~-actin引物为上游5>TI'CCAGCCTTCCTI'CCTG GG<3,下游5>TI'GCGCTCAGGAGGAGCAAT <3(理论扩增片段为250bp).反应体系为10× PCR缓冲液5,25mmol?LMgCl23,10mmol? L,dNTPs,10tnnol?L,Primer,cDNA各1ttL,Taq酶 O.5,总体积加水补足到50.扩增条件为 CYP2Cl9:94?5min,94?20S,55oC10S.72oC10 s,38个循环,循环结束后72?延伸5min.8.actin: 94?2min,94?20s,58oC20S,72?20S,23个循 环,循环结束后72~C延伸5min. 国药学杂志2005年2月第40卷第j 24P(扩增砖植 取20止PCII:物经l5钟琼脂糖电泳.浪化乙 锭染色,[fill300软f4:L~If$半定量分析 25WesterllBI【JIting日】定CYP2CI9蛋白质表达 先按如J,方法提取蛋白质:消化.离心收集细 胞,PBS洗涤3次.加PBS30止重悬细胞,加细胞裂 解液3O『』L.超声做辟细胞,离心l14(K如i?IIlil-..×30 mii1,4).取上清.一20?保存备用按BDGen【1 公司推荐方法进行CYP'2C19蛋白的?m?Blotling 分析.分别经电泳,转膜,封闭杂交,显色等步骤后 显示分析结果 3结果 3.1下同正常蛆纪鬯lA蚌品鉴毛 采用Tfizo/提取组织和培养细胞总ILiA,纶紫 外可见分光光度仪检测其A2./』比值均大 于l馆,RNA甲醛性胶电泳28S,18S和5s条带清 晰呵见.且28S一18S约为2:l,表明抽提的RNA完 整.没有降解,见罔l 图1RNA罕霹琵睦嗖电本:站晏 Fig11旺不玎ddeilatLtrdllollgelsrtn~plxofHal I:elkdarRNA 3.2Rlr_PCR橙删结果 3.2lCYP2CI9住肝脏组织中的表达直Rlr- PCR方法检测了l4例肝脏组织中的CYP2CI9lnR— NA表达情况,部分P.T-I~R产物凝胺电泳扫描见 图2 图2部旁肝蛆虹C'.[r~c19mRNART—PCR凝艟电律结果 LI——I一号肝址标水,?一?竹子量标 F2TileIeleetml:lhoresisresultCYP2CI9mRNAexId in【iverlJssues LI—IS一u_1—8l…M—f)NAmark 3.2.2cYP2cl9l1A在肝外正常组织中的表达 应用Rlr_PCR方法检删了Il大晒l5删肺8删 子宫4例卵巢,2俐脑瘤,8例乳睬6劁食道】0削 茸5倒胰腺2侧肾组织c1I的c,I~C19tuRN~.表达 水平部分RT.:R产物凝胶电泳扫描见3 圉3坪净正霄坦ffl'.1,Cla/凝脏Fp:.戛泉豆t直上 j_E《C'lP2CI9mRNA均育最墨) I旨:I1一士J】自:til一1:KI—H:lII—JH蜒:IIi6.I}I{【LlItI— rlr,?IH^计晕际准 g3]gelelerqmphoredst+.,-uhof(,P2CI9tuRN4l_xpres~l in1?nlr~nnalIis~uesInre'stillsllo~,edthaiIbex-,l?1 I.,1~2C19i1lRNA,eXt)l-t~md]i 一b,h:tI_l?I:III一'n:KI—kil,i(Hu,.F:I…l:…11 …I-?i12I—lI?iM一1),^a~irk,I 3.3WeslefnBlolfing结果 weslenlblolling结果证实.月1=墒细胞系7721. HepGA,HepG2细胞培养I清液与肝澈粗体提取的 CYI)2c19标准有相同的蛋白条带,而太肠癌细胞系 LI)VO.宫颈墒细胞系]leixt.正常永[17化I1r细胞系 l』J2则没有CYP2C19蛋r]的丧达.进一步验证丁与 (:YJr2C19I11刚A表达的组织?致罔4 图4下同蛔拒参细胞培尊二清一(:,'82(;19WeslnIblolli 垃世最 I—自{,1ip1一lr倚水,日f细胞系Lt:J5—一壤细瞻722i.6一 鼬社^丰标准:一r缔蛔胞系A18一.qPJ~fH胞杀}M!:9一坩拘蛔刿 艴最H1日:lO—K膈溉雏胞最IJ1%,1) Fig4WI日e堋blottingrestdtst?CYP2(l9p:nreinnn,1in …rdcelllines II,la,lk.l-2—3一h?rlli45一hlm~lI……AIlJ 1;6nli—n|J一,F'2CI'ih1k7hlllnm?H…1i??儿…lL1llIh, iT;A;8hlm~lI,tlI…ml1】IrtteffC;2;q—I…lI一in…?lkl0hm_I …一wIlIn'_t…iH…u.t『lil1Plnl】 4讨论 癌症易感性的研究已经向寻找明确的生物标记 物方向发展,从而会绐公共健康和预胁医学带来 ChinJ?J.~'4905f一.It?3?217 0蹲羹纛键l熬骥 ?嗣嘲黼鞠 大的益处.人们在接触各式各样的环境前致癌物 时,大约有30%可被药物代谢酶类(DMEs)代谢,而 这些DMEs又分为两相,其中第一相酶绝大多数为 将前致癌物活化为有基因毒性的亲电性中间产物的 CYPs,第二相酶则是催化中间产物为水溶性衍生物 的结合酶.因此若编码这两相酶的基因存在基因多 态性,必然使活性表达不同,从而对前致癌物的解毒 作用不同,就使癌症易感性也呈现多态性_3J. 细胞色素P450是含血红素的加单氧酶,可以对 药物,环境污染物和致癌物等进行氧化代谢.它包 含了4个紧密相关的酶:CYP2C8,CYP2C9, CYP2C18,和CYP2C19,他们的序列88%以上存在着 同源性,其中CYP2C19与CYP2C8,CYP2C18和 CYP2C9的同原性分别高达91%,93%和96%.由 于CYP2C19对抗惊厥药s一美芬妥因的4.羟化代谢 的不同,可以将人群分为PMs和EMs.亚洲人群中 CYP2C19PMs的发生率为18%,25%.正是由于其 多态性的存在,人体对外源性化合物的代谢的半衰 期,有效性和毒性都受到影响.CYP2C19是其中一 个很重要的代谢酶,能对包括s一美芬妥因,地西泮, 普萘洛尔,奥普拉唑,丙咪嗪,氯丙咪嗪,氯胍等进行 代谢[. CYP2C19作为CYP2C亚类中的一员,它主要是 在肝细胞内合成并发挥其代谢作用的,在肝外组织 中的分布是很少的.Klose等_5J对器官库中的组织 肾上腺,睾丸,前列腺,肾脏,卵巢等提取的RNA,和 直接购买的脑,子宫,乳腺,肺和十二指肠的总RNA 一 起用特异性C?)2C8,CYP2C9,CYP2C18,C?)2C19 引物对肝外组织中CYP2CsmRNA的分布情况进行 研究分析表明,在肾,肾上腺,脑,子宫,乳腺和卵巢 检测到CYP2C8mRNA;在肾,睾丸,肾上腺,前列腺 和卵巢组织中有CYP2C9mRNA;CYP2C18mRNA则 只在脑,子宫和乳腺中有表达,在肾脏中有微量的表 达;CYP2C19mRNA除了在十二指肠中有少量的表 达外,其他的H:FCF组织中均无CYP2C19mRNA的表 达.我们检测的对象是外科手术中取得的新鲜病理 标本,更能准确地反映中国汉族人群中cYP2c19 mRNA的组织分布情况.本研究对中国汉族人群中 主要的组织包括肝,肺,大肠,胃,乳腺,宫颈,卵巢, 脑,胰腺,肾,食道等11种组织进行了较系统地 CYP2C19mRNA分布调查,结果显示除了在肝脏标 本以外,我们研究的10种组织标本,没有发现 CYP2C19mRNA的表达,同时采用WesternBlotting的 ' 218'ChinP『mJ.2005February.Vo1.4DNo.3 检测结果也显示其与RT-PCR检测结果的一致性 deMorais等l2j对CYP2C19基因使用PCR-RFLP 分析方法发现了两个单碱基突变位点,分别被命名 为CYP2C19*2和CYP2C19*3,其酶的代谢活性呈 现明显的下降.99%的东方人群PMs和87%的白 种人群PMs都是由这两个基因多态性引起的.近 几年来,又分别发现了CYP2C19*4至CYP2C19* 15,但其发生频率是相当低的. RT-PCR是针对RNA进行分析的PCR方法,可 以在mRNA水平上对基因遗传和酶多态性调节机制 进行分析.已成功地应用于CYP1A1,CYP1B1, CYP1A2,CYP2A6/7,CYP2D6,CYP2E1,CYP3A4/5/7 等细胞色素P450亚类mRNA的分析中_6J.Wang 等[9J采用竞争性RT-PCR的方法对CYP2C19mRNA 进行的测定,并对方法学的可行性进行了论证,结果 显示其可以对肝脏标本中CYP2C19全长RNA进行 半定量分析. 本研究表明,尽管中国人的CYP2C19基因型与 西方人群有很大的差异,但通过对组织学定位分析, 说明组织表达的特异性还是基本一致的.因此,进 一 步的研究应当是着重于人类主要组织在发生癌变 情况下CYP2C19mRNA的表达情况以及是否与正常 组织相比有差异,以及CYP2C19mRNA表达产物即 CYP2C19酶蛋白的表达情况,用以指导临床的用药. 参考文献 [1]XieHG,KimRB,WoodAJ,eta1.Molecularbasisofethnicdiffer— encesindrugdispositionandresponse[J].AtomRevPbarmacolToxi— col,2001,41:815. [2]deMoraisSM,WilkinsonGR,BlaisdellJ,eta1.Ther~jorgenetic defectresponsibleforthepolymorphismofS-mephenytoinmetabolism inhumans[J].,BiolChem,1994,269(22):15419. [3]NerbertDW,MckirmonRA,PugaA.Humandrug-metabolizingen— zymepolymorphisms:effectsonriskoftoxicityandcancer[J].DN4 CellBiol,1996,15(4):273. [4]WedlundPJ.TheCYP2CI9enzynlepob3norphism[J.Pharmaeolo— gY,2000,61(3):174. 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