暴发性肝功能衰竭小鼠模型的建立及其治疗研究

暴发性肝功能衰竭小鼠模型的建立及其治疗研究 暴发性肝功能衰竭小鼠模型的建立及其治 疗研究 中国中西医结合急救杂志2006年?月第13卷第6期ChinJI'CMwMCrit(;are,Novenabr2006.Vo1.13,N0.6 暴发性肝功能衰竭小鼠模型的建立及其治疗研究 ?361? ? 论着? 高峰.陈嘉薇,韩伟..杨宝山.,马英骥 (1.上海市第一?人民医院病理科,上海200080;2.哈尔滨医科大学附属第一医院,黑龙江哈尔滨150001) 【摘要】目的:建立暴发性肝功能衰竭(FLF)小鼠模型并探讨复方甘草酸苷(SNMC)的保护作用及可能 的作用机制.方法:采用D一氨基半乳糖(I)一Gain)和脂多糖(L1S)一次性腹腔注射构建FLF小鼠模型.利用光 镜,电镜观察小鼠肝损伤情况;应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测肝细 胞原位凋亡情况;应用免疫组化法分别检测肝组织中细胞色素c和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶一3 (caspase一3)的达.结果:D—Gain加I,Ps可成功构建FI,F小鼠模型.光镜及电镜可见肝细胞大量凋亡,且 凋亡情况随治疗时间的延长明显改善.TUNEL检测结果表明,随着SNMC治疗时间的延长,凋亡指数逐渐降 低.细胞色素c和caspase一3在模型组细胞阳性表达明显增加,随SNMC治疗时间延长表达逐渐减少.结论; 利用D—Galn和LPS可以构建理想的FLF叶,鼠模型.SNMC能有效抑制小鼠FIF模型中的肝细胞凋亡 SNMC可能通过稳定线粒体膜抑制细胞色素c释放及其随后caspase一3活化, 从而阻断肝细胞凋亡的进行. 【关键词】复方甘草酸苷;D一氨基半乳糖;脂多糖;肝功能衰竭,暴发性;动物模型 中图分类号:R256.4;R285.5文献标识码:A文章编号:1008—9691(2006)06—0361 一O4 EstablishmentofreduplicatedmodeloffulminantliverfailureandresearchonitstreatmentGAOFeng, (?HENthawei,HANWei.YANGBao—shah..MAYing— ji.J.DepartmentPathology,theFirst PeopleHospital,Shanghai200080,China;三 theFirstttospitalofHarbinMedi~alUniversity.Harbin 150001,lteilor,}gjiang,China [Abstract]Objective:Toreduplicatethemodelsoffulminantliverfailure(FLF)ofmiceandinvestigate theprotectiveeffectofstrongerneo—minophagenC(SNMC)onFIF.Methods:D— galactosamine(D—Galn) and1ipopo1ysaccharide(LPS)wereinjectedintotheabdominalcavityofmiceoncetoestablishexperimental modelofFl,F.l'hedamageofliverwasdetectedbylightmicroscopeandelectronmicroscope.I'hehepatocyte apoptosisin—situwasestimatedbytermina1deoxynucleotidy1一 transferasemediateddUTPbiotinnickend 1abeling(I'UNEI).CytochromeC(CYC)andcaspase一 3in1ivertissuesweredeterminedbyimmuno histochemistry.Results: 【]GainandLPScouldbeusedtoreduplicatethemodelsofFLF.Intimmodel,alot ofhepatocyteapoptosiswasestimatedbylightmicroscopeandelectronmicroscope,andimprovedwith prolongationofthetherapeutictime.I'UNEIassayrevealedthattheapoptosisindexwasgraduallydecreased aftertheprolongationofthetherapeutictimeofSNMC.ThecellularpositiveexpressionsofC YCand caspase3werestronginthemodelgroup,andtheyweredecreasedwithprolongationsofSNMCtherapeutic timeinthetreatmentgroup.Conclusion:D— GainandLPScanbeusedtoestablishaperfectmodelofFLF. SNMCcaneffectivelyinhibitthehepatocyteapoptosisinthemodelsofFIF.Itsinhibitionsoft hereleaseof CYCandtheactivationofcaspase3arepossiblybystabilizingthemembraneofmitochondriainhibiting releaseofCYCandactivationofcaspase一 3,thustheprogressofhepatocyteapoptosiscanbeprevented. [Keywords]strongerneominophagenC;Dgalactosamine;liPopo1ysacharide;fulminantliverfailure; animalroodel 暴发性肝功能衰竭(FIF)是一种由各种因素导 致的急性或亚急性大块肝细胞坏死,临床上以引起 凝血酶原时问显着延长及肝性脑病为其特征.研究 证实,肝细胞的异常凋亡在重型肝炎发病中起重要 作用.以甘草酸为主要成分的复方甘草酸苷 (SNMC)具有抗炎及免疫调节等作用.临床经验证 作者简介:高峰(1972),男(汉旅),河北滦县人,医学硕士 讲师,主治医师(Email:gaol891@yahoo.cotl1.on). 实,SNMC具有明确的肝细胞保护作用,但其保护 机制尚未十分明确.目前对重症肝炎发病机制的研 究多集中于Fas/FasI以及肿瘤坏死因子(TNF)等 所介导的肝细胞凋亡,而对线粒体中细胞色素C在 肝细胞异常凋亡中所起的作用方面却少有报道.本 实验中通过建立小鼠FIF模型,探讨线粒体及细胞 色素C在重型肝炎发病机制中的作用及SNMC抑 制肝细胞凋亡的可能机制. ?362?中国中西医结合急救杂志2006年l1月第13卷第6期 ChinJTCMMCritCare, ,N— ovem — ber20,._3.No一 . 一 6 1材料与方法 1.1实验动物:1O,12周龄昆明种小鼠7O只,雌 雄各半,体重2O,22g,由哈尔滨医科大学第一临床 医学院动物实验中心提供. 1.2实验材料:D一氨基半乳糖(D—Gain),细菌脂 多糖(LPS)均购自Sigma公司;SNMC由日本美能 发源制药公司提供;兔抗小鼠天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶,3(caspase一3)单克隆抗体(单抗)购白 Sigma公司;抗细胞色素C抗体,免疫组化染色试剂 盒和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末 端标记法(TUNEL)试剂盒均购白北京中山生物技 术有限公司. 1.3实验动物分组及处理:采用随机数字表法将小 鼠分为正常对照组(7只),模型组(15只)和SNMC 保护组(48只)3组.正常对照组腹腔注射生理盐水 0.2ml;模型组采用一次性腹腔注射D—Galn 1000mg/kg+LPS100t~g/kg制备小鼠FLF模 型,其肝组织病理学变化相当于重型肝炎肝组织的 病理特征;SNMc保护组同时经腹腔注射SNMC 1ml/kg,每日2次.正常对照组小鼠注射后6,9和 12h,1,3,5和7d分别断颈处死;模型组小鼠于用药 后6,9和12h分别断颈处死,每个时间点5只; SNMC保护组小鼠于用药后9h,12h及1,3,5和 7d分别断颈处死,每个时间点8只.打开腹腔,摘取 肝左叶,切取肝组织3块,1块用体积分数为2.5 的戊二醛固定,用于电镜分析;剩余2块用体积分数 为4的多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片备检. 1.4TUNEL原位肝细胞凋亡检测:石蜡切片,常 规脱蜡,水化,用细胞凋亡检测试剂盒检测肝细胞凋 亡情况,最后常规3,3二氨基联苯胺(DAB)显色, 苏木素复染,中性树胶封固.计算凋亡指数并判定肝 细胞凋亡程度,每组各时间点观察2张切片,每张切 片分析5个视野,每个视野计数100个细胞,计数凋 亡细胞百分比的均数为凋亡指数?.细胞核无棕褐 色染色为阴性;细胞核呈棕褐色染色为阳性. 1.5细胞色素C及caspase,3检测:石蜡切片,常 规脱蜡,水化,用免疫组化试剂盒检测细胞色素C 及caspase,3.Caspase一3抗体稀释1:100,抗细 胞色素C抗体稀释1:100.最后常规DAB显色,苏 木素复染,中性树胶封固.细胞胞浆呈棕黄色染色为 阳性. 1.6统计学处理:数据以均数土差(土5)表 示,组间比较采用方差分析,P<O.05为差异有统计 学意义. 2结果 2.1光镜观察:正常对照组肝组织切片苏木素一伊 红(HE)染色显示,肝小叶结构清晰,肝细胞索呈放 射状排列,肝血窦清晰.模型组6h显示肝细胞水肿 明显,可见少量凋亡小体及点灶坏死;9h肝细胞凋 亡及坏死更为显着;12h肝组织坏死范围明显增 大,肝小叶结构破坏超过整个切片的2/3,肝细胞索 崩解,大量肝细胞凋亡(彩色插页图1).SNMC保护 组9h肝细胞水肿伴脂肪变性;12h可见周围肝细 胞索紊乱,细胞核染色质边集,出现灶状坏死,肝窦 内可见多个凋亡小体,细胞胞浆呈深红色,细胞核浓 缩,崩解,少量肝小叶结构破坏,损伤程度较模型组 明显减轻,以后肝组织逐渐修复;3d肝小叶结构基本 恢复正常,肝细胞轻度水肿,肝窦内皮细胞增生,可见 少量散在肝细胞凋亡和点灶坏死(彩色插页图2). 2.2电镜观察:正常对照组可见肝细胞板排列整 齐,肝细胞核仁明显,细胞内膜结构丰富.模型组6h 可见肝细胞核缩小,染色质边集核膜下可见新月体 形成,线粒体肿胀,质膜和细胞内膜结构明显紊乱 (彩色插页图3).SNMC保护组9h细胞核浓缩的 染色质紧靠核膜下,粗面内质网扩张脱颗粒;1d肝 细胞膜结构基本接近正常,细胞核膜下有轻度的染 色质边集,线粒体嵴清晰可见(彩色插页图4);7d 后基本同正常对照组. 2.3肝细胞凋亡检测(表1):凋亡的肝细胞细胞核 或细胞胞浆呈棕褐色着染,凋亡小体也呈阳性着色. 正常对照组未见凋亡细胞;模型组肝组织可见较多 凋亡细胞,多分布于坏死区及汇管区周围;SNMC 保护组随着治疗时间的延长,凋亡细胞逐渐减少,且 染色逐渐减弱. 表1各组各时间点肝细胞凋亡检测及凋亡指数比较(士) Table1Comparisonofapoptosisindexandapoptosls detectionofhepatocyteineachgroupat differenttimepoints(x-t-s) 注:与模型组9h比较:P<0.01;与模型组12h比较:P<o.O1 中国中西医结合急救杂志2006年l1月第13卷第6期 ChinJTCMwMCritCare,November2006,Vo1.13,No.6?363? 2.4肝组织细胞色素C及caspase一3检测:正常 对照组有少量细胞色素C及caspase一3表达,且散 在分布.模型组9h大部分肝细胞胞浆中呈强阳性 表达,多分布在坏死区及汇管区(彩色插页图5). SNMC保护组9h随治疗时间的延长,细胞色素C 及caspase一3的表达均逐渐减弱和减少(彩色插页 图6). 3讨论 本实验中用IPS加D—Gain成功复制类似人 类FIF小鼠模型,为FIF的研究及治疗提供了理 想的实验材料. 重型肝炎发病的根本原因是肝细胞大量死亡致 肝功能衰竭,肝细胞死亡在病理学上可分为坏死和 凋亡两种形式;TNF—d,白细胞介素一2(IL一2)及 IL一8等在重型肝炎患者肝细胞损伤,坏死中起重 要作用:而线粒体和细胞色素C在细胞凋亡机 制中的作用越来越引起人们的重视明,线粒体跨膜 电位与线粒体通透性改变在细胞凋亡过程中起重要 作用.线粒体内包含一些与细胞凋亡有密切关系 的物质,如细胞色素c,凋亡诱导因子(AIF)和活性 氧自由基(ROS)等,在凋亡信号刺激下,线粒体膜通 透性增加,由此产生一系列关键性变化,包括细胞色 素C释放,线粒体跨膜电位下降,细胞内氧化还原 状态改变,Bcl基因家族成员介入等,其中细胞色 素C释放被认为是凋亡过程中的关键事件".细胞 色素C自线粒体释放后与Apaf一1及caspase一9 共同组成了凋亡体,又称"诱导死亡信号复合体" (DISC),当Apaf一1与细胞色素C,dATP,ATP结 合后便可经募集区活化caspase一9,再作用于其下 游的靶caspase一3酶原,活化的caspase一3作为效 应因子作用于不同的靶细胞,经蛋白水解作用导致 细胞凋亡". SNMC是甘草的皂甙成分,由甘草次酸和2个 分子的葡萄糖醛酸组成,1958年曾被日本学者用于 慢性肝炎患者的治疗,此后一直作为护肝药物应用 于临床.SNMC具有保护肝细胞膜,抗炎,免疫调 节,类激素样作用等药理作用,最近日本学者发现, SNMC还具有抗细胞凋亡作用",但其确切机制尚 未完全阐明.本实验通过建立小鼠FLF模型,并应 用SNMC进行体内肝细胞保护.TUNEL检测证 实,SNMC保护组随着治疗时间的延长,凋亡指数 明显下降;电镜下观察模型组肝细胞呈现核缩小,染 色质边集等典型凋亡的形态学变化,而治疗组随治 疗时间的延长而明显改善.说明SNMC能有效抑制 肝细胞凋亡. 细胞色素C具有双重功能,除参与电子传递 外,在细胞凋亡启动中还作为一个凋亡启始因子,起 重要作用.细胞色素C移位到胞浆可引起caspase级 联反应,并最终活化caspase一3,导致肝细胞凋亡. 小鼠肝组织的免疫组化染色可见模型组细胞色素C 及caspase3均大量表达,而SNMC保护组随着时 间的推移,细胞色素C及caspase一3表达逐渐减 少,说明caspase一3的表达与细胞色素C密切相 关,可能受释放至胞浆中的细胞色素C调控.同时, 推N~]SNMC可能通过稳定线粒体膜抑制细胞色素C 释放及其随后caspase一3的活化,从而阻断肝细胞 凋亡的进行.但其如何稳定线粒体膜,阻止细胞色素 C释放,还有待于进一步研究. 综上所述,我们认为SNMC能有效抑制小鼠 FLF模型中的肝细胞凋亡,而且通过本实验可以推 断重型肝炎的发病机制可能与线粒体途径的肝细胞 异常凋亡有关. 参考文献: [1]汪俊韬.于少军.肖炜.复方甘草甜索在肝病领域的临床应用[J]. 中国药房,2002,13:500—502. [2]向晓星,王国俊,蔡雄.暴发型肝炎肝细胞凋亡的阻断治疗研究 CJ3.肝脏,2001,6;64—65. C33KondoT,SudaT,FukuyamaH,eta1.EssentialrolesoftheFas ligandinthedevelopmentofhepatitisCJ].NatMed,1997,3: 4O9—413. [4]周再生,叶晴,吴素红,等.不同类型非生物人工肝治疗重型乙型 肝炎疗效观察CJ3.中国危重病急救医学,2005,I7:45. 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Hi0l,1999,15:269— (收稿日期:2006一O2—26修回日期:2006—09—16) (本文编辑:李银平) 黄芪对兔内毒素性急性肺损伤的保护作用 繇_ relPalhnlogychangesof]iverliss … ueat12hou ' rs l—mode]g?upund日rRghtmicroscopefHE200I ;.j篇changesorIlvartissue'HEx400 inSNMCgroupunderIighlmlCfOscop~fHEx4001 Fkgur~3Palhorogychangesofliverissueat6ho . ur鬈:意inmod~JgroupU~dStefecIr0nmictosco~(o~micaridx5000】 lnSNMCgroupUNder~lscttonmIcrO$cODefosmicacidx8000 墨 : 5Expr:;品 鬈警躲 ;6Expressionol.cytechrom.eCand c……hlgf0cheml51w×400l