Shewanella piezotolerans WP3中异柠檬酸裂解酶ICL基因的克隆表达，酶学性质研究及在不同胁迫条件下的转录翻译表达（可编辑）

Shewanella piezotolerans WP3中异柠檬酸裂解酶ICL基因的克隆达，酶学性质研究及在不同胁迫条件下的转录翻译表达（可编辑） Shewanella piezotolerans WP3中异柠檬酸裂解酶ICL 基因的克隆表达，酶学性质研究及在不同胁迫条件下的转录 翻译表达 厦门大学 硕士学位 Shewanella piezotolerans WP3中异柠檬酸裂解酶ICL基因的克 隆表达，酶学性质研究及在不同胁迫条件下的转录翻译表达 姓名:李金媛 申请学位级别:硕士 专业:生物化学与分子生物学 指导教师:肖湘 20070701 摘要 摘要 WP3的异柠檬酸裂解酶，它是乙醛 本实验研究的是Shewanellapiezotolerans 酸循环的关键酶，在WP3基因组里是单拷贝的。 WP3分离自西太平洋1914米的深海沉积物中，它是一株革兰氏阴性，兼性厌 氧的杆状细菌，耐冷并耐压。其生长温度范围是0(28。C，最适生长温度是20?， 生长压力范围是0(50Mpa。最适生长压力为20Mpa，是研究极端微生物适应极端 环境的理想材料【11。 基因芯片的结果表明，当WP3处于一些环境因子，如生长温度、压力的变化， 温度，压力的短时间刺激等，很多基因都有明显的改变。本实验从WP3的代 谢途 径的关键酶出发，探索极端微生物适应胁迫条件时 特别是比较明显的低温和高 压条件 异柠檬酸裂解酶的特性和表达特征，进而为研究极端微生物的极端环境 适应性机理研究奠定基础。 maris的适冷酶基因icl更为相似。为了深入研究ICL在各种环境下的代谢中所 起的作用，我们构建了WP3Icl基因的原核表达质粒，在E(coli中表达后纯化重 PCR 组ICL，制备抗ICL的多克隆抗体，而且在转录和翻译水平上运用Real(time 和Western Blotting研究了icl基因的在各水平上的表达情况。为了研究ICL在乙 醛酸循环，甚至WP3整个能量与物质代谢中的地位和角色，我们更进一步构建 了WP3的icl的缺失突变体，并研究了icl缺失的情况下WP3的生长状况和它的 底物竞争酶一异柠檬酸脱氢酶的表达变化。 酶活分析表明，ICL不仅在序列上也是在酶活性质上是一个冷适应酶，它的 最适酶活温度是25。C，但它不像C(maris一样是个冷诱导酶。在各个环境变化 下的icl基因的转录，翻译水平都有明显的变化，在冷激、热激下，icl基因在转 录水平上都出现了明显的低表达，在低温下也有一定程度的下降，但是没有冷激 而在压力刺激和高压环境下生长时，都出现了高表达。通常低温的反应大。 和高 压对深海耐压菌的很多基因具有相似作用方式、原理，特别是与膜流动性，渗透 性相关的基因上，而在WP3中ICL对低温和高压的表达出现相反的趋势，这也 是一个未来感兴趣的研究方向。ICL对于乙酸的代谢，和其他大多数菌株一样， 摘要 是必需的，在转录、翻译水平都有高表达。而在WP3的icl突变体中，在 20。C和 4(C的菌株生长状况和野生菌相比，没有什么变化，我们推测在WP3中，乙醛 酸循环只是起辅助的作用，即使菌株在相对恶劣的环境中，而TCA循环一直都 是主要的代谢循环。而icl的缺失并没有导致异柠檬酸脱氢酶的表达上调，而是 出现了表达下调，说明ICL和IDH的关系更多的是代谢过程中中间产物上的互 助，支援互补关系，而不是底物的竞争关系。 关键词:Shewanella piezotoleransWP3;异柠檬酸裂解酶;实时荧光PCR;基 因表 达;胁迫反应 ? Abstract Isocitrate of ofa seabacterium― lyase，thekeyenzymeglyoxylatecycle deep Shewanella in withisocitrate WP3，is piezotoleransuniquegenome(ICLcompetes for ofTCA itscornnlon substrate，isocitrate( dehydrogenasecycle Thebacteriuminthis wasisolatedfrom sediments used ofwest study deep??sea Pacificatthe of1914meter(The andmolecular depth analysis phylogenefic study showsthatthebacteriumisa and microbewhichbe psychrophilicpiezotolerant may idealto the mechanismof theresultof study adaptation extremophiles(And of variousenvironmentfactors WP3under in significant microarray displays changes the related埘tllcoldand aim of geneexpression shock，adaptation(The pressure istofindthe mechanismof and role presentstudy adaptation extremophilespossible ofICL involved theextremeconditionof and in，under gene temperaturepressure invitro( TheICL ofWP3contrainsall 1 1 frameof58 a gene openreading bp，encoding 526aaresidues withmolecularmassof ofthis protein 58kDa(Sequenceanalysisgene revealvedthatitis totheICL ofShewanellaand highlyhomologousgenes species toICL ofcold Colwelliamaris alsohas to homologygene adapted corresponding someother cloned fromWP3and theICL mesophilicmicroorganisms(Wegene the to of andthemetabolic the purifiedenzymeinvestigatespecificityenzyme westudiedtheICL atbotll andtranslational regulation(Then gene transcriptional level real―timePCRandwestern theICL using Wasknockedoutto theroleandfunctionoflCLinisocitratemetabolism gene identify byWP3( TheICLofWP3exhibits characteristicfeaturesof many cold― adapted， thermolabilerevealed andhasimum enzymes byenzymeacivityassays enzyme at25。C(Butit isnotacold―induciblelikethatofCmar西(It activity enzyme to environment its and efficiently responsesvarying by transcription changing translationlevel(At decreasesits level、?itll shockand cold，heat sharply expression for increaseforthe it thatICLis pressuringshock,adaptation(Andsuggests important HI acetatemetabolismandisinduced and acetate translationallyby transcriptionally similartotheICLsfromother iclmutantwe observetheidh organisms(In unexpectly thatIDH??-II reducetheRNAlevel whileIDH--I geneexpression notability expression hasno meansthatidh doesnotincreaseto the change，which expression supply conditionsat20。Cand4。Cdiffer littlefrom glyoxylatecycle(Thegrowing relatively wide whileICListhe in resultsshowthat type keyenzymeglyoxylatecycle(These the of inWP3metabolismis evenatlow proportionglyoxylatecycle verytiny andTCA of is themain atkinds conditions( temperature cyclealways path growth the and TCA inWP3 forintermedia Probablyglyoxylate cycle cycle cooperate insteadof forsubstrate( products competing Keywords:Shewanella piezotoleransWP3;isocitratelyase; Real-timePCR;gene expression;stressresponse IV 缩写词表 i 缩写词表 Abbrevati ons base bp pair碱基对 PCR chain polym淌ereaction聚合酶链式反应 dNTP deoxyribonucleotide triphosphate脱氧核苷三磷酸 ddH20 double distilled wate双蒸水 DNA deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸 RNA ribonucleic acid核糖核酸 G+C guaninemytosine鸟嘌呤+胞嘧啶 M marker分子量标记 TAE Tris,acetate buffer electrophoresisTriS,醋酸电泳缓冲液 Thermos 咖 aquaticus热聚合酶 TE 确s,EDTA嘶S,EDTA缓冲盐溶液 瞄S DEPC diethypyrocarbonate焦碳酸二乙脂 姆 Ammonium Persulfate过硫酸胺 陋 Alkaline Phosphatase碱性磷酸酶 TEMED N，N，N’，N'-TetramethylethylenediamineN，N，N’，N’(四 甲基乙二胺 SDS sodium dodecylsulfate十二烷基硫酸钠 PAGE polyacrylamide gelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳 t玳asin RNaseinhibtor RNA酶抑制剂 MP magepa兆帕 universal UPI，UP2 primerl，2通用引物1，2 kb ldlobase千碱基对 mM milmolar毫摩尔 ml mililitre毫升 ul microlitre微升 Pg microgram微克 rain minute分钟 0RF open frame开放读码框 reading V 缩写词表 revolutions minute转,分钟 呻 per 僦 second秒 缸 amino acid氨基酸 叩 dithiothreitol二硫苏糖醇 diamine-tetra-acetic ethylene acid乙二胺四乙酸 一 sulfoxide二甲亚砜 dimethyl 一 isopropylthio--D-galactoside异丙基(-D(半乳糖苷 一 一 5-溴一4一氯(3(吲哚(p(D(半乳糖吡喃 mRNA ribonucleic acid信使核糖核酸 messenger OD density光密度 optical RNase ribonuclease RNA酶 IU乙PCR reverse transcription-PCR反转录聚合酶链式反应 BSA BovineSerum Albumin小牛血清白蛋白 cDNA DNA互补DNA complementary E(coli Escherichia coli大肠杆菌 ICL isocitrate lyase异柠檬酸裂解酶 Icl isocitrate lyase异柠檬酸裂解酶基因 IclR A ofaceBAK repressorprotein operonaceBAK操纵子抑制子 IDH isocitrate dehydrogenase异柠檬酸脱氢酶 Idh isocitrate dehydrogenase异柠檬酸脱氢酶 MS malate synthetase苹果酸合成酶 、御3 Shewanella WP3希瓦氏菌WP3 piezotolerans IHF host factor整合作用宿主因子 integration VI 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人 签名 : 务(今 造 等毋-7“日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1、保密 ，在 年解密后适用本授权书。 2、不保密 ‖ 请在以上相应括号内打“?" 作者签名: 李仑趁 日期:砷年7月7 日 聊躲南J隰?1年枷乞曰 1前言 海洋占地球表面的70,以上，而深海一般指1000m以下的海洋，占地球海洋 000"--'6 总体积的75,，地球上绝大部分的深海都为1 000m 深。深海环境一般为普 通生物不能生存的高压、低温、黑暗、高盐、寡营养、高辐射的特殊极端环境[21。 在微生物的进化过程中自然选择使一些微生物对极端环境有较强的适应性，这些 微生物称为极端微生物，又称嗜极菌 Extremophiles 。生活在这种特殊环境下的 微生物具有独特的基因类型，特殊的生理机制以及特殊的代谢产物，作为地球上 它在生命起源、系统进化等方面将给人们很多重要的启示。的边缘生命现象， 极 端微生物的生命现象研究有力地促进极端微生物资源在环境保护和修复、人类健 康、高效率低成本生物技术新工艺等方面的利用，乃至外空间的开发和利用。近 年来，对极端微生物的研究很多转向大多为极端微生物的古细菌。目前，从古细 菌的命名、分类到生活环境、生理结构及适应机制、应用等方面，都有了很大的 发展。这方面的研究已成为在生命科学研究的一个重要部分，极端微生物已经成 为发达国家竞相占有和发掘的重要资源。近年来我国综合国力的加强，对推动这 方面的研究工作顺利而有效开展提供良好的平台。相比较而言，国内在菌种分离 方面已有许多报道，国外研究较多的是各种极端微生物的生理结构特点和适应机 制等，还有许多未弄清楚的问题;应用方面也有一些领域有待探索。进一步深入 研究包括古细菌在内的极端微生物的适应机制及遗传基础，对于充分利用自然资 源造福人类社会，具有重要的意义。 深海是以高压和低温为主要特征的极端环境，深海细菌是生活在这一极端环 境中的主要生物类群。其基本特点是细菌细胞对环境的嗜冷或耐冷，嗜压或耐压。 由于大洋深海底部的低温性，目前分离的嗜压微生物大多也是嗜冷的【31。 本文所研究的深海细菌分离自西太平洋1914米的深海沉积物中，菌种鉴定为 耐压。其生长温度范围是0(28。C，最适生长温度是20。C，生长压力范围是0(50Mpa， 最适生长压力为20Mpa，生长盐度范围是1,-7,，最适生长盐度为3州,， 生长pH为中性，是研究极端微生物适应极端环境的理想材料【ll。 1(1深海微生物研究进展 深海深部生物圈的发现是对“生物圈”广泛范围的进一步了解。虽然海底采集 前言 沉积柱状样已经有近八十年的历史，大规模的系统研究开始于1968年的深海钻探 。“深海钻探 DSDE 钻探 IODP，2003( ”，这部深海研究的三部曲，是国际地球科学历时最长、规 模最大，也是成绩最为突出的合作研究计划。大洋钻探计划ODP以独特的视角为 我们呈现出另外一个生命世界一掩埋在洋底沉积物中和地壳中的生物圈。在数千 米深海海底存在着由微小的原核生物组成，数量极大的生物群，有人估计其生物 量相当全球地表生物总量的1,10。与热液口“自养”的微生物不同，深部生物圈的 原核生物依靠地层里的有机物实行“异养”。深海大洋中生物圈的发现，让人类 认识到地球生态系统的真正基础在于原核生物。正是这些原核生物多种多样的新 陈代谢过程，产生了多种多样生物地球化学效果，在此基础上建立了地球的生态 系统。 在目前已发现的各种极端环境中深海蕴藏着的生物资源极为丰富，其中最主 要的是深海微生物，但这些微生物大部分还鲜为人知。深海环境下极端微生物的 研究不仅是目前生命科学最前沿的领域之一，也是海底深部生物圈研究和海底流 该项研究将回答生命起源、生物进化、外太空体活动研究重要的组成部分。 生命 探索等生命科学的重大问题并带动包括21世纪地球科学内的其它学科领域的重 大发展。 几十年来，美国、德国、英国、法国、俄罗斯、日本等国家投入大量资金用 于对大洋资源的勘查，谋求对世界海底资源再分配。新一轮合法、有序的“蓝色 圈地”运动悄然兴起。国内对深海微生物圈的研究与开发力量还比较薄弱， 研究 深度也不够。在海底地质构造和矿产资源应用方面，深海微生物活性代谢产物和 新酶开发等应用方面，总体上落后15(20年。其主要原因在较大程度上与技术方 法和仪器设备的性能、精度有着直接的关系。但随着国家综合国力的增强，对海 洋学科和生物学科的重视，特别是深海微生物研究的投入的加大，目前，在深海 微生物的分离培养、多样性调查、功能基因研究和适应性机制研究 如深海嗜压 菌的嗜压机制 等方面取得了一定的进展;各类极端微生物在工业用酶、工具酶、 也有了突破，使人们看到了环境修复以及生物活性物质等方面的开发应用， 深海 微生物开发的巨大潜力和广阔的应用前景【4】。 2 行为期5年深海极端微生物的研究，现在每年仍维持300万美元的资助。从深海中 获得了1000多株嗜压、嗜冷、嗜热、嗜碱及耐有机溶剂的多类型的极端微生物， 最引人注目的则是有机溶剂菌，其极端因子为苯、甲苯、环已胺、煤油等，溶剂 浓度可达50,。这些极端微生物在新酶、新药开发及环境整治等方面的应用潜力 极大。 欧盟于96年结束的一个资助期为三年的极端微生物的预研项目一 of Biotechnology asCell 端细胞工厂” ExtremophilesFactory ，开发极端微生物及其产物的利用 价值。作为欧盟的整体策略，极端微生物项目的目的是“利用生物技术改造现在 的化学工业过程”，项目协调人Antrinikan教授认为，极端微生物工业的时代已经 到来。 1997年起，美国国家科学基金会启动了关于极端微生物的研究的专项 LifeinExtreme 的工作，基本围绕三个问题:物种多样性一生命极限条件是什么?功能多样性一 生命的行为规律是否存在?生命进化一生命如何从前生条件进化而来?在极端 微生物的生物技术利用方面，美国已经开始享受极端酶带来的利益。PCR酶、ENT 酶、碱性酶及极端高温酶己在产业上产生了重要影响。极端微生物的开发利用， 有望在新材料、新药等方面开辟新的途径。 the ScienceatNew 2001年美国国家科学基金 NSF 在其题为“Ocean Millenium”的科学发展展望中，将海底流体活动研究列为海洋科学今后十年 最重要、最有可能取得重大突破和科学发现的前沿研究方向之一，生命科学与海 底地球物理、地球化学等在上述研究中将占据重要地位。于2003年10月份开始的 整合大洋钻探计划 IODP 将深部生物圈和洋底、海底列为该计划中三大科学课题 之一。 由中国大洋协会和国家海洋局第三海洋研究所共同建设管理的中国大洋生 物基因资源研究开发基地，除拥有较先进完备的微生物,分子生物学研究设备外， 还将得到一系列特种设备支持，包括:深海悬浮物颗粒保真采样器、船载高温高 压微生物流动培养装置、实验室深海环境模拟培养装置。基地分离了6大类极端 微生物，包括嗜酸、嗜碱、嗜盐、嗜热 来源于西藏羊八井 嗜冷、嗜压微生物， 前言 通过shotgun方法获得了其中一株耐冷耐压菌的具有自主知识产权的全基因组序 列;筛选出一批深海极端酶 高温酶、低温酶 ，并进行了基因克隆、表达研究; 从极端微生物中分离出比较特别的丝状噬菌体，研究了他们与宿主关系及在宿主 适应环境中所起的作用;从深海嗜压菌细胞膜中分离纯化出各种特殊不饱和脂肪 酸，深入研究了不饱和脂肪酸合成基因簇及他们在菌株适应极端环境过程中作用 方式。中国科学院微生物研究所东秀珠研究员主持承担的国家基础研究发展计划 -‘‘973”项目“极端微生物及其功能利用的基础研究”，于2004年10月获得批准立 】。 目前该项目实施已有两年时间，课题整体进展顺利，达到了预期项【5 的目标， 并取得了可喜的成绩。 深海微生物学的建立应该追溯到上世纪70年代，美国Scripps海洋研究所 Yayanos教授设计、改进高压培养罐并于1979年首先分离出深海嗜压菌，1989年 司开始为日本海洋科学技术中心研制深海微生物高温,高压培养系统，1994年才 完成，耗资七亿五千万日元。该系统的建设和深潜、采样系统的建设极大地 推动 了深海生物圈的研究进步。1995年Kato等分析了一个压力调控基因簇，1999年 Nogi等从马里亚纳海沟分离、鉴定出极端嗜压菌Moritellayayanosit^舛J。2003年 violaceaDSSl2 和 日本、美国和意大利相继展开了深海嗜压菌Shewanella Photohacterium SS9全 grofundumSS9全基因组测序【9，(0l，2005年3月尸profundum 基因组序列及初步分析在Science&发表【ll’121。我们实验室通过深海高压模拟系 统，分离得到了两株耐压的低温菌WP2，WP3，16S序列分析表明它们为 Shewanella属，符合目前的关于耐压菌的划分范畴，在不同压力下的生长情况也 说明了它们是很好的耐压茵。我们进一步通过shotgun方法获得了其中一株菌的 具有自主知识产权的全基因组序列。本试验利用首次分离得到的低温耐压菌WP3 开展其特有的低温酶异柠檬酸裂合酶ICL isocitratelyase 的研究。 1(2微生物极端环境及适应性机理研究进展 深海是一个特殊的生态环境，这里永久低温 火山口除外 、高压、黑暗。 生存在极端环境中的微生物，通常是通过代谢作用适应其所处生境而得以存活并 发挥作用，这些适应方式包括:用于能量转导和用于胞内环境及新陈代谢调节的 特殊机理;细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性;反应动力学;蛋 4 白质构象及酶系的功能。由基因决定的适应性变异不同于那些因适应环境而产生 的适应性变异。 1(2(1深海生态环境的特征 深海一般指1000米以下的海洋。海洋的平均深度为3，800米，最深的海沟为 而6，000米以下的深海只占海洋总体积的0(1,，因此地球上11,000米， 绝大部分 的深海都为1,000"-'6，000米深。深海生态环境具有如下特征: 高压:由于地球引力的作用，每下降lOm，压力就增加1个大气压。因此生 长在5000m深度的生物，必须能耐受500个大气压的压力。 低温:除了海底火山口及其附近的地方，深海的温度一般始终保持在3(C, I'C范围内 少数例外，如sulu海的海底温度为9(8。C，地中海的海底温度为13(5? ， 有人称之为世界上最大的冷藏箱。在这里生存的生物必须能耐受低温。但在 海底 火山口上及其附近的地方，温度高达100-400。C，在这里生活着世界上最嗜热的 微生物。 黑暗:在1000m以下的深海，完全没有太阳光，这里仅有的光线是少量的生 在深海没有进行光合作用的生物存在。 物发光和同位素产生的射线。因此 寡营养:由于光线只能到达水深300m，因此光合作用也只能在300m以上的 海水中进行。据估计，海洋中光合作用产生的有机物95,在300m以上被消耗。在 深度300(1200m的海域内，4,的有机物被分解掉，只有1,的光合作用产物可达 1200m以下的深海和海底。 盐度:深海的大部分地方的盐度同海水一样为3,左右。生活在深海的生物 均能耐受3,以下的盐度。 总之，深海环境一般为高压、低温、黑暗、高盐、寡营养。生活在深海这种 特殊环境下的微生物必然有特殊的生理代谢机制。 1(2(2深海微生物极端酶适应性机理 极端微生物由于长期生活在极端的环境条件下，为适应环境，在其细胞内形 成了多种具有特殊功能的酶，即极端酶。极端微生物是天然极端酶的主要来源， 生活在生命边缘 高温温泉、海底、南北极、碱湖和死海等 ，包括:嗜热菌、 嗜冷菌、嗜盐菌、嗜碱菌、嗜酸菌、嗜压菌、耐有机溶剂、耐辐射的菌类，体内 有适应于生存环境的基因、蛋白质和酶类。极端酶能在各种极端环境中起生物催 前言 化作用，它是极端微生物在极其恶劣环境中生存和繁衍的基础，根据极端酶所耐 受的环境条件不同，可分为嗜热酶、嗜冷酶、嗜盐酶、嗜碱酶、嗜酸酶、嗜压酶、 耐有机溶剂酶、抗代谢物酶及耐重金属酶等。目前日本、美国、欧洲等国都启动 主要工作包括:新物种的发现、新产物的研究与了极端微生物的研究计划， 生产、 极端酶的结构与功能极其基因的克隆表达、适应机理的分子基础及遗传原理、基 因组分析【131。下面主要介绍低温酶和嗜压酶在极端微生物中的适应机理。 1(2(2(1低温微生物及低温酶的适应机理 低温微生物对于低温自然环境中的物质循环、能量传递以及生物地球化学循 环过程，起着十分重要的作用，从而在全球生态与环境系统中占据重要地位【141。温 度是影响生物生存的一个限制因素，温度降低会引起细胞膜流动性、酶催化活性 的减弱，物质转运和代谢速率的降低，影响核酸二级结构的稳定性从而抑制 DNA的复制、mRNA的转录和翻译。若温度低于细胞质冰点，还会使细胞形成 冰晶体对细胞结构造成严重损坏1151，这些问题无时无刻制约着生活在低温环境中 的低温微生物的生存，但在长期生物进化过程中，低温微生物形成了一系列适应 低温的机制，表现出极其顽强的生命力。 根据Morito的定义，其中低温菌通常又被细分为两类:一类是必须生活在低 温条件下，其最高生长温度不超过20。C，在0。C可生长繁殖的微生物称嗜冷菌 C可生长繁殖的微生物称为耐冷菌 Psychrotrophs 。 微生物，在0"5。 微生物对温度的适应，主要体现方式包括:用于能量转移与传导、胞内 环境 调节及新陈代谢调节的特殊机理;细胞膜、细胞壁结构性成分与功能性成分的稳 定性; 反应动力学;蛋白构象; 酶功能。微生物的低温适应机制，涉及菌体 自身的生理、生化、遗传物质，以及所处生态环境与营养条件等众多因素，目前 还没有全面、系统的科学结论。其中，关于低温微生物膜功能和酶活性的研究， 是目前国际上广受关注并吸引大量研究力量的两大热点。相对膜功能的研究而 言，低温酶，包括细胞内部关系到菌体代谢、合成、调控的酶类以及作为产物分 泌到胞外的酶类，因其不但在微生物的适冷机制中具有重要的地位和作用，而且 在生物工程中也具有广阔的应用开发前景，故而在低温微生物及其相关产物的研 究开发中，占据了更大的比重【16J。目前开展的研究工作，主要集中在低温酶的合 6 前言 成与代谢、酶学性质、酶的分子适冷机制以及新型低温酶类的筛选与应用上。 目前研究得较多的低温酶大多由常年生活在极地或低温高压深海中的细菌 和鱼类所产生。在南极区海水中，低温细菌所占的比例相当高，其密度可达105, 106cell,m1，它们是低温酶的一个主要来源，另一来源是深海沉淀物。目前已在低 于3。C的深海沉淀物中分离出了多个种属的低温细菌，并从中成功纯化出了各类 低温酶。 由于低温酶独特的分子结构，使其具有了明显不同于中、高温酶的特征: 1 酶的最适反应温度低， 2 酶反应所需的活化自由能低， 3 酶的热稳定性低， 在高温下易失活。我们发现低温酶与相应的中、高温酶相比具有明显的结构改变， 且都是朝着蛋白质分子柔韧性增强的方向进行。其中与蛋白质结构稳定性相关的 氨基酸残基 如精氨酸，脯氨酸，甘氨酸等 出现了减少的趋势，分子内弱相互作 用和疏水作用也都有所减少，而酶与溶剂之间的相互作用增加，这些改变都导致 了低温酶的低温适应性加强‘171。酶的热稳定性、柔韧性和活性在进化过程中紧密 相关，低温酶为适应低温环境，必然要求酶分子克服低温对疏水作用、催化作用 以及蛋白质刚性的影响，同时需要通过提高特定区域或整个蛋白结构的柔韧 性， 来降低自身的活化能，才能在低温下保持高效的催化活性【181，但松散、柔顺的蛋 白质分子结构，会导致低温酶在常温或高温条件下更高的热不稳定性【191。 低温酶与同类型中、高温酶相比，在低温条件下具有更低的Km值。这反映 低温酶的催化效率 gcat,Km 及周出酶在低温下对底物具有更强的亲和力。 转率 goat 更高，这可能也是低温菌细胞中包括代谢酶在内的低温酶在低温下发挥 有效催化活力的前提‘1,20l。 在低温环境中，低温微生物主要通过合成产生大量的酶类和不同类型的酶 类、合成产生具有高催化效率和高柔顺分子构象的低温酶类，从生理代谢和生化 特征两方面，在一定范围内补偿低温对细胞造成的负面影响从而适应低温环 境。 因此，将造成冷适应性的多种原因进行归纳总结，即可为合理解释低温酶的 冷适应性机制提供依据。 1(2(2(2深海嗜压菌及嗜压酶的适应机理 深海是以高压和低温为主要特征的极端环境。深海细菌是生活在这一极端环 境中的主要生物类群。其基本特点是细菌细胞对环境的嗜压或耐压以及嗜冷或耐 7 前言 冷。根据微生物在不同压力情况下生长情况的不同，可将其分为3类，即耐压微 生物 barotolerants 、嗜压微生物 barophiles 和极端嗜压微生物 atm的压力下 最 extremobarophiles 。其中耐压微生物是指在常压以及小于400 适生长，而不能在高于500arm的压力下生长的微生物;嗜压微生物是指在400 atm最适生长，但也能在常压下缓慢生长的微生物;极端嗜压微生物是指不能在 低于400atm压力下生长的微生物。 实际上，所有的生物都会对压力的变化反应。陆地自然环境中压力的变化很 小，各种生物尽管耐受压力的能力有限，但也会对压力的增长产生反应。深海细 菌耐压生长的机制是一个令人感兴趣的问题。那么，深海细菌是如何适应高压极 端环境的?研究表明，深海细菌的转录、翻译、酶的合成，以及细胞膜的结构和 功能都对压力作出了一系列的反应。低温或高压都会导致细胞膜脂的变化， 即细 胞膜脂的不饱和度的增加和一些膜蛋白的表达[3,21】。 从深海分离的嗜压菌或极端嗜压菌的共同特征是细胞膜上不饱和脂肪酸比 例的增加。这说明通过增强膜的柔韧性嗜压微生物得以缓解环境压力，有利于细 胞膜上物质运输的正常进行，为其正常的生长代谢提供物质基础。 极端嗜压菌的DNA中有一组能调节压力影响的基因。这些基因在高压下表 达，并通过它们减少某些蛋白质的产出率，以在压力增加的条件下，可以减少膜 的通道，从而阻止体内的糖和基他营养成分扩散到体外。近来，通过分子遗传学 方法又揭示了嗜压菌新的生理特征，发现能够在500"-600atm下生长的嗜压菌在 高压下随着压力的改变其细胞壁外膜蛋白 孔蛋白 的组分也发生改变:一种 外 膜蛋I兰lH OmpH 在高压生长的细胞中合成，而在latm压力下不能合成。 000 目前，Kato等【捌已报道了从11m的Mariana海沟获取的DNA中压力调控 操纵子序列，其中一个操纵子含两个未知生理功能的开放阅读框ORFI和 ORF2， 6S 另一个操纵子含一个阅读框ORF3。Lina掣16】通过1rRNA序列分析得出所有 的严格嗜压菌及部分中度嗜压菌均归属于Shewanella属的同一分支，而且用于上 尽管压力可以影响一述3个阅读框PCR扩增的引物适用于所有这些嗜压茵。 些 基因的表达，但通过比较同一嗜压微生物在高压和低压条件下细胞中蛋白质，发 现它们大都是十分相似的。这说明只有少数蛋白质是受压力控制的，对于这些蛋 白质的压力调控机制目前还在探索过程中。 此后，在对嗜压菌的研究中又发现，其呼吸链中细胞色素【23】的表达形式及表 达量也随着海洋深度的增加而发生变化，可能是对深海高压和低氧环境的一种主 动适应，以保持其跨膜电位。 极端嗜压菌的酶必须将其蛋白质分子进行折叠，使受压力的影响减至最少。 研究表明，静压力可以增加酶的活性和稳定性，尤其对酶的热稳定性有明显的促 高压作用下酶往往有良好的立体专一性，在化学工业上有潜在的应进作用。 用前 景。 1(2(3深海微生物极端酶的研究进展 常温环境中的微生物所产酶类的最适反应温度一般在40"--60。C，在低温条 件下其催化效率将大大下降。而来源于低温微生物的低温酶类，最适反应温度一 。C，有的南极海冰细菌所产胰蛋白酶 trypsin 最适反应温度仅般在25"45 为 l2。C1241。 目前，耐冷性酶肛淀粉酶、蛋白酶、脂酶、乳酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶和 p(半乳糖苷酶等几种耐冷酶的基因已经被克隆并序列化【25之明。 自1996年Aghajari[291第一次阐明来自嗜冷菌的01(淀粉酶的三维晶体机构以 来，科学家们已经先后对Ca-Zn金属蛋白水解酶【301、磷酸丙酮酸异构酣311、柠 檬酸合成酣321、以及苹果酸脱氢酶‘331进行了晶体机构分析，这些酶均 是由来自南 极的嗜冷菌所分泌的产物。目前，仅有少数低温酶的晶体结构已弄清楚，有关低 温酶适冷机制的研究主要通过比较低温酶与相应中温酶、嗜热酶的一级、二级结 三维结构表明，与来自嗜中温性的微生物的构以及建立计算机模型来进行。 分泌 酶不同。除此以外，嗜冷菌中蛋白质是以单体和多聚物的形式存在的，如嗜冷菌 Vibrio sp(的异柠檬酸脱氢酶，其单体形式比二聚体形式对热敏感，当温度超过 15。C其单体即迅速失活，当温度降低No。C是由恢复活性。低温酶能够广泛应用 就是因为他们在低温环境中的高催化活力和在中、高温度条件于生物工程， 下的 热不稳定性。 低温微生物的生理代谢过程及酶的合成、分泌是适冷性的，但大多数酶的催 化活力却在比菌株最适生长温度高许多的温度条件下达到最佳状态1341:南极嗜冷 (C，而细胞中EMP途径酵母Y18的最适、最高生长温度分别为10oC和18 和TCA 循环中的一些关键酶，包括果糖l，6(二磷酸醛缩酶、己糖激酶、柠檬酸合成酶、 9 前言 a(酮戊二酸脱氢酶及琥珀酸脱氢酶的最适反应温度为20"-'30。C[221;我们对来自 南、北极产酶低温细菌的研究显示，1株南极细菌的最适生长温度为20。C左右， 所产蛋白酶的最适反应温度为40(C【35】;1t$北极细菌的最适生长温度为 15。C，35 。C时即不能生长，但所产纤维素酶、淀粉酶及琼脂水解酶的最适反应温度为35。C， 蛋白酶的最适反应温度为40oC。这些研究表明，酶的分子适冷进化过程并不是 与菌株生长或代谢的适冷进化过程同步的。 目前国外已报道的嗜压细菌 包括极端嗜压细菌 主要分布于科尔韦尔氏菌 【201、 应研究通常使用嗜压菌而不是只能在高压下生长的极端嗜压菌，包括已基本完成 DSSl2 全基因组测序的Photobacterium profundum 未发表 。目前为止，对嗜压细菌研究比较多的是压力调控基因对细菌嗜压， profundum 基因受ToxR,S蛋白控制，ToxR,S蛋白能准确地感受到外届环境压力的变化【2ll。 长繁殖起到了重要作用。研究发现大部分的嗜压细菌中都存在长链多聚不饱和脂 肪酸 PUFAs ，这些PUFAs对嗜压细菌在低温高压环境时维持细胞膜的流动性 有重要作用[40l。但也有科学家认为在嗜压菌对深海环境的适应机制中，单不饱 和脂肪酸比多不饱和脂肪酸更重要【351。而日本海洋研究中心对中度嗜压菌 ShewanellavioleceaDSl 12的研究发现，Shewanellaviolecea似乎存在与SS9不太 一样的嗜压机制。RNA聚合酶在压力调节中起到了关键的作用【20】，对于其组成 violacea 因子，Si舯a因子在压力调节的过程中所起的作用最大【4?。在Shewallena DSSl2中一个压力调控基因簇被克隆出来，该基因簇在不同的压力下有5个不同 的转录起始位点。在该基因簇的上游还发现了鼬蛆聚合酶054因子，054因子的 合成被其它多个基因如参与氮代谢的glnA操纵子所控制，而glnA操纵子的转录也 是受压力调控的【4l】。上述结果说明，虽然054因子的表达不直接受压力条件控制， 但毫无疑问054因子起了重要的桥梁作用[42】。 lO violacea 第一个在砌ewallenaDSSl2中进行的压力变化对呼吸链影响的实验 发现膜附着d型细胞色素在500个大气压下得到高表达143】。d型细胞色素在其它微 生物女HMoritella【3刀中也有报道，但只是在严谨条件下，如低氧浓度或极低的质 子动能 pmf ，才能表达出来。 压力也是深海环境中最主要的外在环境因素之一，但由于深海嗜压菌在工程 技术和实验手段方面的难题，嗜压酶方向的研究起步较晚。Michels等报道深海 压时，酶的热稳定性提高2(7倍，酶催化反应速率提高四。从6500米深的海底沉积 sp(DSK25【45】产生的碱性丝氨酸蛋白酶活性在60MPa 物中分离到的Sporosarcina 下比在1个大气压提高了近1倍。而且升压可以提高深海细菌某些酶的产酶量。 已发现的嗜压细菌和古菌与非嗜压的海洋微生物在系统发生关系上非常密 切，表明对压力选择的应对可能不需要显著的微生物进化上新种系 Lineage 的发 堆【3】 o ―L 由于大洋深海底部的低温性，目前分离的嗜压微生物大多也是嗜冷的【3l。在 细胞膜分子机理水平，嗜压微生物对高压的适应类似于嗜冷微生物对低温的适 应，高压环境常常促使单聚和多聚不饱和脂肪酸合成的增加以调节细胞膜的组成 和流动性【31，所以把嗜压和耐冷结合起来研究深海微生物，更具有探究生 物适应 极端环境的意义。图l一1概括了在低温和高压下微生物在基因水平上的反 应系统。 ?l烈四岬„re?i鼬?洲? ?鲥儿m四嗨。互 fl?(川阳掣一_。 ?。 -1(深海细菌反应系统 图1 前言 tolow the of and deep-seamicro-organismtemperature Fig(1―1 responsesystem high pressure 1(2(4深海微生物极端酶的应用 应用低温微生物低温酶具有许多优势:在可防止微生物污染的0",20。C温度 范围内 此时同源的嗜温型酶不活泼 ，低温微生物具有高生长速率、高酶活力及 高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热冷却系统，因而在节 能方面有相当大的好处:经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而且低温 或适温处理不会影响产品的品质;在低温条件下，相对中温型酶而言，来自低温 微生物的酶反应所需的时间更短。低温微生物及其酶还可替代化学方法，将废水 污染物减小到最低程度。因而在生物修复、工业生产、医药等方面有广泛用途。 如蛋白酶M、脂肪酶H7】、纤维素酶【48】可以作为洗涤添加剂，在洗涤行业具有广 泛应用。低温酶在食品工业中有广泛的应用，如低温p(半乳糖苷酶【27】 可以在低温 条件下降低牛奶中乳糖的含量，而世界上有2,3的人由于缺乏B一半乳糖苷酶不能代 谢乳糖;在果汁工业中，低温果胶酶可以降低果汁的粘性，使终产品变得澄清; 低温蛋白酶有助于肉的嫩化;在面包工业中，低温淀粉酶、在肉食品工业中， 蛋 白酶、木糖酶可以减少生面发酵时间，提高面包质量;另外，低温酶还可以用在 奶酪，酿酒工业等方面。在环境生物治理方面，利用低温微生物来处理土壤和水 体中的污染物具有特别的优势。低温酶能在低温或中温下有效发挥催化作用，所 例如多元醇的低温降解已用于飞机跑道附以低温菌是生物治理的理想材料。 近污 染土壤的治理。 除了低温酶的生物工程应用以外，对低温酶的耐冷机制的研究也是一个热 点，它对于其它生物的基因工程改造具有重要的应用前景。 相信随着研究工作的深入开展，以及高通量筛选、蛋白分子定点诱变与定向 蛋白组学及微阵列等新的生物技术手段的运用，人们会对低温微生物进化、 及其 酶类的研究意义和应用价值有更深入的认识了解。 对嗜压菌的研究不仅对生命适应极端环境方面有重大理论意义，它也有非常 重要的应用价值。近期研究表明，适当的静压力可以增加酶的活性和稳定性，但 是当压力超过一定的范围时，酶的弱键被破坏，酶的三维构象解体，使酶丧失活 性。在高压条件下，底物的溶解度增加，溶剂的粘度降低，从而提高了物质的转 12 运速率和反应速度。此外，在高压下酶往往具有更高的特异性，因此有必要从嗜 压菌中分离嗜压酶，而深海嗜压菌正是嗜压酶的重要来源。日本在深海鱼类肠道 ，内发现的极端嗜压菌属于嗜压古细菌，80,以上的菌株可以生产EPA和DHA最 高产量可达36,和24,。已经有人通过基因重组，使这些菌有效生产DHA。另 外，嗜压菌还可以用于高压生物反应器。 深海嗜压菌及其耐压机制的研究为我们弄清黑暗、低温、营养物质匮乏及高 压的深海中生物的生存机制提供了良好的研究模式。嗜压菌不但能够有效地清理 海底的大量有机物残骸，同时也为人类开发高压下物质的生物转换酶等提供重要 的筛选资源。 1(3 WP3异柠檬酸裂合酶lCL的研究背景 1(3(1 WP3的研究背景 rDNA 序列 WP2和WP3，均分离自(1914m的西太平洋暖池区位点wp0。16S benthica 比较表明WP3与已知菌株ShewanellaDB6101有最高的同源性 97, 。 6S 将WP2和WP3以及其他部分常见希瓦氏菌属的1rDNA序列进行遗传距离计 算，并根据遗传距离得到系统发育树，以确定这两株菌在该菌属中的位置 图 】??2 。 前言 0(05 I((((((((((((((((((((((((((((((J Shewanella 1 group Shewanella 2 group ]lIIllIflI 一]]IIl_] 图1-2(WP2和WP3以及其它希瓦氏菌的系统进化树 引自王鹏等 tree andWP3 ofWP2 Fig(1-2phylogenetic 系统发育树采用邻接法构建:细菌的16SrDNA克隆子命名为wp:分支上的 数值代表经1000 次计算后的置信度值:比例标尺代表核苷酸5,的置换概率 Kato等 2001 1201将希瓦氏菌属分为两个亚群:Shewanella groupl Shewanella group2。Shewanellagroupl的菌株嗜冷,耐冷，能产生大量的 EPA，耐 压，比如从南大西洋中分离到的Shewanellabenthica，从5110m的琉球海 峡分离到 的Shewanellaviolacea;Shewanella group2的菌株一般是中温菌，不产或者产生很 少EPA，对压力敏感。图1(2表明聊2和WP3属于Shewanellagroupl，有可能是嗜 压茵。 希瓦氏菌属中的嗜压菌都有两个压力调节操纵子，ORFl，2 包含两个开放阅 读匡1和2 和ORF3，已经被用来做为在深海中检测希瓦氏菌是否嗜压的分子标 的特异条带。将PCR所得到的特异条带，克隆到pMD一18T载体中，转化测序。 将所得的序列转化成氨基酸序列后在数据库中对比分析。WP2与WP3的ORFl，2 14 前言 和WP3的ORF1，2和ORF3与已知的Shewanellabenthica和 Shewanellaviolacea 的两个压力操纵子的同源性很高，分别是77,(90,和89,(94,。这个 结果为 WP2和WP3是嗜压菌提供了又一佐证。 此外，还在不同压力下培养WP2，WP3，E(c01i，在荧光显微镜观察得 以下 图片。 36hOUr 30mpa 50mpa 70mpa vep2 O(D(600 O(126 No grovvth wp3 O(425 O(235 O(207 E(coli No grovvth 0(D(600 0(562 72hOUr 30mpa 50mpa 70mpa wp2 O(D(600 0(175 0(264 0(003 No growth wp3 o(D(600 0(418 0(304 O(302 0(001 No growth o(D(600 0(437 图卜3(不同压力条件下WP2，WP3，E(c01i的生长情况荧光显微镜图片 引 自 曾湘等 前言 different ofWP2，WP3，E(co,,under Figl-3(CellMorphology hydrostaticpressure 从图1(3可以看出，在36小时或72小时高压培养时，WP3表现为耐压特性， 因为在30MP生长正常，而在50MP时可以缓慢生长，但其细胞分裂均受到一定 程度的影响，细胞形态为细长的丝状，而在70MP时则停止生长。 定义，WP3是一株典型的耐冷菌 Psychrotrophs [491。 1(3(2异柠檬酸裂合酶ICL的研究概况 1(3(2(1异柠檬酸裂合酶ICL的分布和生理意义 异柠檬酸裂解酶 isocitrate lyase，ICL 是许多以乙酸盐和脂肪酸为碳源的 微生物进行乙醛酸循环的关键限速酶【501，它位于异柠檬酸的下游 图1-4b ，催 化异柠檬酸产生琥珀酸和乙醛酸，改变碳源的流向，使其进入乙醛酸循环，以绕 过三羧酸循环中的两个脱碳酸基本步骤，生成草酰乙酸和琥珀酸。前者可利 用糖 质异生途径形成葡萄糖并进一步生