新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NF—κB的表达及意义

新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NF—κB的表达及意义 新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NF—κ B的表达及意义 滨州医学院20o9年8月第32卷第4期BMUJournal,Aug.2Oo9,V01.32,No.4?269? 新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NF—KB的表达及意义 张定荣张海鸿车芬芳徐珍. 1即墨市人民医院儿科266200;2滨州医学院附属医院儿科;3青岛市市立医院儿科 【摘要】目的观察新生鼠窒息后缺氧,缺血.再灌注损伤不同时间脑组织NF-KB动 态变化,以探讨NF—KB信号途径在新生 儿窒息脑损伤中的作用.方法出生7d新生鼠随机分为对照组(A组)和窒息组(B组); 制备新生鼠窒息模型,并于窒息后 1,3,5和7d取脑组织行石蜡切片.采用免疫组织化学方法检测窒息新生鼠脑组织 NF-KBp65活性表达水平,用苏木精一伊红 染色观察窒息后脑组织形态学变化.结果B组脑组织NF—KB的表达较A组显着 增强(P<0.05),以5d时升高最明显;并 伴有神经细胞坏死及凋亡现象.结论NF.KB可能通过炎症反应机制介导窒息脑损 伤过程. 【关键词】NF.KB;窒息;新生鼠;缺氧缺血再灌注损伤;脑组织 【中图分类号】R363【文献标识码】A【文章编号】1001-9510(2009)04-0269-03 TheexpressionandsignificanceofNF-Kbinhypoxiaischemiareperfusionbraininjuryofne wbornratswithasphyxia ZHANGDingrongZHANGHaihong2CHEFenfangetal 1DepartmentofPediatrics,People~HospitalofJimo266200;2DepartmentofPediatrics,Aff iliatedHospitalof BinzhouMedicalUniversity 【Abstract】ObjectiveToobservetheactivationofNF— KBinhypoxiaischemiareperfusionbraininjuryofnewbornratswithasphyx- ia.TheaimofstudyistoexploretheeffectofNF— KBsignalpathwayonbraininjuryofnewbornwit}lasphyxia.80astoprovidetheex- perimentalbaseforfindingclinicaltreatmentofasphyxia,inwhichNF— KBistakenasthetarget.Methodsnewbornrats(7daysold) wererandomlydividedintocontrolgroup(A1andasphyxiagroup(B).Themodelofasphyxia WasinducedinBgroup.Immunohisto- chemicalmethodWasusedtodetecttheactivityofNF— KBP65inthebrainofthenewbornrats.andhematoxylin—eosinstainingWasper- formedtoobservethehistologicalevidenceofasphyxiainthebrain.ResultsTheactivityofNF ?KBP65WashigheringroupBthan thatingroupA(P<0.05),increasedtothehighestpeakat5d.withnervecelldeathandapopto sisingroupB.ConclusionTheNF— KB.mayplayanimportantroleinbraininjurywitllasphyxia. 【Keywords】NF-KB.asphyxia.newbornrats,hypoxiaischemiareperfusion,braintissue 脑组织中的NF—KB能被许多因素激活,其中包 括窒息后脑组织缺氧一缺血一再灌注损伤.近年来的 研究发现NF-KB还存在于脑血管内皮细胞,神经细 胞和胶质细胞中,在调节炎症反应的基因中起关键 作用,与脑缺血及再灌注损伤时的炎症机制密切相 关HJ.本实验建立新生鼠窒息动物模型,旨在探讨 NF—KB信号途径在新生鼠窒息中的作用,为进一步 治疗新生儿窒息提供新的思路. 1材料与方法 1.1实验动物及分组七日龄Wistar大鼠25只, 由青岛市市立医院动物中心提供,雌雄不限,体重 12—20g.按同窝随机分成两组:对照组5只(A 组),窒息组(B组)20只,窒息组又分为4个亚组 (Ba,Bb,Bc,Bd),即分别于窒息后1,3,5和7d处死 动物,每个时相点各5只.各组间体重无显着性差 异(P>0.05). 1.2动物模型的建立?窒息动物模型:为更接近 新生儿窒息病理过程(缺氧一缺血一再灌注损伤),根 据新生鼠常压窒息模型J,将实验动物分别置于容 积为55IIll的缺氧瓶(即磨口瓶,保证密闭性)中,内 装0.0O5kg钠石灰,待动物安静后,塞紧瓶塞,密闭 30min后,立即氧罩吸氧2h(氧浓度50%,6o%), 之后放回笼中,仍由母鼠哺乳喂养.?对照组动物 模型:模拟上述过程不塞紧瓶塞,仍由母鼠哺乳喂 养. 1.3方法 1.3.1标本采集:分别于窒息后1,3,5和7d迅速 横断各组新生鼠脊髓,在冰盘上快速取全脑组织,以 冰生理盐水清洗至无血迹,切取含有海马组织的脑 片,所有标本均经10%的中性福尔马林固定,经58 , 60?石蜡包埋后,连续切片2张,厚度为4m,烤 片30min,供免疫组化和病理检查用. 1.3.2新生鼠脑组织NF—KBp65蛋白活性检测:采 用免疫组化法,标本测定一次完成.测定步骤:?组 ? 270?滨州医学院2009年8月第32卷第4期BMUJourna1.Aug.2OO9.Vo1.32.No.4 织切片;?3%HO去离子水孵育;?蒸馏水冲洗; (0%火力微波修复;?PBs洗3次;?滴加正常山 羊血清封闭液;?滴加适当稀释的一抗;?PBs振洗 3次;?滴加生物素化二抗工作液;?PBS振洗3 次;?滴加三抗S-A/HRP;?PBS振洗3次;?DAB 显色;?苏木素复染细胞核;?梯度酒精脱水,中性 树胶封片.免疫组化同时加作阴性对照片(PBS代 替一抗). 1.3.3脑组织形态学检查:苏木精一伊红(HE)染色 用于观察脑组织形态学改变,脑细胞损伤情况,帮助 判断坏死和凋亡细胞., 1.4统计学处理所得数据以均数?标准差(? s)表示,采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理, 进行多因素方差分析,两组间比较用t检验,P< 0.05差异有统计学意义. 2结果 2.1NF—KBp65结果判断阳性细胞为细胞核染 成棕黄色或有棕黄色颗粒沉积,定位于细胞核和细 胞浆.由二位病理医生按双盲法对免疫组化结果进 行评估,即在高倍镜下(×200)随机观察10个视 野,计数1000个细胞中的阳性细胞数,计算出阳性 细胞百分率,免疫组化染色图片见图1,2. 2.2脑组织病理学判断参照图谱…,?正常神 经细胞结构:锥体细胞呈椭圆型,核染色质疏松,核 仁清楚;?神经细胞损伤:胞体缩小,呈三角形或长 条形,胞核固缩深染,核仁消失,细胞与周围间隙增 宽. 2.3神经症状评分从缺氧开始观察24h,观察异 常神经症状并进行评分.评分标准J:竖毛震颤, 运动减少各计1分;瘫痪,旋转,抽搐各计3分;昏迷 图1A组新生鼠脑组织NF-KBp65 免疫组化染色(×200) 计6分.结果见表1.A组无神经系统症状,而B 组出现明显神经系统症状(P<0.05),B组各亚组 与A组相比均有显着性差异(P<0.05),以Bb及 Bc组最显着,Bd组趋于稳定,随时间延长,在一定 时间后神经症状可能逐渐好转,但未作进一步观察. 表1各组异常神经症状评分(?s.n=25) 2.4病理检查A组:外观及病理检查均正常.B 组:肉眼观察脑表面苍白,切面上可见水肿,偶见点 状出血.HE染色光镜下见各亚组不同程度组织形 态学改变,见炎细胞浸润,细胞水肿,变性,及坏死现 象;细胞皱缩,细胞核固缩,胞浆疏松,结构不清等凋 亡改变. 2.5脑组织NF—KBp65蛋白活性表达(见表2)A 组:活性表达为6.00?1.58.B组:各时相点与对照 组比较活性均有增加(P<0.05),见表2.实验1d 即增高,实验第5天升高最明显,为A组的5,6倍, 7d已开始降低;不同时间点之间除3d组和5d组 之间无统计学意义外,其他各时相点之间均有显着 性差异(P<0.05). 表2A组与B组NF—KBp6S阳性细胞比较(?s) 图2B组新生鼠脑组织NF-KBp6S 免疫组化染色(细胞着色较A组明显增多)(X200) 2.6脑组织NF-KBp65蛋白活性表达与病理改变之间的关系NF—KBp65蛋白活 性与病理改变不一 滨州医学院2oo9年8月第32卷第4期BMUJournal,Aug.2Oo9,V01.32,No.4 致,NF-KBp65蛋白活性在Ba,Bb,Bc呈逐渐增加, Ba,Bb组细胞坏死现象明显,Bc,Bd组细胞凋亡现 象逐渐明显.Bd组NF—KBp65蛋白活性已开始下 降,神经细胞凋亡现象也趋于稳定. 3讨论 核因子-KB(nuclearfactorkappaB,NF—KB)是一 种重要的转录因子,存在于真核细胞中,具有广泛的 生物活性,激活后可促进许多细胞因子,黏附分子等 基因的转录,在机体的免疫应答,炎症反应和细胞的 生长发育等方面发挥着重要作用J.在窒息所造 成的缺氧,缺血过程中,恢复血流可避免细胞死亡和 组织损伤,但在长时间严重缺氧,缺血基础上,恢复 血流会引起更剧烈的损伤,即再灌注损伤.本研究 表明,新生鼠窒息30min,复氧1,3,5和7d四个时 相点,NF—KB的活性均明显增高,说明在窒息新生鼠 脑组织存在NF—s:B激活.Stephenson等用凝胶电 泳迁移分析试验发现脑缺血再灌注0.5h后NF.KB 的活性即明显升高,6h达到高峰,24h降到1h的 水平.本实验表明NF—KB在窒息复氧后1d即明显 升高,5d时达高峰,以后逐渐下降,但7d时仍明显 高于对照组.造成两者试验结果有差异的原因可能 与动物模型不同,缺氧缺血时间不同,引起的缺血程 度以及再灌注时间与程度不同有关.本研究发现 NF—KB与神经细胞损害病理改变密切相关,随着 NF—KB的升高神经细胞损害,坏死及凋亡现象明显, 早期以细胞坏死为主,后期则已调亡为主.7d时 NF—s:B开始下降,病理改变也趋于稳定好转.说明 NF—KB参与了这一病理损害过程,NF—KB的激活可 能对病理改变的控制和恢复有促进作用. NF—s:B在神经系统中广泛表达,细胞受到外界 刺激,如:炎症,创伤,缺血再灌注等损伤后NF.KB 激活,在脑缺血再灌注损伤中NF—KB可被许多因子 激活,包括炎症细胞因子TNF-仅,IL-1,氧自由基和 细胞内钙增加等J. 本试验窒息新生鼠海马区凋亡增加,且伴 随着NF.KB活化表达的增高,提示窒息后NF.KB的 ? 27l? 激活与细胞凋亡有关.Schneider等为了研究NF— KB在神经元死亡中的作用,观察了啮齿动物卒中模 型的NF.KB的活性,发现在缺血半球NF—KB被激活 的p50敲除鼠,缺血损害显着减轻.缺血缺氧后神 经细胞的死亡主要分为早期的坏死和继发性细胞凋 亡,本研究Ba,Bb组以坏死为主,Bc,Bd组以调亡 为主也证明了这一点.NF-KB的活化对阻止细胞凋 亡,改善病理变化的有力的炎性机制反应.缺血缺 氧损伤后机体通过抗损伤机制在一定程度上诱导 NF—KB的活化来对抗损伤,随着损伤的稳定好转 NF-KB也由于刺激减弱而活性降低. 新生儿窒息可导致新生儿脑缺氧缺血损伤,病 死率和后遗症率高,是新生儿期造成伤残儿童的主 要原因之一.据此推测NF-KB的活化与新生儿窒 息后脑损害相关,NF.KB的活性可能对避免或减轻 窒息后脑损害有治疗作用. 参考文献 [1]NolanB,ColletteH,Bakers,以.Inhibitionofneutrophilapoptosis after~VCDgtraumaisNFkappabetadependent[J].JTrauma,2000, 48(4):599-604. [2]董文斌,冉隆瑞,冯志强,等.生脉注射液对窒息后脑损伤保护作 用的研究[J].中华儿童保健杂志,1998,6(1):32-34. [3]BarnesPJ,KarinM.NuclearfactorNF?KBpivotaltranscriptionfactor inchronicinflammatorydisease[J].NEnglJMed,1997,17:3I9. [4]SeegersH,GrillonE,TrioullierY,eta/.NuclearfactorkappaBac— tivationinpermanentintraluminalfocalcerebralischemia[J].Cere BloodFlowMetab,2000,20(3):592-594. [5]StephensonD,YinT,SnmlatigEB,eta1.TranacriptionfactorNucle? at,FactorkappaBisactivatedinneuronsafterfocalce~bralische- mia[J].CereBloodflowMetab,2000,20(3):592-603. [6]Rrol1.『E,HowardEF,HessDC,a/.Nuclearfactor-gbactivation duringcerebralreperfusioneffertofattenuationwitIIN-acetylcysteine treatment[J].BrainResMolBrainRes,1998,56(1-2):186.191. [7]SchneiderA,Martin—VillalbaA.NF—kappaBisactivatedandpro- motescelldeathincembralischemia[J].NatMed,1999,5(5): 554-559. (收稿日期:2009-04-20)