蚕沙中叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定

蚕沙中叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定 蚕沙中叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定 一、前言: 蚕沙(又称蚕粪)是我国丰富的农副产品资源叶绿素是一种天然色素，在医药、食品及日用品工业中有广泛用途。可广泛用于果酒、汽水、日用品、食品等生产行业(在医药上用来治疗传染性肝炎、胃、十二指肠溃疡和灼伤等。以往，提取叶绿素都是以某些植物的鲜叶为原料。后来发现，蚕沙中叶绿素含量是鲜叶中的数十倍，用蚕沙做提取叶绿素的原料，除了来源广、简易、收率高、成本低廉外，残余的蚕沙还可再综合利用，从中提取果胶等其他有用成分，所以我们对叶绿素铜钠盐制备进行系统的研究。 二、实验目的: 1.从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率。 2.初步研究叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件。 3.叶绿素铜钠产品的纯度并计算其产率。 4.利用光谱技术对合成的叶绿素铜钠进行初步表征。 三、实验原理: 叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的叶和绿色的茎中，是植物进行光合作用所必须的催化剂。由于天然叶绿素遇热、光、酸、碱等易分解，(在110度下会分解，)且不溶于水，难溶于甲醇，可溶于石油醚、易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的酯性溶剂，使其应用受到了限制，故把提取的叶绿素制成叶绿素铜钠使其稳定性、溶解性大大提高。叶绿素铜钠具有色泽亮丽、性能稳定、使用安全等特点，且具有一定的营养价值和保健功能，是一种比叶绿素更为理想的天然色素，可广泛用于果酒、汽水、日用品、食品等生产行业(在医药上用来治疗传染性肝炎、胃、十二指肠溃疡和灼伤等。在我国叶绿素及其衍生物的制取主要以蚕沙为原料且资源丰富，所以我们对叶绿素铜钠盐制备工艺进行系统的研究。 叶绿素含有叶绿素a和叶绿素b分子式如下: 1 叶绿素铜钠是叶绿素铜钠a和b的混合物，分子式分别为:C34H30O5N4CuNa2 C34H28O6N4CuNa2 相对分子量:684.17 698.15 。有吸湿性，易燃易爆，溶于水，水溶液呈蓝绿色，透明无沉淀，微溶于乙醇和氯仿，不溶于乙醚和石油醚，水溶液加钙盐析出。 1.叶绿素的提取 蚕沙中富含叶绿素。利用叶绿素不溶于水，用95%乙醇提取其中的叶绿素。 2.叶绿素铜钠的合成 叶绿素分子核中的镁原子和四个吡咯环上的氮原子相结合。环上是双羧酸的酯，一个被甲基所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可发生皂化反应生成钠盐。 ,55,72,5,4,, + 2,,,, = ,34,30,5,4,,,,2 + ,,3,, + ,20,39,, ,55,70,6,4,, + 2,,,, = ,34,28,6,4,,,,2 + ,,3,, + ,20,39,, 在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸。 ,34,30,5,4,,,,2 + 4,+ = ,34,34,5,4 + ,,2+ + 2,,+ ,34,28,6,4,,,,2 + 4,+ = ,34,32,6,4 + ,,2+ + 2,,+ 叶要素酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应，即生成叶绿素铜钠盐。 ,34,34,5,4+,,2+ = ,34,32,5,4,,+ 2,+ ,34,32,6,4+,,2+ = ,34,30,6,4,,+ 2,+ ,34,32,5,4,, + 2,,,, = ,34,30,5,4C,,,2 + 2,2, ,34,30,6,4,, + 2,,,, = ,34,28,6,4C,,,2 + 2, 叶绿素分子中的镁可被铜置换出来，将叶绿素经皂化除去环外的酯基，并将 中心离子镁用铜取代制成叶绿素铜钠，稳定性显著提高。 3.叶绿素铜钠质量分析 白光通过棱镜或衍射光栅的色散，形成不同波长的单色光。一束单色光通过 有色溶液中溶质能吸收其中的部分光。物质对光的吸收是有选择性的，一种物质 对不同波长的吸收程度不同。用透光度或吸光度表示物质对光的吸收程度。同一种物质不同的浓度其吸光度也是不同的，因此通过测定溶液的吸光度，做出该溶液的工作曲线，在一定波长下，测该溶液的吸光度可知其浓度;反之，可知吸光度。 用叶绿素铜钠盐配制的液体最大吸收峰为405nm与630nm处, 吸光比A405nm/A630nm 为 3.2,4.0为宜,4,。 叶绿素铜钠盐的吸光比计算公式为: 吸光比= 2 AA 405nm630nm 4.反应条件选择 (1)提取剂的选择 根据原料的特性，选择能溶解叶绿素溶剂，在相同条件下进行萃取比较试验。在室温下，用不同的提取剂，分别浸提4 h，然后测定各自吸光度。结果见表1。 由表1可知，不同的溶剂提取效果不同，其大小顺序为:95, 乙醇>无水乙醇>乙醚>甲醇>80,乙醇>70,乙醇>丙酮>乙烷。现选用95,乙醇作为提取剂。 (2)提取剂用量的测定 其他条件不变，改变蚕沙与提取剂的用量比，实验结果见表2。 由表2可以看出，蚕沙与提取剂的用量比(g,m1)为1:10较好。 (3)浸提时间的选择 在室温下，取一定量的样品，用95,乙醇分别浸提不同时间，结果见表3。 由表3可以看出，静止浸提到10h时，仍成上升趋势。 (4) 萃取条件优选 从菲一爱公式G= 一Ko(T,q) ?F?(AC,L)?t推理，扩散速率与时间、温度成正比，但由于叶绿素具有热敏性，温度过高和时间过长将影响溶液质量、萃取率和设备的生产率。为寻找适宜的工艺条件，采用正交试验组合表，对萃取时间、温度和料液比的各因次进行正交试验，结果见表4 。 3 由表中可以看出，由极差分析可知，对提取率的影响因素A>C>B，其最佳提取条件为A3C1B2(即萃取温度为60? ，萃取时间为4 h，料液比为1:8。 (5)皂化反应条件选择 随着反应温度的升高，皂化物生成量也增多，从节能和叶绿素不稳定性等综合因素考虑，采用70摄氏度回流加热。由于NaOH是皂化反应的反应物，因此，碱量是影响皂化的重要因素，所以在温度一定的情况下，考察加碱量和反应时间对皂化结果的影响，皂化效果通过加入汽油、振荡萃取后观察汽油层的颜色来判断，如果呈绿色，表示皂化不完全，呈黄色表示皂化完全实验结果表明(见表5)，在回流的条件下，影响皂化效果的主要因素是加碱量，控制在pH=11左右，皂化30 min即可皂化完全。 (6) 铜化反应条件的选择 在洗涤过的皂化液中，其它条件不变，改变铜代反应的硫酸铜溶液用量，实验结果见表6。 由表6可以看出，铜代反应中，皂化液与硫酸铜溶液的用量比为5:1 综上所述，蚕沙以95, 乙醇为提取剂，物料比1:8，温度为60? ，浸提4 h;两次;皂化时将溶液调至pH为11左右，回流皂化30min铜代反应中，皂化液与硫酸铜溶液的用量比为5:1的工艺条件下制备叶绿素铜钠盐产量较高、质量较好。由于叶绿素对光、热的不稳定性(萃取时的温度控制非常关键，应严格控制在80? 以下，否则易破坏其结构。 四、 实验仪器及材料 1.仪器: 4 (1)叶绿素铜钠合成:粉碎机 电子天平 烧杯(250ml、100ml、1000ml若干) 电热套 温度计 酸度计 搅拌器装置 恒温装置 回流冷凝管 旋转蒸发器一台 500ml三口烧瓶 500ml圆底烧瓶 抽滤瓶及布氏漏斗 减压蒸馏装置 pH试纸 量筒(100ml、10ml) 滤纸 分液漏斗 玻璃棒 滴管 容量瓶 烘箱 沸石 (2)叶绿素铜钠的质量分析:721分光光度计 分析天平 吸耳球 玻璃棒 滴管 容量瓶(10ml、100mL 、250mL 若干) 10mL、2mL移液管 10mL、50mL量筒 2.试剂: (1)叶绿素铜钠合成:干蚕沙50g 95%工业酒精 固体NaOH 去离子水 石油醚 5%NaOH-乙醇溶液 (适量) 1:1盐酸 CuSO4 丙酮 (2)叶绿素铜钠的质量分析:磷酸盐缓冲液(pH7.5，磷酸二氢钠容液和磷酸氢二钠溶液的混合液) 蒸馏水 五、实验步骤: 蚕沙?浸取?过滤?浓缩?皂化?萃取?调酸?铜代?调酸?过滤?成盐?洗涤、干燥?产品 1.蚕沙的浸泡及溶剂的回收: 称取(干燥)蚕沙50g于三口烧瓶中,用20ml水边加边翻动，使其混合均匀。 加入150ml95%乙醇溶液搅拌回流3小时后取出过滤分离得墨绿色溶液转到500ml 烧瓶中，虑渣重复浸提1小时。合并萃取液，置于圆底烧瓶中在旋转蒸发器上蒸馏回收酒精，设置温度为60度左右.回收的酒精可循环利用,当蒸出酒精速度很慢时停止蒸馏。 2.皂化、铜代与成盐: (1) 皂化 将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用10%NaOH-C2H5OH(称取 5gNaOH溶解在45g乙醇溶液中)调节使其pH等于11，用水浴加热在60?下皂化回流1小时以达到皂化完全。 (2) 铜代 将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质 (黄色)静置分层，下层为可溶性叶绿酸盐(绿色)，取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚，平行萃取3次。将除杂后的叶绿酸盐用浓盐酸调PH=7，加入10ml 10%的硫酸铜溶液(称取1g无水CuSO4用9ml水溶解)，用HCl调PH到2—3，在60?保温并保持搅拌1小时,趁热过滤。滤渣用95%乙醇洗涤3次后抽干。合并滤液和洗液，加入2到3倍的蒸馏水，静置4小时。有叶绿素铜酸析出，后用布氏漏斗抽干，滤渣用30%,40%的乙醇洗涤2,3次。 (3)成盐 洗涤结束后滤干，滤饼用3,5ml丙酮溶液溶解，加入95%乙醇 溶液稀释到30ml，边搅拌边加入5%NaOH-乙醇溶液调节pH为11，静置30 min，成盐(用滤纸法检验成盐情况:用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐)，过滤，滤饼用无水乙醇洗涤2次，再在60?下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品(略有胺味)。 3.纯度分析: (1) PH 称取0.050g叶绿素铜钠溶于蒸馏水配制成1%溶液，用酸度计测其PH值。 (2) 标准叶绿素铜钠盐的标准曲线 称取标准样品0.01克(精确至0.0002克)，加水溶解，移入10 mL容量瓶 5 中，加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀， 即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟后用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定吸光值(A)，以缓冲液作空白对照。类似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟 吸光比= AA405nm630nm 6 六、实验结果 七、实验数据处理 叶绿素铜钠项目和指标: 目 7 1. (1)标准叶绿素铜钠盐的标准曲线的测定数据和标准曲线，分别如附表1、图1所示。 (2)标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线的测定数据和吸收曲线，分别如附表2、图2所示。 (3)产品叶绿素铜钠盐的吸收曲线的测定数据和吸收曲线，分别如附表3、图3所示。 2.计算产率及产品纯度分析: (1)浓度为1%的标准溶液的PH值为9.87 (2)计算产率 60?烘干(恒重)所得产品质量m=0.1492g， 又因实验用干蚕沙质量m=50.0g， 故产率w 0.1492 50.0 100%=0.298% (3) 纯度分析 由表3数据可知产品的0. 01%溶液的A415nm=0.473;由附录中的图1叶绿素铜钠盐的标准曲线图可以知: y=83460x+0.0987 其中y为吸光度A，x为叶绿素铜钠盐在溶液中的百分含量。 故当A415nm=0.473时，百分含量: x=(0.473-0.0987)/83460=0.00000448=0.000448%， 即在称取的样品叶绿素铜钠0.0104g中实际含有的铜钠盐质量为: m=0.00000448X100=0.000448 所以本次实验制备的产品纯度为η=0.000448/0.0104X100%=4.31% 3(给出A415nm和A660nm值;给出A415nm/A660nm值。 产品液: A415nm 0.473 A660nm 0.148 吸光比= A410nm/A660 nm =0.473/0.148=3.20 八、结果分析与讨论 本次实验在操作过程中出现了许多的问题，使得实验存在着人为的操作失误，也有偶然的误差，当然也存在系统误差，以上的种种误差使实验结果存在较大偏差，一方面表现为绘制出来的样品叶绿素铜钠盐吸收曲线最大吸收峰于理论值有偏差，另一方面表现为产品产率低、产品纯度不高。下面对上述出现的误差作一下详细的分析。比如旋转蒸发仪的正确使用，皂化过程中PH的控制。我们对实验的某些地方需要添加试剂的目的是什么也不是很清楚，最后经过组员的讨论和老师的指导下终于算是顺利的完成了。 1.本次实验产品产率低、纯度不高，可能是由于: (1)回流萃取的时间不足，浸提的时间不够，浸提不充分，皂化的时间和次数也不足，导致叶绿素提出量较少。 (2)在旋转蒸发器上蒸馏回收酒精时间不足，浓缩液中留有较多的乙醇，把 8 叶绿素溶解在其中，不利于后来对叶绿素的提取。 (3)皂化不够完全的影响:皂化前要用10%NaOH-乙醇溶液调溶液pH值为11，因为皂化反应只有在碱性条件下才能反应充分，并且应使用10%NaOH-乙醇溶液来调节，不要用10%NaOH水溶液来调，否则产率不高，因为叶绿素不溶于水，致使皂化不完全。实验中我们采用了10%NaOH-乙醇溶液进行调节，并且严格将PH控制在11左右，但实际PH调得11.05，与要求pH值有偏差，这也影响到叶绿素的提取效果。 (4)在实验整个实验的过程中洗涤、过滤和转移的次数较多，而叶绿素的生成物黏在盛装的容器上和滤纸上，难以转移完全，而且在洗涤中也有产品的被冲洗掉，这都使得叶绿素损失很多。这是实验的产率不高的主要原因。 (5)在实验中加入对各种试剂的量的控制不是很精确，调节的pH值也有偏差，使提取的叶绿素存在较多的杂质，纯度不高。 (6)在加入蒸馏水静置4h后进行过滤的步骤中，应加相当于滤液体积2,3倍的蒸馏水，但实际是操作时只加入了等量蒸馏水，导致析出的晶体不多，少量的小晶体不能合成大晶体，加上在过滤洗涤中的损失，最后得到的晶体量很少，并且纯度不高。 (7)实验一开始时用单口圆底烧瓶装液，发现不能实现回流萃取时，又改用三口圆底烧瓶反应，在转移过程中，出现了不必要的损失，类似的失误是考虑不周所致，完全可以避免。 2. 在叶绿素铜钠的合成的第一步中，提取剂可以用无水乙醇、丙酮试剂，但无水乙醇的提取效果最好，而且无水乙醇比较实惠，无毒，使用起来也比较安全。用水浴加热时，一定要控制好温度不能超过80度，否则叶绿素铜钠a和叶绿素铜钠 b会分解，造成产品的损失。实验中做这一步时由于是在电热套上加热，反应液在三口烧瓶中反应，使得反应的温度难以维持在一定值，进行多次提取的时候操作起来也比较麻烦，过程中损失较多。 3. 萃取前，应取一些皂化液验证是否皂化出了叶绿素，如果出现明显的分层现象，说明已皂化完全，就可以加入适量石油醚进行萃取。 4.进行实验时，有些试剂因为是共用的，在使用多次后，难免会引入杂质，使得药品受到污染，如蒸馏水中引入其他离子等，给实验结果带来误差。 5. 整个实验最重要的操作是叶绿素的浸提、皂化和铜代，如果这几步做得不好，即浸提、皂化不完全或铜代不完全，所得的产品就不纯或产率降低。我组所得的产品的颜色为墨绿色，并且略有金属光泽。较好的达到了实验理论的要求，在测其吸光度时，峰值于理论稍有偏差，波峰落在A415nm与A660nm两点上，峰值没有在405nm、630nm出现最大值的原因可能是由于我们测得速度比较慢，叶绿素对光和热都存在不稳定性，一部分叶绿素见光分解损失掉。并且其吸光比A415nm/A660nm为3.20，处于3.2,4.0范围内。 6.本实验测得的吸光度值相对标准的吸收曲线偏小，原因可能在于:(1)所制备的产品的纯度低;(2)产品没有完全烘干，实际用于配制的溶液的质量小于所需的质量。 7. 由图3产品叶绿素铜钠盐的吸收曲线与图2标准叶绿素铜钠相盐的吸收曲线对比可知，产品叶绿素铜钠盐的吸收曲线趋势基本上符合要求。 8. 本次实验所得产品的纯度为4.31%，可见产品含的杂质过多。原因在于我们在皂化过程中可能引入过量的NaOH, 并且在调酸铜代过程中也加入了过量的CuSO4从而引入杂质。 9 9. 叶绿素分子中的镁可被铜置换出来，将中心离子镁用铜取代制成叶绿素铜钠，稳定性显著提高，如果反应不完全则得到的叶绿素镁钠不稳定，容易与其他物质发生反应或见光分解，使产品产率降低。 九、 实验收获 此次实验是第一次自主性实验，虽然在此过程中参考了很多有关文献和资料，但通过本次实验我们学到了许多东西，比如学会书写一份完整的实验报告学，对实验的每一步都经过了考虑，对所使用的试剂、试剂配置方法及其用量都经过仔细的推敲。我们初步学会了和操作一个完整的实验，为我们以后独立做实验提供了经验。下面谈一下本次的实验收获: 1.由于是第一次做独立性实验，实验中有很多做得不好的地方，但还是学到了很多。我们在撰写实验报告时有些问题还是没考虑周全，对于一些可能出现的问题也没考虑到，比如一些试剂对实验造成的负面影响，对实验每一步反应的时间的把握也欠准确。在实验过程中，试剂的用量不足或过量都可能使整个实验结果偏差较大甚至失败。因此，我们在实验前应尽量通过多方面的获取关于本次实验的相关资料，准备充分，制定出一个完整合理可行的实验方案是整个实验的关键。 2.进行实验时，人为的操作对实验的好坏起到了非常重要的作用，如对各种仪器是否清洗到位，对其使用是否科学，对试剂的加入方法是否正确，对仪器的体积读数是否准确等都致使实验结果存在偏差。 3.本次实验做得还算顺利，但当中出现了很多问题，特别是实验刚开始的时候，对有些仪器没有接触过，事先也没有了解充分，一开始不会用，在老师的指导下进行使用。 4.试剂进行实验时，实验步骤与实验报告中还是改动了较多，经过老师的指导，有一些实验步骤有所省略。也没有把实验流程完全弄清楚，在试验中出现了很多疑问。由此使得实验不流畅，增加了实验的工作量，而且放慢的实验的进度。 5.本实验是一个摸索和学习的过程，实验中，我既吸收了教训，也总结了经验。通过本次实验，有了一种自主进行实验的意识，对各种仪器的使用有了进一步的了解和认识，对基本实验的操作有了更深一步的了解。另外，我学会了独立思考问题，勤于发现问题，解决问题，有了错误要积极找出原因的所在，及早改正，提高自己操作实验的综合能力。 十、附录 1.标准叶绿素铜钠盐标准曲线 标准曲线的测定方法:取标准样品配制0.1%叶绿素铜钠盐溶液，用移液管 10 分别精确量取2.5 mL;2.0mL;1.5mL;1.2mL;1.0mL;0.5mL移至5个加入100mL的容量瓶中，向其中各加入pH=7.5的Na2HPO4,NaH2PO4缓冲液，摇匀定容至刻度，即0.0025%;0.002%;0.0015%; 0.001%;0.0005%。以缓冲液作空白对照，分别测以上溶液在波长405nm下的吸光度值A405 。如表1。 2.叶绿素铜钠盐的吸收曲线 (1)标准样品: 取标准样品配制0.001%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在350nm-700nm波长处测定溶液吸光值A(每隔5nm或10nm测定一次)，以缓冲液作空白对照。测定数据如表2所示，吸收曲线如图2所示。 11 绘制标准样品的叶绿素铜钠吸收曲线 12 (2)产品: 取产品配制0.01%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A(每隔5nm或10nm测定一次)，以缓冲液作空白对照。测定数据如表3所示。 绘制样品的叶绿素铜钠吸收曲线 13 十一、参考文献: 1.于信令等.食品添加剂检验方法.第一版. 北京:中国轻工业出版社，1992.10 2.刘成梅等.天然产物有效成分的分离与应用.第一版. 北京:化学工业出版社， 2003.1 3.王清槟等. 食品着色及及其分析方法.第一版. 北京:化学工业出版社，2004.7 4.项斌等. 天然色素 .第一版. 北京: 化学工业出版社，2004.8 5.洪法水等. 应用化学 .第一版. 北京:化学工业出版社，2001.7 6.周家华等. 食品添加剂 .第2版. 北京:化学工业出版社，2008.4 7.段玉峰等. 综合训练与设计.第一版. 北京:科学出版社，2001.8 8.黄涛等. 有机化学实验.第二版. 北京: 高等教育出版社，1998.5 14