恶性行为在端粒酶阴性的致瘤性肾上腺皮质细胞中的渐进性消失及其

恶性行为在端粒酶阴性的致瘤性肾上腺皮质细胞中的渐进性消失及其 恶性行为在端粒酶阴性的致瘤性肾上腺皮质细胞中的 渐进性消失及其通过人端粒酶逆转录酶的恢复 课组 (江苏省人民医院) 复制衰老,危机被认为是一种肿瘤抑制机制。尽管最近的研究明，没有端粒酶，人的正常细胞是无法转变为肿瘤细胞的，但衰老最初作为肿瘤抑制机制的概念却是因为复制衰老,危机可以限制端粒酶阴性肿瘤细胞的生长。我们的研究显示，当表达原癌基因的人和牛的肾上腺皮质细胞通过组织重建技术被引入免疫缺陷小鼠体内后(不同于以往的皮下注射)，这一概念在此依然正确。编码,,,,,,,,,…和,,,,大,抗原的逆转录病毒转染人和牛的原代肾上腺皮质细胞后，通过组织重建技术种植于免疫缺陷小鼠体内。在这个模型中，转染细胞完全表现为恶性倾向，即具有侵袭性和转移性。在种植前及在肿瘤形成后，这些细胞的端粒酶活性均可忽略不计。当系列移植时，肿瘤表现出渐进性生长速度减慢、侵袭性和转移性降低、端粒缩短及危机的形态学特征。然而，端粒酶活性并不是细胞具有恶性行为的必要条件，端粒酶逆转录酶的表达可以使系列移植后已停止生长的肿瘤细胞重新获得致瘤性。还有，表达原癌基因的端粒酶阴性细胞只有在通过组织重建技术移植时才具有致瘤性;而当通过皮下注射时，则必须有端粒酶逆转录的表达才能形成肿瘤。在缺失端粒维持机制时，不管是否具有侵袭性和转移性，细胞最终都将进入增殖危机期。我们的研究工作为人们在体内环境研究危机机制及对肿瘤恶性行为的影响提供了一?鲂碌哪,汀?当一个正常细胞转变成肿瘤细胞时需经历多方面的改变。人们普遍认为，克服复制衰老屏障是肿瘤形成必不可少的条件。复制衰老最初被用来描述人的正常细胞在体外培养时的生长抑制现象“圳。绝大多数正常细胞的端粒酶活性不足以维持端粒的长度，端粒的持续缩短使其失活，从而导致细胞的生长停滞，称之为复制衰老或,,期睁”。此时，细胞如能表达检查点破坏蛋白(如,,,,大,抗原)，即能够越过,,期而最终进入危机期或,,期。在危机期，短的无功能的端粒首位相连使染色体相互融合，形成破坏一融合一桥循环，导致非整倍体的增加;同时，由于胞浆无法正常流动，因而出现四倍体、多极细胞分裂及染色体数的异常等一系列分裂危象(,,,,)。这种灾难性的分裂可形成多核细胞和巨核细胞(,,,,,)。处于危机期的细胞最后经历死亡，其确切机制尚不清楚;细胞凋亡中特征性的双链,,,断裂，在此处极少发生“川?”。绝大多数肿瘤细胞通过表达端粒酶逆转录酶(,,,,,)或端粒替代延长机制(,,,)来维持端粒长度，因而可以避免复制衰老,危机“？’,?。 复制衰老,危机作为肿瘤抑制机制可能有两种模式。在第一种模式中，不管端粒的长短，没有端粒酶活性或其它端粒维持机制的细胞即没有致瘤性;在第二种模式种，缺失端粒维持机制不能 ,,阻止细胞获得致瘤性，但端粒的缩短最终却能抑制细胞的增殖。人体细胞的研究数据绝大多数支持第一种可能。在原癌基因联合试验中，人们发现，,,,,,的活性是将正常人体细胞转变为肿瘤细胞的必要条件“一一”。然而，将,，,、,,,,,,和,,,,基因通过腺病毒联合导入正常细胞后，亦可使其具有致瘤性，此时并不需要,,,,,的参与，这一发现又支持了第二种可能“?。表达原癌基因的端粒酶阴性的小鼠细胞亦能形成肿瘤。在这种模式中，经过多次传代而端粒缩短的细胞虽然具有致瘤性，但却失去了转移能力;然而，作为复制衰老,危机的结果，肿瘤生长停滞并没有发生:尽管持续缺失端粒酶活性，端粒最后却能延长，肿瘤生长又得以恢复(,,),虽然人和鼠的端粒生物学特性存在很大差异，然而这些实验却部分反映了复制衰老,危机作为肿瘤抑制机制，在端 粒缩短时是如何限制肿瘤恶性特性的。 因为在几乎所有的原癌基因联合试验中，人体细胞获得致瘤性都必须有端粒酶的活性，因此无法观察由于端粒缩短而引起的肿瘤恶性程度的减少。这样，就缺泛通过天然缺失端粒维持机制的细胞来直接复制衰老,危机作为肿瘤抑制机制的实验模型。目前虽然已有通过抗端粒酶活性或诱导衰老对端粒酶阳性的肿瘤细胞进行抗肿瘤研究的实验报道(,,,,,,)然而这些细胞的端粒酶已被激活，同性无法回答复制衰老是如何阻止肿瘤的发展这一问题。可以推测，假如复制衰老是在肿瘤的早期阶段发挥作用，那么它就能在肿瘤细胞获得端粒酶活性及无限增殖能力之前而阻止肿瘤的生长。 这里我们利用人和牛的原代肾上腺皮质细胞通过组织重建模型对这一概念进行了研究(,,,,船)。我们通过两种重建了组织模型，一种方法是将细胞种植于肾脏的被膜下，另一种方法是将细胞皮下种植于胶原中，我们已通过这两种方法成功地重建了人的肾上腺皮质组织九瑚’。我们也对牛的肾上腺皮质细胞进行了比较广泛的研究。与人的细胞一样，牛的肾上腺皮质细胞中的端粒酶活性不足以维持端粒的长度，因此，这些细 ”。和人的细胞一样，在体外长期胞最后都将经历端粒缩短和复制衰老这一过程‘, 培养时，这些细胞都能够维持稳定的染色体组型，牛的体细胞经过多次传代以后能够形成克隆牛这一事实充分证明了这一点。然而，牛的肾上腺皮质细胞的端粒比人的长的多‘,”。因此，在细胞培养和肿瘤组织中，尽管缺失端粒酶活性，牛的肾上腺皮质细胞依然保持良好的增殖活性。 组织重建模型不同于传统的肿瘤分析方法(将细胞悬液通过皮下或肌内注射)，细胞存活率不会因为种植技术的好坏而受到严重影响。如果细胞存活率不高的话(在传统的分析方法中常出现这种情况)，提高细胞存活率的基因对于细胞获得致瘤性就显得是必需的了。组织重建模型也被用于人的染色体组型的实验性致瘤性研究伯”。我们首先将原癌基因导入细胞中，然后很快将此细胞种植于宿主动物体内，这种方法有点类似于角化细胞系统中的“多元系列基因转染”方法。在角化细胞皮肤重建模型中，肿瘤的形成并不需要,,,,,的参与，但角化细胞中的端粒酶活性足以维持端粒长度:肿瘤在动物体内的生长并没有显示端粒缩短的迹象，也没有证据表明肿瘤细胞进入复制衰老或危机期。然而，最近对肾上腺皮质细胞的研究表明，端粒酶阴性的细胞最终进入危机期，从而限制了其进一步的扩散、侵袭和转移。一、材料和方法 (一)人和牛肾上腺皮质细胞的培养 人的肾上腺取材于肾脏器官捐献者，肾上腺皮质细胞通过酶解消化和机械分散的方法获得锄’，原代细胞悬液保存于液氮中。冻存细胞解冻后接种于,,,,,;;,’,改良的,,,,,’,培养液:,,,’,,(,,(,:,)，,,,胎牛血清，,,,热灭活的马血清，,(，,,,,,重组成纤维细胞生长因子，,,(,,,),,,,,,,, ,(,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,;,)。培养皿包被有，型胶原(,,;,,,,,;,,,,,,，,,,,,,,, ,,,,,，,,)。培养气体为:,,,,,，,,,,，,,,,,。 牛肾上腺皮质细胞取材于两岁食用牛的肾上腺组织，与入的肾上腺皮质细胞同样处理，但接种于培养皿中。 (二)逆转录病毒转染 逆转录病毒为,,型?’，结构见表,。它们是通过将,,,,,,,,，(,, ,,,,;,,,;,, ,,,,,,;,，,,,,,,,,，,,)的,,,基因替换后而构建的。,,,,大,抗原(,,,)来自内含子少的;,,,。使用的,,,原癌基因为,,,,,,,,押。其中一个重组体包含内部核糖体进入位 点(，,,,)九。逆转录病毒质粒,,,,,,,,,,—,,,,,由,(,,,,,,,(,,,,,,;, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,,,,,,，,,)惠赠。,,,,,,,细胞用于包装逆转录病毒‘饕’，逆转录病毒质粒通过磷酸钙方法转导,,,,,,,细胞。,,,后，收集上清，用,(,,,,的滤器过滤后，加入到靶细胞中，转染过程可以持续,,,。逆转录病毒重组体编码绿色荧光蛋白，因此细胞转染效率可以通过荧光显微镜来观察。另外再培养,天以确保细胞中不再存在任何具有感染性的病毒体。 根据实验操作手册，含有转染细胞和未转染细胞的混合细胞可以直接用于接种动物，也可先制备纯的转染细胞，然后将其接种动物。纯的转染细胞可通过克隆有限稀释法或细胞分选方法获得。经过分选后，大于,,,的细胞可发出荧光。经过克隆化或分选的细胞需扩大化培养以用于种植和生化研究。在大多数情况下，细胞转染后不需进行药物选择，但有些细胞在转染,,,,,—,,,,—,,,,,后，需用,,,,,,的嘌呤霉素进行选择。 (三)逆转录病毒转染细胞的生化特征 用标准的,,,,,,, ,,,,,,,,方法分析逆转录病毒转染细胞的生化指标。,,,,,,(,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,，,,,,, ,,,,，,,)为鼠抗,,,, ,,,单克隆抗体:,,,,,,(,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,，,,)为鼠抗,,,单克隆抗体。细胞提取物中的端粒酶活性通过端粒重复扩增测定法(,,,,)进行测定汹’;端粒限制长度分析(,,,)如前所述进行饼’，但,,,片段是通过脉冲电泳进行分离的。 (四)将细胞接种于,,,,?‘、,;?一和,;,,小鼠 ‘,,,,?‘、,;?一和，,, ,;,,,、鼠均购自,,;,,,;(,,,,,,,,,,，,,)，鼠龄均大于,周，体重为,,,左右。将,×,,,肾上腺皮质细胞接种于肾脏被膜下‘,,棚’:同等数量的细胞通过皮下注射的方法种植于小鼠外耳部的皮下胶原中四’，在此部位种植有利于对组织或肿瘤生长及血管形成情况进行连续监测。 接种细胞后，在不同的时间段将小鼠处死。肿瘤通过,,,,,的荧光并结合低水平的白光进行观察，这样可同时观察发射荧光的肿瘤细胞和不发射荧光的组织器官。 (五)组织学和免疫组化分析 组织的固定、石蜡包埋及组织学检查按常规方法进行。,,,, ,,,利用,,,,,,(,,;,,,,,,;,,,;,，,,,,,,,,,，姒)单克隆抗体进行检测。用原位寡核苷酸连接(，,,,)检测试剂盒(,,,,,;,,，,,,,;,,,，,,)进行双链,,,断裂的凋亡检测。二、结果 (一)人和牛肾上腺皮质细胞导入,,,,,列和,,,, ,,,基因后的致瘤性转变 本研究中，我们使用了一种组织重建模型，该模型的肾上腺皮质组织是原代细胞种植到免疫缺陷小鼠体内后而形成的。如果种植技术能够保证种植的细胞有良好生存率的话，那么这种模型就能够使我们观察到使原代细胞转变为肿瘤细胞所需的最少遗传修饰。用编码,,,甜,,和,,,, ,,,基因的逆转录病毒转染人和牛肾上腺皮质细胞，(,,,(,，,,,,,,);,,,, ,,,重组体不含内含子，因此不编码小,抗原。同时编码两种基因的重组逆转录病毒通过一次感染就能够将两种基因导入到靶细胞中。感染细胞经过短时间的体外培养后，种植到免疫缺陷小鼠体内。我们推测，这对于入的肾上腺皮质细胞尤为重要，因为它在体外培养时，细胞数量可以增长,,,,,倍淄’;而牛的肾上腺皮质细胞可以增长,,,,,一,,,倍，这就 显得相对次要一些了淄’。 人和牛的肾上腺皮质细胞联合导,,,, ,,,”和,,,, ,,,基因后，均发生致瘸性转变。细胞种植后，发生大范围的侵袭和远处转移，说明转染细胞已完全转变为恶性细胞(,,,(,，,,,,,,)。细胞种植于肾脏被膜下与皮下胶原中所得的结果相似。绿色荧光蛋白的表达极大的方便了我们从总体上观察细胞生长情况及其恶性行为，如在宿主体内的侵袭和转移。人的细胞所产生的肿瘤体积小于牛的细胞，然而，人的细胞在肾脏中常表现出更强的侵袭性(,,,(,,)。没有经过基因修饰的人肾上腺皮质细胞在肾脏中有很清晰的边界(,,,(,,)，这与以前报道的相一致‘,”。牛肾上腺皮质细胞在种植部位产生比较大的瘤体，侵犯临近组织和器官(如肌肉、脂肪和胰岛)，并发生肺和其它器官的转移。牛肾上腺皮质细胞生长速度很快，在种植后,,,,,的时间内，肿瘤体积可达,(,;,。利 ,,用抗,,,, ,,,抗体通过免疫组化的方法可以证实牛肾上腺皮质细胞的转移。通过荧光可以观察到，人的肾上腺皮质细胞在一些小鼠体内有小的肺转移，但由于体积太小，无法通过组织学方法证实。 本研究显示，只表达,,,,,,。和,,,, ,,,的的细胞可以形成恶性肿瘤，而以前的研究表明，这种原癌基因的组合而没有,,,, ,和,,,,,的参与是不具有致瘤性的。因此，我们认为，肿瘤可能是由转染细胞中的少数细胞形成的，这些细胞在引入,,,,,,,和,,,, ,,,基因后或许又发生了另外的遗传改变。为了证实这一点，我们对转染细胞进行了有限稀释(,,,,,,)，结果发现，只有,,,个转染细胞可以形成肿瘤。逆转录病毒感染细胞,天后就被植入小鼠体内，细胞在这段时间内发生突变的可能性很小。因此，肿瘤的形成很可能是由于转染细胞中的少数细胞过度生长引起的，而不是细胞的整体扩增。 人肾上腺皮质细胞的端粒长度约为,,,,，而牛肾上腺皮质细胞的端粒要长的多，约,,,,，这也许是其具有更大复制潜能的原因(,,),这就使得有些实验只能用牛肾上腺皮质细胞去做，而不能用人的细胞。首先，我们能够用纯的经遗传修饰的细胞去接种动物，这些细胞是通过流式细胞分选或克隆有限稀释法而获得的。所有细胞在接种免疫缺陷小鼠后，均形成了肿瘤，且具有侵袭性和转移性(,,,,,,)。当细胞中只引入,,,,,列基因，细胞生长缓慢，与以前报道一致四，但,,的氧气和富含抗氧化剂的培养基可使细胞避免发生成熟前衰老“”。,,,,,,。和,,,, ,,,基因引入细胞的前后顺序，对实验结果没有影响，这两种情况下形成的肿瘤都有很强的侵袭性。 (二)肿瘤在动物体内的系列种植导致恶性特征的渐进性丢失 表达,,,,,,’和,,,, ,,,的人肾上腺皮质细胞在动物体内形成肿瘤后，将其肿瘤碎片重新种植于第二代动物体内，无论是皮下种植，还是肾脏被膜下种植，肿瘤都不再生长。如果肿瘤是由表达,,,,,硝,,,,, ,,,的牛肾上腺皮质细胞所形成的，则其中有许多可以在第二代或第三代宿主体内继续生长而形成肿瘤(,,,(,)。但是，并不是所有的肿瘤碎片都能够再生长而形成肿瘤。在我们所研究的,,个肿瘤中，有,个能够在第二代、,,,”在第三代宿主体内继续生长，而所有肿瘤均不能在第四代宿主体内生长，尽管有两个肿瘤可以在第四代宿主体内长到,;,大小，但很快就开始萎缩。皮下种植和肾脏被膜下种植的结果相似。考虑到第二代和第三代肿瘤的聚集性，我们对,,份肿瘤碎片进行了再种植，其中没有一个能产生可以持续种植的肿瘤(要么不生长，有的即使生长，但很快就萎缩)。 本研究中，我们观察到很多第二代和第三代肿瘤已不能迸一 步再种植。这些终端肿瘤需生长超过,,天才能达,,(,;,大小，在随后的,,天中，肿瘤不再增大。相反，第一代肿瘤持续长大，以致最后不得不处死动物。 第二代和第三代肿瘤生长速度的减慢伴随着恶性行为的丢失。第一代肿瘤。不管来源于肾脏还是皮下胶原，都广泛地侵犯邻近组织。图,,显示的是皮下胶原种植后所形成的第一代肿瘤的组 ,,织学情况。而来源于此肿瘤的第二代和第三代肿瘤对周围组织的侵袭性大为减弱(,,,,,、,,)，第三代肿瘤与相连组织之间由包膜隔开，且第二代和第三代肿瘤常表现为中心坏死。 肿瘤细胞的荧光可以检测到很小的转移。尽管我们在动物体内经常观察到第一代肿瘤的肺转移，而第二代和第三代肿瘤没有发现肺转移。 (三)肿瘤生长的终止伴随着危机期的出现 体外培养时，,,,, ,,,可以使细胞越过复制衰老期或,,期而进入,,期或危机期。我们推测，肿瘤生长的减慢和恶性特征的丢失是由于危机期的出现而引起的。然而，由表达,,,,,,”,,,,, ,,,的牛肾上腺皮质细胞所形成的第一代肿瘤，其细胞大小一致，亦没有明显的核形态学改变 (,,,(,,):在第二代和第三代肿瘤中，细胞和核均表现为明显的异质性(,,,(,,)。在第三代肿瘤中，大部分细胞出现核增大、不规则核、染色体分离异常及染色质浓缩的现象(,,,(,,)。尽管在第三代肿瘤中也可以观察到极少量的细胞正常分裂象，许多细胞的增殖标志物,,,,,,表现为阳性。在第一代和第二代肿瘤中可以观察到分裂桥(,,,(,,)，而在第三代肿瘤中则罕见。这些数据与以前的报道一致，第一代和第二代的肿瘤细胞在生长过程中逐步进入危机期(,,,,),在第三代肿瘤中，大量异常细胞的出现可以看作是危机期的征兆;这些细胞并不是增殖静止，而是无法完成正常的细胞分裂周期。 因人的细胞形成的肿瘤不能在第二代宿主体内生长，我们推测，人的细胞在第一代肿瘤中已进入危机期。在入的第一代肿瘤中，许多细胞的异常表现与牛的第三代肿瘤极为相似。在牛的第三代肿瘤中，尽管有中心坏死现象，但在这些区域之外，我们很少能够检测到细胞凋亡的特征性改变，即双链,,,的断裂‘,”。只有少于,,的细胞，,,,，，而绝大多数巨核或分裂异常的细胞表现为，,,,。。 (四),,,,,,’,,,,, ,,,转导细胞的端粒酶活性及端粒长度 ,,,,列,,,,, ,,,表达细胞所形成的肿瘤经系列移植后，其恶性程度渐进性减少，这似乎是肿瘤细胞进入危机期的结果。我们推测，那些不能维持端粒长度而发生端粒失活的细胞最后导致染色体的首尾相连和融合(分裂桥的出现可以证明这一点)，反过来，染色体的首尾相连和融合又引起细胞的灾难性分裂，表现为细胞核的形态异常和染色体的分离异常国‘,?。与此相一致的是，表达,,,,,斜,,,,, ,,,篚〕人和牛肾上腺皮质细胞中的端粒酶水平很低蚀’(,,,(,)。从牛的肿瘤中分离并经过分选的细胞同样检测不到端粒酶活性。本研究中，我们对各种不同的逆转录病毒重组体转染细胞进行了检测，在所有细胞中均检测不到端粒酶活性(,,,,,,)。因此，不同重组体转染细胞所形成的肿瘤在生长率、侵袭性和转移性的差异(,,,,,,)，不大可能是由于端粒酶活性的变化引起的。当,,,基因位于，,,,之后，在这种情况下，低水平的恶性特征可能是由于,,,表达水平较低引起的((,,,(,)。 ,, 因为不可能从牛的肿瘤中分选出足够的转染细胞，所以我们直接从肿瘤组织中提取,,,，然后通过实时定量,,,的方法检钡,,,,,,,的表达情况。结果表明，样品在经过很多个循环后，才能检测至,,,,,,,，其水平也没有高于移 植前的细胞，而移植前细胞的,,,,检测为阴性。 牛的肿瘤经过细胞分选后，我们对其进行了端粒限制长度分析(,,,)。在原代细胞，,,,约为,,,,，与以前的报道一致‘,, ,”。但导,(,,,啪,’基因和(或),,,, ,,,基因后，,,,缩短((,,,(,)。从肿瘤中分离的细胞，其端粒,,,信号极其微弱，很难与背景分开。在此处，信号的急剧减少与我们以前观察到的没有经过基因修饰的牛肾上腺皮质细胞在发生复制衰老时的情况很相似化”。 (五)通过人端粒酶逆转录酶恢复细胞的致瘤性 我们推测，肿瘤细胞进入危机期是由于端粒的缩短引起的。最初，,,,,,删和,,,, ,,,推动细胞增殖、侵袭和转移，当细胞进入危机期时，这些特征也随之逐渐丢失。如果这个模型正确的话，那么在细胞中引入,,,,,基因，使其表达,,,,,以维持端粒的长度，则有可能恢复细胞的致瘤性。先将细胞从肿瘤中分离出来，然后再对其进行体外细胞培养。从第二代、第三代牛源性肿瘤和第一代人源性肿瘤中分离获得的细胞，在进行体外培养时，表现为生长不良，且显现出典型的危机迹象。正如危机期的细胞通常所表现的那样，虽然可观察到细胞的分裂，但细胞总数却随着贴壁细胞数目的减少而逐渐减少。在我们所观察的人源性和牛源性肿瘤细胞中，无一幸免。然而，当,,,,,基因被导入肿瘤细胞后，细胞端粒酶活性增强、生长速度变加快及在培养基中无限增殖。 从第二代、第三代牛源性肿瘤和第一代人源性肿瘤中分离获得的细胞进行再种植时，它们不能在动物体内形成肿瘤。然而，当,,,,,基因被导入这些细胞时，它们又重新获得致瘤性(,,,(,)。细胞通过肾脏被膜下种植和皮下胶原种植这两种方法都可以形成肿瘤。对,,,,州,,,,, ,,,基因转导细胞所形成的肿瘤进行系列移植时，宿主不超过三代。但是，如在这些细胞中导入,,,,,基因，则细胞至少可以移植到第四代宿主动物体内。还有，肿瘤每经过一代移植，其在动物体内的生长速度都发生递增(,,,(,)。肿瘤生长速度的递增伴随着端粒,,,长度的递增(,,,(,)，这一发现与致瘤性恢复的端粒维持机制相一致。 (六)原癌基因表达细胞通过皮下注射获得致瘤性必需有,,,,,的参与 在表达原癌基因,,,,,,’和,,,, ,,,的细胞中导入,,,,,基因，然后将此细胞悬液通过皮下注射接种动物，使其在动物体内形成肿瘤，这就是传统的使细胞产生致瘤性的方法。在此，我们使用的是,,,？,,,,,, ,,,转导的牛肾上腺皮质腺细胞，该细胞在通过组织重建的方法接种动物时，可以产生侵袭性肿瘤。将这些细胞分成几个等分后，注射到免疫缺陷小鼠皮下:另外一组细胞先导入,,,,,基因，通过药物筛选后，再注射到小鼠皮下。每次注射,×,,,个细胞，共注射,,个点。结果发现，,,,,,,。,,,,, ,,,,,,,,,转导细胞产生的肿瘤不断增大，且侵犯临近组织(,,,(,):而,,,,,外,,,,, ,,,转导细胞在皮下注射时，则不能形成肿瘤。,,,,,列,,,,, ,,,转导细胞在皮下注射后不久，可以观察导小的荧光结节(直径小于,(,;,);有的荧光结节甚至可以观察,,天，但它们都不再增大，以致最后检测不出。在,,,,,’,,,,, ,,,转导细胞注射的,,个点中，没有肿瘤直径超过,(,;,，它们最终都将消失。三、讨论 复制衰老作为肿瘤抑制机制的概念首先是由,,,, ,,,,,在,,世纪,,年代提出来的(,,),人的细胞能够抵抗瘤性转变，同时，人们发现，,,,, ,,,和,,,,,,,,转导细胞形成的肿瘤在长,,;,后就开始萎缩(,,),复制衰老的设想正 是基于上面的事实而提出的。然而，人们并不清楚肿瘤萎缩的原因。人们也不知道肿瘤中是否也发生危机或衰老，如果是的话，这是否会改变肿瘤的生长速度、侵袭性和转移性。因此，人们还没有对肿瘤停止生长或萎缩的原因进行广泛的实验研究，这可能是由于人们普遍使用永生化细胞系来进行原癌基因致瘤性研究的结果。 本研究证明，由表达,,,,,纠和,,,, ,,,的人和牛肾上腺皮质细胞所形成的端粒酶阴性肿瘤中，处于危机期的细胞逐渐增多，这一状态伴随着肿瘤侵袭性和转移性的丢失及包膜的形成。正常分裂极少见，但细胞显然处于细胞周期。细胞出现明显的形态学异质性，许多细胞出现巨核、多核或染色体分离异常等现象。肿瘤细胞的染色体组型显示出多重异常，但是，这些原癌基因转导细胞在种植时是正常的。引入,,,,,基因可以恢复细胞的致瘤性，这证实了细胞致瘤性的渐进性丢失是由于端粒酶维持机制的缺失引起的。因此，这些数据阐明了端粒酶的作用:在这个模型中，端粒酶对于细胞的致瘤性(包括侵袭性和转移性)并不是必需的，但当端粒缩短到一个关键时刻，它对于维持肿瘤继续生长却是必不可少的。 端粒酶阴性恶性肿瘤中新发现的危机现象给我们提出了几点问题。首先，尽管我们所做的实验有限，危机确实是一个可靠的肿瘤抑制机制。没有肿瘤能够逃避危机，如局灶性再生长，也许是由于端粒酶激活的细胞或,,,弓，起的“,,“?。在这.