阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶的鉴定及酶学研究

阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶的鉴定及酶学研究 河北医科大学研究生学位独创性芦明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了 文中特别加以标注和致谢等内容外,文中不包含其他人己经发表或撰 写的研究成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写, 文责自负。 导师签章:狗,麴 研究生虢拯姒 沙汐年月刁日第一部分,阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶的酶学研究 前言? 日吾? 与方法? 结果附图附表讨沧参考文献 第二部分阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶的检测 前言刚吞材料与方法? 结果多口??‘‘ 附图讨论小结参考文献 结论 综述 阿特拉津及其降解菌株中三嗪水解酶研究进展? 致谢 个人简历??中文摘要 阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶的鉴定及酶学研究 摘 要 阿特拉津,商品名莠去津,是一种在世界范围内广泛使用 的三嗪类除草剂。由于其在环境中稳定存在,不易降解,造成了生态环境 的破坏,威胁到人类食品及饮用水的安全。阿特拉津降解菌株根据其降解 基因的组成,可以分为三种类型,分别是口别曰、舰?口枷和 口别加。耽?基因所编码的酶是眈肚口加降解途径中降解阿特拉津 的第一个酶,称为三嗪水解酶。眈?基因比口别基因在阿特拉津降解菌中 更加普遍,并且具有更广的底物谱。因此,阿特拉津降解菌株中摊因 的生物学功能具有重要的研究价值。 目的: 通过对四株阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶基因胞.?的比较研究, 加深对眈.?基因生物学功能的认识,为生物修复技术的发展提供理论储 备。 方法: 三嗪水解酶的表达与纯化 .表达载体和菌株的构建:用方法扩增出三嗪水解酶基因耽?, 『 连接至高效表达载体上,转化入 ,并添加分 子伴侣。 .表达条件的优化:选择合适的..心浓度、生长温度和 浓度,优化表达条件,增加可溶性蛋白比例。 .保存条件的优化:选择最适的缓冲液、最适值以及缓冲液的浓度, 最大限度的保存蛋白活性。 .纯化条件的优化:根据亲和层析的方法,用不同浓度咪唑洗脱缓冲液 洗脱蛋白,纯化目的蛋白。 三嗪水解酶酶学性质的比较研究 .最适反应条件的研究:测定蛋白活性与温度、值以及金属离子之 间的关系。 .底物特异性的研究:研究降解不同底物的能力。中文摘要 酶动力学常数测定:测定并计算的‰值和%双值。 三嗪水解酶在阿特拉津降解菌株中的分布:为了在蛋白水平上进 一步确定筛选得到的阿特拉津降解菌株中是否含有抛?基因编码的三嗪 水解酶,进行了 检测。我们将构建好的表达载体 表达菌株中眈?基因来自节杆菌 ..妮?转化入. ,制备兔多克隆抗体。用制备好的舵抗体作为一抗,辣根过氧化 物酶标记羊抗兔作为二抗,对各阿特拉津降解菌株进行 检测。 结果: 三嗪水解酶的表达与纯化 .表达载体和菌株的构建:根据双酶切和基因测序结果证明高效表达载 体.班?构建成功。 . 的最适表达条件为:表达菌株生长至约为.时加入 ..心至终浓度为.%,诱导表达. ,分别加入至 终浓度.岫?~,?诱导表达 ,可溶蛋白表达量最大。 . .的 的最适保存条件为:州粗酶液在 ?磷酸钾 缓冲液中酶活力的保持最好。 .纯化条件的优化:在咪唑浓度为 ?.时目标蛋白被大量洗 脱,并且不含杂蛋白。 三嗪水解酶酶学性质的比较研究 .最适反应条件的研究:纯酶酶反应的最适值为.,其在 .的中性环境中比较稳定;纯酶在室温至?之间比较稳定,放置 后酶活力降低较少,在~?放置 酶活力降低明显,在 ?放置 酶完全失活;经研究表明、入恤、、和 对有激活作用,特别是对酶的激活作用明显,和 对酶有轻微抑制作用,使活性减弱。 .底物特异性的研究:烈酶有多底物活性,对锄叫的降解活性最 高,巧次之,而对巧、和的降解活性相 对较低。 的酶动力学常数:四种不同阿特拉津降解菌株三嗪水解酶的 ‰值和‰觚值非常相近。米氏常数‰和最大反应速度‰舣分别 约为士“?~, 士肛?~~。 在阿特拉津降解菌中得分布:除风“如加刀傩印.不能与 蛋白抗体相结合外,其余株阿特拉津降解菌株均与测蛋白抗体发中文摘要 生免疫荧光反应。 结论: 这四株阿特拉津降解菌株所表达的蛋白,降解活性无明显差异。 除风甜如研门傩甲.不含有蛋白外,其余株阿特拉津降解 菌株中均含有蛋白。 关键词:阿特拉津降解菌;三嗪水解酶;;酶学性质;分布英文摘要 一???????????????????????????????????????????一 ?, , . 时 缸 酊 , 铲, 谢够 , 西衄 . “越 抛 蟮 :口纪.眈.口翻锄口纪一耽.眈一口柚 铲., , 巧 强口纪 舒 讹.口纪 .力:口 。 ,.: 矗嘶 ? ?铲 仔 : 嘶 试:. 纰, 盘珊 筋护 西?、 ’仃 . . : . , .缸 】, . , 一????????????????????????????????????????????一 直’ , 唱 . .:、 ,秒 吼 . 时:髓 . : ‰ . ‰ 们: 矽 眈 仔 铲 , .. . 舶 谢. 眈 巧. 埘巧巧 . . :. : 一力 . 如. . : 一一 . %.. . . 英文摘要 . 缸 嘶 .。’? .: . 雎。 .,吼 . 嘶:协?. , 时. 币 .:.; .,? 蟛觚 , ?.~?,觚删. ,,, , 虢 ,“ 。 够 . , :】. 铲 巧, 曲 曲 之 “时 了, 酬埘;?劬.:% % . 士 如% 心~, 士??。~.: 嘶 佻“如口印. . : 疳 :伊 “如聊门鲫踱之. ;; 研究论文 阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶的鉴定及酶学研究 阿特拉津捆,是一种内吸选择性苗前、苗后除草剂。 年在全世界推广使用,至今已长达多年,每年的施用量非常巨大,而 且正在逐年增加。研究表明,阿特拉津是一种内分泌干扰剂,它能干扰激 素的调节功能,引起人和两栖动物的生殖缺陷,诱发肿瘤和癌症,其生态毒 理风险不容忽视。它的性质比较稳定,半衰期长,因此在环境中分布非常 广泛,造成了生态环境的污染破坏,威胁到食品及饮用水的安全,其所产 生的环境污染问题已经引起全世界的关注。现在普遍认为环境中阿特拉津 生物降解的主要降解途径分为水解脱氯、脱烷基和开环三个。脱氯水 解是目前阿特拉津生物降解的第一步反应,也是最为重要的反应。根据降 解基因的组成,可以将阿特拉津降解菌株分为三种类型,分别是 口刎召、眈乜凇和口别眈。其中风础豫印.菌株 菌株最有代表性。 和么砌阳口幼一. 菌株的发现提供了一个不同于菌株的新的阿特拉津降解基 因北?和一条新的降解途径。有研究表明含有耽?基因的阿特拉津降解 菌株比含有口别基因的菌株具有更广的降解谱。因此其具有良好的研究 前景。 本研究分为两个部分,第一部分对四株阿特拉津降解菌株中三嗪水解 酶基因械行了克隆、表达,纯化,并对酶学性质进行了比较研究;第 二部分采用 方法检测了环境中分离得到的株阿特拉津降解 菌株中的分布,以求为生物修复技术的发展提供可靠的理论依据。酶的酶学 研究 阿特拉津仃,化学名.氯..乙胺基..异丙胺基.,,.三嗪, 商品名莠去津,是一种在世界范围内广泛使用的三嗪类除草剂【】。它不仅 可以抑制植物特别是敏感作物的光合作用和蒸腾作用【】,从而抑制其生 长;还具有环境内分泌干扰作用【】,可导致动物致癌、致畸,对人体有致 突变作用。因此,阿特拉津的生物降解和其污染环境的生物修复研究对生 态安全和人类健康具有重要意义【】。 降解阿特拉津的菌株根据其降解基因的组成,可以分为三种类型,它 们的降解基因组成分别是口枷四、舷?口幼和口刎眩【。舰? 基因所编码的酶是抛?口加降解途径中降解阿特拉津的第一个酶,称为 三嗪水解酶。虽然抛?基因与口刎基因在阿特拉津降解途径中的作用相 同,但是口别基因主要存在于革兰氏阴性菌中,耽?基因主要存在于革 兰氏阳性菌中,北?基因比口别基因在阿特拉津降解菌中更加普遍,并 且具有更广的底物谱【】。 蛋白在大肠杆菌中进行体外表达常常形成包涵体沉淀,本实验 通过添加分子伴侣【】帮助蛋白在菌体中形成正确的折叠【】,对 阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶基因眈?的酶学活性进行深入的研究。研究 论文 材料与方法 材料 .菌株 、 么砌阳口据印. 、彳砌阳口办穿印.、彳厂砌阳以纪印. , 【、 、 , 、 彳砌加口纪厂印.、 。 .培养基和培养条件 液体培养基?。:胰蛋白胨,,酵母粉 ,,天津市光复科技发展有限公司,., ?高压灭菌。 ., .,肿? 阿特拉津无机盐培养基?’: .,阿特拉 .,蔗糖,柠檬酸钠,微量元素,津.用甲醇配成 ?。储液,高压灭菌之前加入。 彳砌阳口盯印.、彳,砌阳口纪印.削、彳厂砌加口纪印. 【、 和彳尸砌加口纪 矽.菌株都在?条件下震荡培养。 、. 在?下生长。 和. .试剂 ..基因扩增和克隆试剂 质粒小量提取试剂盒北京索莱宝科技有限公司;触四、 、、、普通琼脂糖凝胶回收试剂盒北京天根生化科技有限公司; 北京全式金生 物技术有限 公司;限制性核酸内切酶舭酶、砌酶、 连接酶 ,;口北京鼎国生物技术有限责任公司;卡那 霉素,氯霉素华北制药股份有限公司;溶菌酶。 ..蛋白表达试剂 ?认;蛋白质分子量标准、、甘氨酸、丙 烯酰胺、垭、考马斯亮蓝和.,;牛血清白 蛋白,一一舰。 质粒:,含有?基因和肠启动子,重组蛋白一端、 一端带有.,为公司产品。质粒图谱和表达区结构见图 研究论文 ..矛口..。 粗品阿特拉津购自吉林化工有限公司农药厂提供;捆、 巧、叫、、和巧购自化 学试剂公司,试剂均为纯。 .琼脂糖凝胶电泳试剂 . , ×缓冲液:碱 , ,冰醋酸. 。 蒸馏水溶解,补蒸馏水至 加样肫 ?。嘣,.%溴甲酚紫,%甘油:. % 溶于 蒸馏水,用冰乙酸调至.,加“甘油,加. 溴甲 酚紫。 ,加入 灭菌双蒸水中,磁力搅 溴化乙锭溶液: 拌数小时以确保其完全溶解,然后转入棕色瓶中,?保存。 .. .电泳试剂 . ,. 分离胶配制%: ,%巧锄 ?。 .. ,% “,% 山,匣 肛。 . . ,. 浓缩胶配制%: ,%珂 ?。 .. ,% 肛,% 山,?匝 。 电泳缓冲液: ?以碱, ?。甘氨酸,.%, .。 上样缓冲液: .,%.巯基乙醇,. ?以. %溴酚蓝,%,%甘油。 染色液:.%考马斯亮蓝,%甲醇,%醋酸。 固定液:.%醋酸,%甲醇。 脱色液:%醋酸,%甲醇。 .仪器 一 双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任 公司;.超声波细胞粉碎仪宁波新芝生物科技股份有限公司;/ 凝胶成像仪、 ? 电泳仪., 蛋白核酸测定仪、 ;型仪 ,;、厂? 涡旋振荡器 ,;低温摇床、研究论文 耐 生物安全柜、 高速冷冻离心机, ;.高压灭菌器 ,印;梅特勒.托利 多分析天平.,;??.电热恒温水浴锅、 .台式恒温振荡器天津欧诺仪器仪表有限公司;...台 式低温离心机上海安亭科学仪器厂; .?数显电热培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;暗箱式紫外透射仪北京 鼎国生物技术有限责任公司。 方法 .高效表达载体的构建 ..细菌总的制备 将【、、和菌株接种于无机盐培养基, ?培养至对数期。 . 离心. 菌液,菌体用 ?洗三次。 用. 碱, 含 .。的: , 。 .充分悬浮菌体,室温作用 , 后取出,并立即置于.? 将管放入沸水浴中, 冰箱冷冻。 从冰箱中取出管,融化之后再次放入沸水浴中,煮沸 ,如此反复煮沸冻融三次。 ,取上清,.?保存备用。 ,×盯离心 ..载体的提取: 采用北京索莱宝科技有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒。 菌种接种于含有鹏.。的培养基中,?过 夜培养至对数期。具体步骤: 取过夜培养的细菌培养物,,×离心,菌液可 通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,应尽量吸除上清。 向留有菌体沉淀的离心管中加入此溶液,用移液器彻底 悬浮菌细胞沉淀菌块应彻底混匀,若未完全混匀会影响裂解,导致质粒 提取量和纯度偏低。 向离心管中加入此溶液,温和的上下翻转.次使菌体 充分裂解。为避免质粒受到破坏,所用时间不应超过。研究论文 向离心管中加入止溶液?,立即温和的上下翻转.次, 充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。,×离心。取上清置于 另一干净的离心管中,尽量避免吸出沉淀。若仍有少量沉淀可再次离心后 取上清。 将上一步所得上清液加入吸附柱中吸附柱加入收集管中, 室温放置,,×离心,弃掉收集管中的废液,将吸附柱重 新放入收集管中。 向吸附柱中加入止的漂洗液使用前先检查是否加入无水 乙醇,,离心,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收 集管中。 向吸附柱中加入止漂洗液,,×离心,弃废液, 将吸附柱放入收集管中。 ,×离心,将吸附柱敞口置于室温或?温箱放置 ,去除吸附柱中残留的漂洗液,以免影响后续实验。 将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜的中央悬空滴加 此经?水浴预热的无菌去离子水,室温放置,,×离心 。 为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入吸附柱中, 室温放置,,×离心,得到的产物保存在.?。 .北?基因的扩增 叮 引物:上游引物:’么/彳丁盟丛 ’。下划线碱基为?沈的酶切位点,斜体为保护碱基 脚 下游引物:’?彳彳丁丛 婴 ’。下划线碱基为觑棚的酶切位点,斜体为保护碱基研究论文 体系: 试剂 体积山 ×腩含 . 上游引物 下游引物” ??????如 程序: ?????????专???? .. 产物的纯化快速纯化/回收试剂盒 采用北京天根生化科技有限公司的普通琼脂糖凝胶回收试剂 盒完成产物的纯化。 收集止扩增产物,%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下切取 产物所在的凝胶尽量不要多余的凝胶,转移至一个称量过的干净的离 心管中,称量胶的重量。 柱平衡步骤:吸附柱放入收集管中,向吸附柱中加入此 平衡液,,×离心,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中使 用当天处理过的柱子。 将单一的目的片段从琼脂糖凝胶中切下尽量切除多余 部分,放入干净离心管中,称取重量。 向胶块中加入倍体积溶胶液,?水浴放置,其间 不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解胶块完全溶解后需将 胶溶液温度降至室温在上柱。 将上一步所得溶液加入吸附柱中,室温静置,,× 离心. ,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。吸 附柱容积为此,若样品体积大于此可分批加入。研究论文 向吸附柱中加入止漂洗液,室温静置, ,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管 ,×离心. 中。 重复上述步骤。 将吸附柱放入收集管中,,×离心,尽量除尽 漂洗液。将吸附柱置于室温放置 ,彻底地晾干,以防止残留的 漂洗液影响下一步的实验。 将吸附柱放到一个新的干净的离心管中,向吸附膜中间位 置悬空滴加此无菌去离子水?水浴预热,室温放置。,× 离心 收集溶液。将溶液储存于.?可长期保存。 ..眈?基因和载体的双酶切 耽?基因的双酶切:?保温酶切过夜。 载体的双酶切:?保温酶切过夜。 酶切体系中的成分 加入量 ×廿. 肛 ?如酶 胁刀 酶 . 嵋 ,.. 删基因与载体的连接 连接体系:?反应过夜 ×/此 出 无菌去离子水 山肛 “ 『 ..感受态细胞 的制备和重组质粒的转化: 在 培养基中接种仪单菌落,?振荡培养过夜。 取振荡培养过夜的菌液. 接种于 不加抗生素的培养基中, ?振荡培养,直至菌液的在.~.范围内。 提前用冰预冷 聚丙烯离心管,倒入菌液并在冰上放置 以确保培养物冷却至?。 菌液在?, ..条件下离心 ,收集菌体细胞, 倒掉离心管中的上清液并控干。 用 冰预冷的. ?。溶液悬浮菌体细胞,冰浴 。 . 悬浮液在?, ?。条件下离心 ,倒掉离心管中 ,控干,用 冰预冷的. .。 的上清液,将管倒置 悬浮菌体细胞。 按每 感受态细胞分装,置于经过冰预冷的离心管中。 向感受态细胞中加入连接产物体积? ,质量? , 。 轻旋转混匀,冰浴 将管放到?水浴中热激 ,迅速将管转移到冰浴中,冷却 . ,向管中加入皿平衡至室温的培养液,/,?孵 育。分别吸取、、、 菌液涂于含有 ?。卡那 霉素的平板上,?倒置培养过夜。 ..重组质粒的提取 质粒提取采用北京索莱宝科技有限公司的试剂盒,具体步骤:见 ..。研究论文 ..重组质粒的酶切鉴定 参考载体图谱,利用舭酶和觑硼酶酶切重组质粒。 酶切体系如下: 酶切体系中的成分 加入量/此 × 山 ?如酶胁门?酶 提取的重组质粒 山约 肛 “ 反应条件:?温浴过夜。用琼脂糖凝胶电泳判定结果。 ..眈?基因的核苷酸序列测定 将分别含有、、和 删基因重组质粒的菌液送 至华大公司测序。 .. 序列的分析 登录仕://、矾狲,...网站,测序结果进行核苷酸序列的 比对。 . 蛋白【】的表达 ..建立蛋白表达体系 从含有高效表达载体重组质粒的?厅菌株中提取出重组质 粒,并转化到具有高效表达重组蛋白能力的. 菌株中, 的培养基中。 ?震荡培养于含有嵋.。 之后将分子伴侣【转入该菌株中,?震荡培养于含有烬.‘ 的培养基中。加入。.心和诱导 和“?。 分子伴侣和重组蛋白的表达。 ..心浓度对表达量的影响 和 的培养基中, 表达菌株接种于含有嵋.。 .。 ?震荡培养过夜,过夜培养物按%的接种量接种,重新震荡培养至 ?诱导表达. 在培养基中终浓 为.。加入..心 度分别为.、.、.、.、.和.%;再加入 。收集培养物,磷酸钾缓冲 使终浓度达到.岬?~,?诱导表达研究论文 ,取上清液进 液重悬并进行超声破碎,悬液在?,,×离心 行聚丙烯酰胺凝胶电泳。 生长温度对表达量的影响 表达菌株接种于含有岭?。和 .以的培养基中, ?震荡培养过夜,过夜培养物按%的接种量接种,重新震荡培养至 为.。加入..胁至终浓度为.%,分别于?和 。 ?诱导表达. ;各加入使终浓度达到.岬?诱导表达 收集培养物,磷酸钾缓冲液重悬并进行超声破碎,悬液在?,,× 离心 ,取上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。 浓度对表达量的影响 表达菌株接种于含有愕?。和嵋.。的培养基中, ?震荡培养过夜,过夜培养物按%的接种量接种,重新震荡培养至 为.。加入..时至终浓度为.%,?诱导表达. ;加入在培养基中终浓度分别为.、、、、、岬?。, ?诱导表达 。收集培养物,磷酸钾缓冲液重悬并进行超声破碎,悬 液在?,,×离心 ,取上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。 ..酶活力的测定 原理 因为蛋白可以催化莠灭净锄叫脱氯,生成羟基阿特拉津, 在啪波长下,莠灭净具有吸收峰,而产物羟基阿特拉津在该波长下 没有吸收峰,所以可以用紫外分光光度计在 波长下吸收峰的减少 来推测的酶活。 测定方法 于?提前预热 .。反应体系 ?以磷酸钾缓冲液 .,适量 :莠灭净岬?。, ?。磷酸钾缓冲液 酶液。使用直径为 的狭缝石英比色杯。 酶活力定义 ?, .条件下,每分钟氧化岬莠灭净仃所需的 酶量为个单位。比活力定义为每毫克蛋白拥有的酶活力单位.以。 莠灭净标准曲线的绘制 、 将莠灭净锄仃母液分别稀释成终浓度为、、、研究论文 下测定光吸收值。以莠灭净浓度为横 岬?。浓度的溶液,在 坐标,值为纵坐标,绘制标准曲线。 蛋白标准曲线的绘制 ?考马斯亮蓝溶液的配制:称取 考马斯亮蓝.溶于 %的乙醇中,加入 %的磷酸,用双蒸水稀释至 。溶液中含 有.%~磷酸,.%?乙醇和.%?考马斯亮蓝 .。 ?标准蛋白溶液:用. ?将牛血清白蛋白配成 .‘ 蛋白溶液。 ?标准曲线制定: 摇匀,号管作为空白对照, 以内在 处比色。 标准曲线的绘制:以标准蛋白含量为横坐标,值为纵坐标,画一 条过原点的直线。 ..优化粗酶液保存条件 粗酶液的制备 于?, .。离心 条件下收集菌体,用.%清 洗三次, .重悬。在冰水浴中,工作 ?。磷酸钾缓冲液 秒、间歇秒、功率瓦、个循环条件下超声破碎细胞,悬液于 ,上清液即为粗酶液。 ?,,×离心 粗酶液保存缓冲液的选择 ., ., ?。磷 分别于 ?‘磷酸钠缓冲液和 酸钾缓冲液中重悬诱导表达后的菌体细胞,超声破碎细胞,提取粗酶液。 粗酶液于?保存 ,在 下测定粗酶液的活力,比较不同缓冲液 对酶活力的影响。研究论文 缓冲液值的选择 分别于值为.、.、.、.、.的 ?磷酸钾缓冲液 中重悬诱导表达后的菌体细胞,超声破碎细胞,提取粗酶液。粗酶液于? 保存 ,在 下测定粗酶液的活力,比较值的不同对酶活力造 成的影响。 缓冲液浓度的选择 于缓冲液浓度分别为、、、、 ?。值为.的磷 酸钾缓冲液中重悬诱导表达后的菌体细胞,超声破碎细胞,提取粗酶液。 粗酶液于?保存 ,在眦下测定粗酶液的活力,比较不同缓冲液 浓度下酶活力差异。 ..建立蛋白纯化条件 蛋白洗脱【】条件 ?。的 各洗脱缓冲液中值均为.,其中含有终浓度为 ,终浓度为 ?的磷酸钾,咪唑浓度分别为、、、、 、、 ?~。蛋白纯化步骤如下: ?将 %.队?树脂悬液加入到×.结 合缓冲液中,轻柔混匀。待树脂自然沉降后,用枪头吸去上清。 。 ?树脂中加入制备好的粗酶液,印,?结合 ?将粗酶液. ?树脂混合物加入下端封闭的空色谱柱 中。 ?除去柱下端封闭盖子,收集流出液穿过峰,保存用于聚丙烯酰 胺凝胶电泳分析。 ?用×.结合缓冲液漂洗次洗掉残留的过量酶液,然 后用 的咪唑浓度分别为、、、、、、?的洗 脱缓冲液按顺序洗脱,分步收集洗脱液,将各步收集的洗脱缓冲液用于聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测,确定目的蛋白洗脱缓冲液的咪唑浓度。 树脂的再生 当更换纯化蛋白种类或柱效下降时,需要进行琼脂糖再生。 .. 蛋白酶学性质测定 蛋白的热稳定性 分别于室温?、?、?、?、?和?条件下保温纯研究论文 化的蛋白 ,迅速用冰浴冷却,加入到酶反应体系中,进行酶 促反应,测定蛋白的活力。 蛋白的耐受性 ?。 分别于值为.、.、.、.、.、.、.、.的 磷酸钾缓冲液中稀释纯化后的蛋白,室温下保温 ,加入酶反 应体系中,进行酶促反应,测定蛋白活力。 金属离子对?蛋白活力的影响 分别添加金属离子、、、毋、、、和 于酶反应体系中,使其终浓度达到. ?~,进行酶促反应,测定 蛋白活力。 蛋白的底物特异性 分别以仃、叩、拶、、和锄驴 浓度均为岬?。作为酶反应体系中的底物,进行酶促反应,测 定蛋白活力。 蛋白米氏常数及最大反应速度的测定 以不同浓度的莠灭净作为酶反应体系中的底物,?下对蛋白 进行酶促反应,取一级反应初速度数据,用作图法【】,以 /】为横坐标,?为纵坐标作图,计算蛋白对莠灭净的米氏常数 及最大反应速度。 结 果 高效表达载体的构建 用带有舭据和觑聆酶切位点的引物,分别以彳,.砌阳口纪厂.、 彳娩,口纪 .、彳尸砌加口五铲.并口彳砌阳口纪 .的 细菌总作为模板,扩增舭?基因,片段大小约为. ..。 用?如和麒棚分别对.表达载体和删基因片段回收产物 ,眈?基因片段大小约 进行双酶切,载体片段大小约为. 为. 连接酶过夜连接。 见培.。两者的双酶切产物,用 重组质粒进行双酶切检验,结果与载体片段和北?基因片段大小相符, 证明删基因与表达载体已经正确连接喀.。研究论文 基因测序发现和两个菌株的眈?基因只有个碱基不同 如喀.,它们的第位碱基,为,为。它们编码 的三嗪水解酶必的第位氨基酸,为亮氨酸,为甲硫 氨酸。菌株的眈?基因与菌株北?基因的类似性为%如 ..,前者的第、、、和碱基分别是、、、、 ,编码的氨基酸分别为、、、和,后者上述位置的碱 基分别是、、、、,编码的氨基酸分别为、、、 和。的抛?基因与菌株眈?基因的类似性为%如 嘻.,在基因序列的第、和碱基处,是、和, 编码的氨基酸分别为、和,菌株则是、和,编码的 氨基酸分别为、和。 建立蛋白表达体系 . ..心浓度对表达量的影响 ?诱导表达 震荡培养表达菌株至为.,加入..心 . 在培养基中终浓度分别为.、.、.、.、.和. %;再加入 ?诱导表达 。收集培养物,磷酸钾缓冲液重悬并 ,取上清液进行聚丙烯 进行超声破碎,悬液在?,,×离心 酰胺凝胶电泳,发现随着..加浓度增加,诱导后蛋白的表达量 逐渐增加..。 .生长温度对表达量的影响 正常的大肠杆菌生长温度应为?,但是在?培养后诱导表达菌株 表达蛋白,发现上清液中可溶性蛋白的量较少,测得三嗪水解酶活性很低, 大部分的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。因此,将表达菌株接种 的培养基中,。震荡培养,使 于含有嵋吼 和岭. ; 达到.;加入..心,分别于?和?诱导表达. 之后加入诱导表达 。提取粗酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 ?下的表达量要高于?, 培.。由图可知,可溶性目标蛋白在 可见低温明显增加了可溶性蛋白的含量。 . 浓度对表达量的影响 、 在培养基中加入终浓度分别为.、、 、、岬?, 诱导表达,上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。如嘻.所示,在研究论文 .岬?.~岬?的浓度下,蛋白表达量无明显差异。 三嗪水解酶活力测定方法的建立 .莠灭净标准曲线 将莠灭净母液稀释成一系列浓度梯度,在 下测定光吸收值。 以莠灭净浓度为横坐标,“值为纵坐标,绘制莠灭净标准曲线 培.。由图可知该过原点的直线的为.,标准曲线可用。 .蛋白浓度标准曲线 处比 用牛血清白蛋白配置成的含有不同蛋白浓度的溶液,在 色,以标准蛋白含量为横坐标,值为纵坐标所绘制出的蛋白浓度标准 曲线..。此通过原点的直线的为.,标准曲线可用。 优化粗酶液保存条件 .粗酶液保存缓冲液的选择 ., ., ?’磷 分别于 ?以磷酸钠缓冲液和 酸钾缓冲液中重悬诱导表达后的菌体细胞,超声破碎细胞,提取粗酶液。 粗酶液于?保存 ,在 下测定粗酶液的活力。由于菌体细胞相 同,目的蛋白的表达量也应该相同,缓冲液对酶活力的影响可以用相对比 后的粗酶 活力来表示遮.。结果显示,在磷酸钠缓冲液中保存 液,其相对比活力仅为磷酸钾缓冲液的%,可见磷酸钠缓冲液对粗酶 液活力的保持不如磷酸钾缓冲液。 .缓冲液值的选择 ?以磷酸钾缓冲液 分别在值为.、.、.、.、.的 中重悬诱导表达后的菌体细胞,超声破碎细胞,提取粗酶液。粗酶液于? 保存 ,在衄下测定粗酶液的活力,比较不同值时酶的相对比 .时 活力..。酶的相对比活力随着值的升高而升高,在 酶活力保持最好,可知在偏碱的溶液中该酶活性的保持比较好。 .缓冲液浓度的选择 在缓冲液浓度分别为、、、、 ?为.的磷酸 ,在 钾缓冲液中,超声破碎细胞,提取粗酶液。粗酶液于?保存 下测定粗酶液的活力,比较不同缓冲液浓度下酶的相对比活力 ..。由图可知酶的相对比活力随着缓冲液浓度的增加而逐渐升 ?。中磷酸钾缓冲液中酶的比活力最好,对酶活性的稳定 高,在研究论文 保持比较好。 .的 ?磷酸钾缓冲液是蛋白纯 综合上条件所述, 化和酶学性质研究的最佳条件。 蛋白的纯化 用 的咪唑浓度分别为、、、、、、.。 的洗脱缓冲液按顺序洗脱柱子,分步收集洗脱液,将各步收集的洗脱缓冲 液用于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测培.。由图可知,用咪唑浓度为、 、、?。的洗脱液洗脱柱子时,只有杂蛋白洗出;?. 咪唑浓度洗脱时只有少量目的蛋白被洗脱下来,直到 ?。咪唑浓 度时目的蛋白才被大量洗脱,可见与蛋白结合非常紧密。纯化 过的蛋白在.电泳图中只有一条带,纯度满足酶动力学研 究的需要。 蛋白酶学性质测定‘ . 蛋白的热稳定性 分别在室温?、?、?、?、?和?条件下保温纯 化的蛋白 ,迅速用冰浴冷却,加入到酶反应体系中,进行酶 促反应,以?酶活力作为对照,测定蛋白的活力逸.。四 种降解菌株蛋白的活性均随着温度的升高逐渐降低,下降趋势相似: 在?和?条件下放置 时酶活力下降不太多;温度在?时酶 活力减少为原来的一半左右; ?时更降低到%左右;?时则完全 失活。可见烈蛋白并不能耐受高温。 . 对的耐受性 ?。 分别在值为.、.、.、.、.、.、.、.的 磷酸钾缓冲液中稀释纯化后的蛋白,室温下保温 ,测定 .酶活力最 蛋白活力。由培.可知,四种烈蛋白的活性均在 .越远酶的活力下降约明显,并且酶对碱性条件比对酸性 高,距离 条件敏感。 .金属离子对酶活性的影响 很多酶都可以与不同的金属离子相结合,从而提高或抑制酶的活性 【。分别加入金属离子、、、、、“、和 ., 于反应体系中,以不加金属离子的组作为对照,在?,研究论文 ?。磷酸钾缓冲液中下进行酶促反应。由嘻.可知,”、 和对酶有抑制作用,使得蛋白活性减弱;、、、 和?对有激活作用,特别是对酶的激活作用很明显。 . 蛋白的底物特异性 蛋白可分解多种底物【】。分别以、拶、 时、.、和锄作为酶反应体系中的底物,在 ., ?磷酸钾缓冲液中下进行酶促反应,测定 ?, 蛋白活力。由..可知四种蛋白均对锄时的降解活性最高, 巧次之,位于中间水平,而对、和 的降解活性则相对较低。 . 蛋白的米氏常数及最大反应速度的测定 ., ?.磷酸钾缓冲 分别纯化四种蛋白,在?, 液中,在以不同莠灭净浓度为底物的反应体系中,对蛋白进行酶促 反应,取一级反应初速度数据,结果见 .。用作图法,以/ 为横坐标,?为纵坐标作图....,计算烈蛋白对莠灭净 的米氏常数及最大反应速度,并进行分析,结果见 .。经过多次测 定,我们确定菌株的珞为.士岬?~,‰为.士 岬?‘‖;菌株的‰为.土岬?~,%为 .士岬?。;菌株的%为.士岬?.,‰ 为.士岬?’~;菌株的‰为.士岬?~, .士 %戕为 岬?一。研究论文 附 图 口?’孝舢 ’’ ? 矗’:; : ‘ ‘‘ ‘ 【轴 :‘ : :鞠....::?盏’乍’《;孓 ???????????????. :;’.:婶:飞’越嚣’? 事惴塘甜 船 ? ’?:。:二?’’..,。?一。。 ??磁 。 ’ ‘?,?:’,、~. . .’ ,.二 , 一。 .......’.::“。:’二..二二:. 卜二曼二? 。. ‘’:?:..?:~。 二,一。‘:?二?.:一 培咖 ? , ”。 ? ‘‘ ‘ 毛忑忑丽.: ?《觚陀唧..研究论文 .之.. :两, ,,,, ; ?: . , 锄.. ,,, ‘ 力 .. 副盯: ., ,, ,,, ; : ?; : 缸 . 研究论文 ? ..?纾.? : 盘 , ,, ,,, ; : 纾.?. 一 旦。鲰聪吸嗍凹算鳗熙嫂固;瑚嚷鹎鲍蛳回距簸?鼋麓映?。。 : 。. 殴?? 十 : ..北? 媳一螂鲆暇麟麟照吸蝤麟丛骤凹??艘鹎燃熙懒??。 , 卫鲍一?匙。:?? . 千 虹~群鳅艄箩暇贼熙隧鳟笫觎鳗疆鳗融燃麟叁坦鲤??眄熙仉???, 乱 觋.。翌三简自。十 曼媳~彤鲰殴筏嫂鲼投熙是?西蛸嫂?西鲤鳜鲤鳗眨里鳗鲍?戳照.一? ? , ?, 嫩?呈照嘲。。。 . 十 甄璺鲤鳗照堑?簸 贼赆凹腆簸鳗熙曼熙嬲;;;礤鹚秘跫投熙孵盎她噬 ? 照量~擞王。??:粼??一? . 十 蝗量~黔赡婀;蛆熙鳃姆隅鲍晖些算螂碱嗨?熙%蟛獭晖笾篓缎殛凹眶 ??。 贩.?掩????。懈僦 :一 一艘删掣暇熙哽麟鞠暾?薛赠瓤熙醚暇鲤鼬卿熙码舅圆鳗?,???? 。 。蚴。。? 良 投~?靼 十 : ..眈?研究论文 曼量。鲢硒熙凹曼蜮.回嫒?螂:唧鳟玛西鳓丐贼的矾鳗蛳围孵西‘.觚?~ ? 烈一搬。贼县能玛缎暖融鹎叩固黝西簸暖置:熙嫩 :磁强 .懈贼。 . : 。。。丁丁 。 .?。.? 乱 ~?‘ : 个..纾.?.. 锄。嘶 一一心 : 仔 ,,,,, ; :.,.,.,.,.,.%. ‖:鏊 ??。 , 器磁 ’:” ‘‖“删鳓融秽 删一静涵?。誉喇螂‖ 确蝴龋、.:‖一。“缈,。”. 一: 嚣薹谦寺鬻。 静菱蒸。譬黔 一‘“由略蛐曲 一.~。.:一.、,一?。?:。?蚤.. ?; :?;: ?;: ?; :矾? .: ;: 醇 . ,,,,, 研究论文 ;’ :“ 、” ,,:诲一 珏。;硌 一,’ 鳓日.耘’曩,侈 器。文荤荽笔?蓼 弘碥蝼赛瞄 ‘ 警.篷嚣塞霉 .牌 ;簟、 乒一 、‘。舡‰;一向: 旁 ?潇’ ?,》一?每;: 锻鹊?:‘。 ?冬 :. 童~ , 。静。专, 玲,掣?; 辄 。“卿够警 誓 、:粤:’扣.坤 ,乏: .. ‘一; 、 一’~ 一必。 , 。 。’’础酗嘲蹶蛹鼯: 攀嚣爹?。。。一.‖ 嗨 .嘲圈两嘲静。一’? 《:痒蔼专.,。、。一 .?辆瞄?????嘲?嘲?瞄麓函?南目 .. 锄 口 ?:.,,,,,岬‘‘; : 狄行 优 ,, ,,, .. 培. .. 秒 .. 可研究论文 ‘。 自?“‘“?岫 ?????一.单髀??四 ’’~‖口“,々口, ? 聪??一?一??~~~,菇:毫三 翳 ??曩? , ,??“一,‰互: 置 如?嘲鑫、。。【甏霪 譬霎鼹强 “妇”稿。罄.,:潦 繇.菇潋 群 锄 酋 .. : , ,,,,, ?。; : 狄舒 . , ,,,. .. 时.. 研究论文 .. 仃 .. ? , 如锄缸 .. 研究论文 .... 仃 .. 叫 研究论文 附 表曲 . 能锄仃 时 ??一 . ,岬?。 锄岬?. . . . 一 . . . . . . . . . . . . . . . . 一一 一 一一 . ??????????一 .‰‰ 一??二二??????????????????????‘?。??‘’’’。。’??‘一 』?以 ‰?叫 ????????????????‘??????????????‘‘’?? ‘???????????。。’????????????????一一 .土 .士 .士 .士 .土 .士 .士 .士