早期肾移植术后受者BK病毒活化研究

早期肾移植术后受者BK病毒活化研究 早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究目录 目 录 缩略词表 1 中文摘要 2 英 文摘要 5 前言8 第一部分 BKV 活 化对移 植肾功能 影响的 研究. 11 1 实验材 料 11 2 实验方 法12 3.结果15 4.讨论18 第二部分 早期规 律监 测 BKV 血症 的前瞻性 研究20 1 实验材 料20 2 实验方 法20 3 实验结 果22 4 讨论. 31 第三部分 BKVN 的临 床 分析和治 疗策略 探讨34 1 5 例 BKVN 患者的 病例 资料回顾34 2 BKVN 患者 的病理 学检 查结果 35 3 BKVN 患者 的临床 病理 联系. 38 4 肾移植 术后 BKVN 的治 疗策略探 讨 40 结 论. 41 参考文献 42 肾移植术 后 BKV 感染研 究进展综 述 47 发表. 58 个人简历 64 致 谢. 65 早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研 究 缩略 词 缩 略词表 PV polyomavirus 多瘤病毒 BKVBK virus BK 病毒 BKVNBK virus associated nephropathy BK 病毒相关 性肾病 ATG Antithymocyte globulin 抗胸腺细胞免疫球蛋白 FK506 Tacrolimus 他克莫司 CsA Cyclosporin A 环孢素 A AZA Azathioprine 硫唑嘌呤 Pred Prednisone Acetate 醋酸泼尼松 MMF Mycophenolate mofetil 吗替麦考酚酯 MZR Mizoribine 咪唑立宾 CNI Calcineurin inhibitor 钙调神经蛋白抑制剂 AR Acute rejection 急性排斥反应 DGF Delayed graft function 移植肾功能延迟恢复 HCMV Human cytomegalovirus 人巨细胞病毒 HBVhepatitis B virus 乙肝病毒 HPV Human papilloma virus 人类乳头状瘤病毒 PCR Polymerase chain reaction聚合酶链式反应 IL-2RInterleukin-2 receptor 白介素 2 受体 JCV JCVirus JC 病毒 Kidney disease of improving KDIGO 改善全球肾脏病预后组织 global outcome SV40 Simian virus 40 猴病毒 40 Transplant infectious diseases AST 移植感染疾病组织 group PRAPanel reaction antibody群体反应性抗体 1早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究 中 文摘 要 早期肾移植术后受者 BK 病 毒活化的研究 学位申请人: 王新颖 导 师:石炳毅 教授 (解放军第 309 医院,北京 100091) 中 文摘要 BK 病毒(BK virus ,BKV )属于多瘤病毒家 族属,该病毒在正常人群中的 血清学阳性率 不低于 80% 。BKV 初次感染发 生在儿童时期 , 随后潜伏在人体中, 通常情况下不会损害机体和致病。肾 移 植 术 后 , 在 免 疫 抑 制 剂 等 因 素 作 用 下 , BKV 可以发生活化 引 起感染, 且 能进一步发展为 BK 病毒肾病 (BK polyomavirus nephropathy, BKVN)。BKVN 的主要病理表现 为 肾小管间质性损伤, 移植肾脏丢 失率 可达 15-30% 。目 前,BKV 感染是影响 移植肾脏长期存活的重要因素之一, 但 感染和危险因素还不够明确, 同时缺乏特异性的抗病毒药物。 因此, 如何 早期诊断出 BKV 的活 化,并适时采取干预已成为有效预防和判断预后的关 键。 BKV 的实验室检测包 括以下几种方法: 尿液细胞学检测、 尿液和血液中 BKV DNA 的 PCR 检测、 组织病理学检测以及抗体 BKV IgG 和 BKV IgM 检测等。 根 据临床需要,目前使用较多的检测方法是通过 PCR 方法检测尿液 或血液中的 BKV 载量来判断病毒 的 再活化情况。但是对尿液或血液中 哪种检测方法 更有利 于临床应用和治疗尚未明确,对 BKV 活化情 况与移植肾脏功能的影响关系尚不 清晰,同时对 BKV 监 测的时间和干预措施尚无统一的标准。为此,本研究在此 基础上,采用 PCR 方 法对 BKV DNA 载量进 行定量检测和组织病理学方法对 BKVN 进行诊断, 以评 价 BKV 活化对移植肾 功能的影响。 同时定期对肾移植受 者进行 BKV 监测, 分析 其早期规律监测的价值, 并讨论 BKVN 患者的 诊治方案, 为临床有效的控制 BKVN 的发生提供理论和 实际依据。 一、BKV 活化情况对 移植肾功能影响的研究 2010 年 3 月- 2011 年 2 月在我移植研究所进行同种异体肾移植术的 92 例受 者( 其中男性 63 例(68.48% ) , 女性 29 例(31.52% ) , 平均 (41.50?10.50)岁 , 收集其 中段晨尿和 EDTA 抗凝血,中段晨尿用无菌尿管收集 20ml ,EDTA 管采 血 3-5ml , 立即送检 。 每人至少收集 3 份连续的标本列为实验数据。 应用实时定 量 PCR 方法分别测定 肾移植受者中尿液和血浆的 BKV DNA 载量。 当受者 血清 7 肌酐不明原因的持续升高或尿液 PCR 检测 BKV DNA 载量?10 copies/ ml 或血浆 2早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究 中 文摘 要 5 载量?10 copies/ ml 时 建议进行肾组织穿刺检查。 结果发现,92 例肾 移植受者中, 28 例受者尿液 BKV 阳 性 (BKV 尿症, 占 30.44%),11 例血浆 BKV 阳性 (BKV 7 血症,占 11.96%)。BKV 尿症患者的 BKV DNA 载量中位值为 1.37×10 5 8 (3.53×10 -5.69×10 )copies/ml ,BKV 血症患 者的 BKV DNA 载量中 位值为 4 3 5 4.05×10 (8.98×10 -2.31×10 )copies/ml , 且同 时伴有 BKV 尿症。 移 植肾脏穿刺 组织 学检查发现, 共有 4 例患者确诊为 BKVN , 其中 3 例处于 A 期,1 例处于 B 5 5 5 期。BKVN 患者的血浆 BKV DNA 载量中位 数为 3.81×10 (2.62×10 -7.93 ×10 ) copies/ml 。 通过监测血 清肌酐发现, 患者诊断为 BK 病毒血症时的血 清肌酐 中位 值 为 167.85105.70-203.10 μmol/L ,与诊断前 的 102.1684.93-119.5 μmol/L 相比 显著升高,具有统计学差异(P0.001) ;BKV 尿症患者血清肌酐的变化无统计 学差异。 二、早期规律监测 BKV 活化情况的前瞻性研究 收集 2011 年 3 月- 2011 年 4 月在我移植研究所 进行同种异体肾移植术的 117 例受者 ( 其中男性 77 例(65.81% ) , 女性 40 例(34.19% ) , 平均 (39.85 ?11.62) 岁 )的 EDTA 抗凝血 3-5ml 。应用实时定量 PCR 方法分别于术后 0.5 ,1,3,6, 9,12 个月共 6 个时间 点 测定肾移植受者 血浆 BKV DNA 载量。 同 时监测患者的 血清肌酐值和免疫抑制剂药物浓度。 根据监测结果, 适时 降低免疫抑制剂剂量 剂 量 等临床干预并建议行 移植肾穿刺活组织检查。 结果发现,117 例患 者中 , 发生 BKV 血症 25 例(21.37% ) ,中位时间为术后 3 个月(1-6 个月) ,BKV DNA 载 3 3 4 量 中位值为 6.2×10 (3.28×10 -2.7×10 ) copies/ml 。 确诊 BKVN 患者 1 例 (0.086%), 时间为移植后 8 个月。BKV 血症患者在 术后 第 3 个、6 个月、9 个 月时 的血清肌 酐值 与正常患者相比, 具有明显统计学差异 (P 值均0.05) ; 通过多变量的 Logistic 回归分析,对 BKV 血 症发生的危险因素如肾移植受者性别、年龄、免疫抑制剂 (FK506 和 CsA)、 MMF 、 免疫抑制诱导方案、 急性排斥反应、 肺炎、 DGF 、 CMV 等进行多因素参数统计分析 , 发现 FK506 与 BKV 血症有显著的相关 性, P0.018, 0.05), 未发现其他因素与 BKV 血症有明显 的相关性(P0.05);BKV DNA 载 量在 FK506 和 CsA 两 种治疗组中相比, 具有明显的统计学差异 (P0.05) ; 降低 免疫抑制剂 剂量后发现,随着 FK506 药物浓度的降低,血浆 BKV DNA 载量和 血清肌酐水平呈现同时下降趋势;而 CsA 血 药浓度降低后,血浆 BKV DNA 载 量和血清肌酐水平并未呈现出同步下降的趋势。 三、BKVN 的临床分析 和治疗策略探讨 共有 5 例患者确诊 BKVN , 发生率为 2.39% 。BKVN 的病理学特点包 括 受感 染的肾小管上皮细胞核内病毒包涵体, 肾小管萎缩、 炎性细胞浸润, 间质纤维化 , 3早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究 中 文摘 要 SV40 T 免疫组化染色阳性。5 例 BKVN 患者 确诊后及时降低免疫抑制剂剂量或 将 FK506 转换为 CsA , 并监测药物浓度使 FK506 血药浓度控制在 4-6ng/ml , CsA 血药浓度控制在 150ng/ml 以下,同时将 MMF 剂量减为?1g/d ,激素 剂量维持不 变(10mg/d);1 例 BKVN 的患者加用来氟米特的治疗。经过平均 3 个月(2-4 个月) 的干预治疗, 患 者的血浆 BKV DNA 载 量转为阴性, 尿液 BKV DNA 载量 5 明显下降(5.58×10 copies/ml ) ,同时血清肌酐水平较前均有下降,说明移植肾 功能有所恢复。 结 论: BKV 活化出现在肾移 植术后的 早期, 发生 BKV 血症时其移植肾功 能 可能受 到一定程度的损伤;FK506 剂量/ 浓度与 CsA 剂量/ 浓度比较,前者 与 BKV 血症 的发生 存在相关性 , 接受 FK506 治疗的患者 可能 更容易发生 BKV 的 活化; 发现 病毒血症后及时 予以降低免疫抑制剂剂量 ,尤其是降低 FK506 的药物浓 度,移 植受者肾功能好转 , 提示在应用 FK506 的移植受者降低免疫抑制药物干 预性治 疗有效 ;早期规律监测 BKV 血症并及时予 以降低免疫抑制剂剂量的治疗 能有效 预防 BKVN 的发生。 关 键词 :BKV ,BKV 血症,PCR 方法,免疫 抑制剂4早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究 英 文摘 要 Early study on BKV activation in patients with renal transplantationAbstract Postgraduate: Xinying Wang Mentor: Progessor: Bingyi Shi Institute: 309th Hospital of the Chinese People’s Liberation Army BK virus BKV, a human polyomavirus, is widespread because its seroprevalence is about 80% among the healthy population.Primary infection typically occurs during early childhood and is usually asymptomatic, and thereafter, BKV largely persists in the kidneys and urinary tract in a latent form. With the effect of immunosuppressants and other factors, BK virus can be reactivated to cause infection, and further leading to the development of the BK virus nephropathy BKVN after renal transplantationThe change in pathology with BKVN is tubulointerstitial injury, and graft loss rate is about 15% to 30%. BKV infection has been recognized as one of the most common viral complications that impact the long-term survival of allograft in renal allograft recipients. Because of the pathogenic mechanism and risk factors associated with the occurrence of BKVN have not been well known and no specific and effective anti-BKV treatment, monitoring of BKV reactiviaton in the early stage of post-transplant and reduction of IS is an essential clinical importanceThe diagnosis of BKV infection is based on the documentation of viral cytopathic effects urinary decoy cells, the virus itself in blood, urine, and/or renal tissue, immunity to virus BKV-specific antibody, and renal histological findings of nephritis. Quantitative analyses of BKV load in urine or blood by PCR have a much higher specificity and are easier to standardize and have been reported largely. But whether it is best to screen for BKV infection in urine or plasma is a matter of debate, and which will be affection of kidney function is unknown, besides, there is no uniform standard monitoring of BK virus and interventions. Based on these problems, we used the PCR method for quantitative detection of BKV DNA load and histopathology detection method for diagnosis of BKVN in renal transplantation reciptients ,the effect of BK virus activation on renal function was also evaluated in this study. Then we screened for BKV DNA in plasma regularly after the early stage 5早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究 英 文摘 要 of transplantation, the regular earlier monitoring and discussion of the diagnosis and treatment program is discussed. Our findings may provide the theoretical and practical basis for clinically control the occurrence of BKVN effectively1. Influence of BK virus activation on the renal allograft function 92 recipients receiving renal transplantation during 2010.3-2011.2 were selected as objectives, the urine and peripheral blood samples of them were taken and real-time PCR assays were performed for BKV DNA 63 men and 29 women; mean age 41.50?10.50 years. The urine samples about 20ml with sterile tube and the peripheral blood about 3-5ml with EDTA tube was collected from the recipients and sended to test immediately. At least three consecutive specimens for each patient were tested, being the experimental data. Among 92 recipients, BKV viruria occurred in 28 30.68% patients, BKV viremia occurred in 11 11.36% patients. The median viral 7 5 8 load of BKV in urine were 1.37×10 (3.53×10 -5.69×10 )copies/ml, and the median 4 3 5 viral load of BKV in plasma were 4.05×10 (8.98×10 -2.31×10 )copies/ml. Graft biopsy showed BKV N in 4 patient ,3 of them are stage A ,1 is stage B. The plasma 5 5 5 median viral load was 3.81×10 (2.62×10 -7.93×10 )copies/ml in BKVN. The serum creatinine concentrations were higher when BK viremia occurred P0.052. Regular monitoring for BK viremia during the early post-transplant period Recipients receiving renal transplantation during 2011.3-2012.4 were selected as objectives, the peripheral blood samples of them were taken and real-time PCR assays were performed for BKV DNA 77 men and 40 women; mean age 39.85?11.62 yearsWe screened for BKV infection at months 0.5, 1, 3, 6, 9, and 12 post-transplant, renal function, and immunosuppressive regimen were also evaluated. Graft biopsy was performed according to the KDIGO. BKV viremia occurred in 25 patients 21.37%, the median time was 3 months 1-6 months after transplantation, the BKV DNA load 3 3 4 was 6.2 × 10 3.28× 10 -2.7 × 10 copies/ml. 1 patients 0.086% had diagnosed as BKVN after 8 months of transplantation. The serum creatinine value in BK viremia patients was statistically significant difference compared with normal patients at months 3, 6 and 9 post-transplantP0.05, respctively. By multivariate logistic regression analysis, the risk factors for BK viremia such as kidney transplant recipients, gender, age, immunosuppressants FK506 and CsA, MMF, immune induction program, acute rejection, pneumonia, DGF, CMV had been analyzed, founding FK506 and BK viremia are of significant correlationr0.22,P 0.018,0.05, and no significant correlation P0.05 between the other factors with 6早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究 英 文摘 要 BK viremia; BKV DNA load in FK506 treatment group showed a statistically significant difference P0.05 compared to CsA treatment group. There was a trend in FK506 with serum creatinine and viral loads, but not in CsA3. Histological feature of BKVN and analysis of therapy methods 5 in 209 patients occurred BKVN 2.39%.The histological hallmarks were intranuclear virus inclusions seen in epithelial cells ,interstitial inflammation and SV40T is positive. After the induction of IS or transform from FK506 to CsA, tacrolim us level was 4-6ng/ml, CsA level was under 150ng/ml, MMF?1g/d. After 3months (2-4 months )of therapy, the plasma viral load was negative,and serum creatinine was increased when viremia was discovered, and the renal function was improvedConclusion BK virus reactivation is an early complication after renal transplantation. Graft function was impaired among patients with BK viremia, FK506 concentration were correlated with plasma BKV DNA load, compared to CsA; This suggested patients with FK506 treatment may be more prone to the activation of BK virus; Reducing immunosuppressant when the discovery of viremia, in particular the reduction of the concentration of FK506 in the transplant recipients, the renal function of repients had improved, suggesting the application of reduction of FK506 immunosuppressive drug intervention treatment is more effectively; Regular monitoring BK virus in renal transplant recipients and clinical intervention based on plasma PCR results can prevent transplant kidney damage effectivelyKey words:BKV, BKviremia, PCR, immunosuppressive induction 7早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究前言 前言 BKV 属于多瘤病毒家 族, 直径约 40?44nm , 其 DNA 双链长度约 为 5. 3kb, 呈 闭合环 状,无 包壳 。BKV 基因组 分为三 个区 域,早期 编码区 、晚 期 编码区和非 编码调控区。 其中早期编码区编码一些调节蛋白 (小 t 抗原, 大 T 抗原 和 T’ 抗原) ; 晚期编码区编码 VP 结构蛋白和未知蛋白;非编码调控区负责控制 DNA 的复制 [1] [2,3] 和表达 。在正常人群 中 BKV 的血清阳性率 超过 80% 。BKV 初次感染 主要 发生在儿 童时期,仅 表 现为弱的 上 呼吸 道感染 症状,随后可长 期潜伏 在人体肾小 管上皮细胞中 , 通常情况下 并不致病。 当机体 免疫功能受损或受到抑制时,BKV 能够从潜伏状态发生再次活化引起病症, 发生 出血性膀胱炎, 输尿管狭窄, 血管 病变, 肺炎, 脑炎, 视网膜炎甚至多器官衰竭。 在肾移植受者中, 活化后的 BKV 能够侵袭移植肾脏, 引起肾小管间质损伤导致肾功能恶化,即 BK 多 瘤病毒肾病 (BKVN ) 。因此,它 已 逐渐成为影响移植物长期存活的重要因素。BKVN 作为 一种严重的肾移植术后并发症 的报道最早出现在 1990 年中期。 在最近几 十年中, [4] BKVN 的 发病率约为 1 %-10%,能引起 15%- 到 30% 的移植肾丢失 。因此,如 何早期而准确 的监测 出肾移植术后 BKV 的活 化 情况,从而及时予以干预治疗已 成为判断预后 的关键。 BKV 的实验室检测包 括以下几种方法: 尿液病毒包涵体(Decoy 细 胞)检 测, 尿液或血浆中 BKV DNA 的 PCR 定量检测,BKV 特异性抗体 检测, 电子显 微镜检测以及病理组织学检 测。检测 Decoy 细胞方法的阴性预测值 虽然较高, 但 阳性预测值较低(20% ) , 而 且 不 能 区 分 多瘤 病 毒 的 型 别 , 加 之相关 的 技 术 要 [5] 求较特殊,所以限制了 其临床应用 。病理学 检测是 诊断 BKVN 的 金标准, 当 出现 BKV 引起的肾小 管上皮 细胞病变效应 和多瘤病毒抗原免疫组织化 学染色阳 性时能够进行确诊 。 但该法属于侵入性检查, 而且在早期阶段侵犯部位往往仅限 于 髓质中 ,常导致假阳性的发生,因此达不到早期诊断的目的。 目前, 检测尿液和血液中 BKV DNA (BKV 尿 症和病毒血症) 的 PCR 方法, 已经被国外各大型器官移植中心 进行研究 而广泛应用于临床检测 中。 该方法 具有较高 的阳性预测值和阴性预测值, 对于筛查和治疗 BKV 感染和 BKVN 达到 [6,7] [8] 了较好的效果 。BKV 感染呈现病毒尿症- 病毒血症-BKVN 的过 程 ,Babel 等 [9] 人 的研究认为持续 的 BKV 尿症对于预测 BKV 血症具有 100% 的阳性预测值和 94% 的阴性预测值,可以作 为可靠性的指标来早期识别发展为 BKVN 的高风险 [10,11] 状态。Howell 和 Nickeleit 等人 则证明 出 BKV 血症与 BKVN 密切相关,也 有 研 究 指 出 在 BKVN 发 展 时 期 , 血 浆 BKV DNA 载量从 0 增 加 到 3 5 [12] [13] 1×10 -1×10 copies/ml 。Chung 等人 利用定 量 PCR 技术, 证实出 当血浆 BKV 8早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究前言 4 DNA 载量为 1×10 copies/ml 时, 对于预测 BKVN 的敏感性和特异性分别 为 100% 7 和 97.4% , 当尿液 BKV DNA 载量为 1×10 copies/ml 时, 其预测敏感性和特异性 [14,15] 分别为 100% 和 91.8% 。Costa 和 Viscount 的研究小组同样证实 了血浆 BKV 4 DNA 载量为 1×10 copies/ml 时,能够确定出发 展为 BKVN 的高风险 。 2003 年,一项 共识会议推荐,肾移植患者在术 后前两年内应至少 每 3 个月 进行一次 BKV 的检测 , 之后每年 进行一次 检测, 以早期发现 BKVN 并防止移植 [8] 肾的失功 。 不过 , 这种 检 测 策略 的 建 议依 赖于 各 中 心的 实验 资源 和发生 BKV [16] 活化 的 中位时 间。Almeras 的研究小组 分别 于术后半 年每 月对肾 移 植患者进 行 血浆 BKV DNA 的检测 , 发现 BKV 血症发生 的 中位时间为 90 23-214 天。 国内 学者报道的 BKV 尿症 和血症的中位时间分别为 术后 2 个月1-12 个月 和 3 个月 [17] [9] 1-11 个月 。Babel 等人 于肾移植术后 0.5,1,2,3,6,9 和 12 个月进行 检测 ,得出 BKV 尿症 和病毒血症的起始发生时间分别 为移植后 5(2-41)和 10 [7] (5-51)周 。Brennan 等人 通过 连续 16 周 进行每周 BKV 复制的监 测,也得到 类似的发现,开始出现 BKV 尿症和血症 的 时间 分别为 40.5 和 60 天。 因此,加 强早期移植后的监测 频率对早期发现 BKV 活 化和预防 BKVN 具有 重要的作用。 到目前为止, 关于 BKVN 致病因素的研究较 多, 但具体发生机制尚不明确。 一些研究表明, 此发病过程 需要多种因素共同参与, 如宿主本身, 靶器官, 和病 毒 等多方面。也有学者认为可能是 受到新兴 免疫抑制剂的影响,因为 在 20 世纪 80 年代中期,环孢素 A (CsA) 应用于移植领域后并未伴随着 BKVN 发生率的 提高。但是随着 他克莫司 (FK506 )和霉酚酸 酯(MMF )自 1990 年得到广泛应 [7,18] 用 后, 出现了大量的关于 BKVN 的报道。Brennan 和 Hirsch 等人 对比不同免 疫抑制剂方案对肾移植受者 BKV 活化情况的 影 响时,发现在 FK506-MMF 治疗 组中患者的 BKV 尿症 和病毒血症的发生率比在 CsA-MMF 治疗组中 要高,单独 对比 FK506 和 CsA 时 这种差异尚不明显。目前,也有研究指出 急性排斥反应 后 的激素冲击治疗和胸腺免疫球蛋白的免疫诱导治疗也会增加 BKV 发 生活化的风 [19] 险 。 近年来 ,对于 BKV 感 染的治 疗研究 已经 取得 了一些 欣喜的 结果 。Almeras [16] 等人 对 BKV 血症患者进行降低免疫抑制剂剂量的治疗后, 多数病毒血症最终 [7] 转阴,BKVN 的发生率 也显著下降。Brennan 等人 在进行的为期 1 年的随访研 究中, 通过降低免 疫抑制剂剂量后, 也得到了类似的结果, 即大多数患者 的 BKV [20] 血症消失。对于 确诊 为 BKVN 的患者 ,Josephson 等人 介绍了加用 来氟米特 LFN 进行治疗,使患 者中的 BKV DNA 载量 显著 下降,肾功能得到一定 改善。 另外一项来自 匹兹堡大学医学中心的研究 数据 指出, 应 用低剂量的西多福韦 [21] (cidofovir )也可成功地治疗 多数患者的 BKVN 并使肾功能维持在 稳定水平 。 9早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究前言 [22] 但有报道发现 西多福韦 具有一定的肾毒性, 可能会限制其临床应用 。 基于以上研究背景,将本研究设计 为以下三 部分:?观察肾移植术后 BKV 活化 情 况 对 受 者 肾 功 能 的 影 响 ? 早 期 规 律 监 测 肾 移 植 受 者 BKV 血症 的 前 瞻 性 研究:观察 肾移植受者术后 1 年体内 BKV 血 症的发生 情况,分析 BKV 感染的 危险因素, 探讨早期监测和及时干预治疗对于 BKVN 的预防效果 ?BKVN 病理 特点及相关临床因素分析: 观察 BKVN 的发 展过程、 预后, 对 BKVN 的经 验性 治疗进行总结 。 通过对肾移植术后患者进行 BKV 活化情况的 监测, 以期早期而精确的诊断 出 BKV 活动性感染,为及时给予相应的治疗 措施以及判断预后提供有价值的 研 究 依据。 10早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究正文第 一部分 BKV 活化 对移植 肾功能影 响的研 究 BKV 属于多瘤病毒家 族属 , 在儿童时期发生初次感染后, 常潜伏于肾小管上 皮细胞而 未致病。肾移植术后,在免疫抑制剂等多种因素下,BKV 能发生活化 引起 BK 病毒肾病(BK virus nephropathy, BKVN ) 。目前,检测 BKV 活化情况 的方法有: 尿液细胞学检查, 方法较为简便, 易于筛查, 但敏感性和特异性不高; 实时荧光定量 PCR 方 法,快速简便,敏感性和特异性较高,易于进行标准化; 组织病理学检查, 为金标准, 根据普通染色和 SV40 T (simian virus 40 T antigen ) 免疫组织化学染色结果,能对 BKVN 进行确 诊和分级。 在本 部分研究中,我们利用实时定量 PCR 方法对 92 例肾移植患者 的尿液和 血浆进行 BKV DNA 载量检测,血清肌酐水平监测, 同时根据监测结果进行移 植 肾 穿 刺 组 织 病 理 学 检 查 , 了解 BKV 活 化 对 移 植 肾 功 能 的 影 响 , 为 早 期 防 治 BKVN 提供依据。 1 实验 1.1 主要试剂 BKV DNA 定量检测试 剂盒 (本移植研究所自行研制, 专利号:201110152683.9 , 试剂盒成分见 表 1) PBS 磷酸盐缓冲液(福州迈新生物技术开发有限公司) 柠檬酸盐抗原修复液(福州迈新生物技术开发有限公司) TM 即用型免疫组织化学 EliVision -plus 检测试剂盒(福州迈新生物技术开发有限 公司) 鼠源 性 SV40 T AgH-1 单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology 公司) HE 染色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司) PAS 染色试剂盒(福州 迈新生物技术开发有限公司) Masson 三色染色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司) DAB 显色液(福州迈 新生物技术开发有限公司) 表 1 BKV 试剂 盒成 分 序号 产品组成 主要成分 配给量1 BKV 浓缩 液 PEG 1200 μ l ×2 管2 BKV 裂解 液 Tris-HCl 、EDTA 1200 μ l ×2 管3 BKV PCR 反应 液 引物、探 针、dNTP 1020 μ l ×1 管4Taq 酶 Taq 酶 11 μ l ×1 管5 BKV 阴性 质控 品 超纯水 600 μ l ×1 管 5 6 BKV 定量 标准 品 I 体外纯化 质粒 5 ×10 copies/ml 50 μ l ×1 管 6 7 BKV 定量 标准 品 II 体外纯化 质粒 5 ×10 copies/ml 50 μ l ×1 管 11早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究正文7 8BKV 定量 标准 品 III 体外纯化 质粒 5 ×10 copies/ml 50 μ l ×1 管 8 9 BKV 定量 标准 品 IV 体外纯化 质粒 5 ×10 copies/ml 50 μ l ×1 管 1.2 主要仪器 TDZ5-WS 多管架自动平衡离心机(湘仪离心机仪器有限公司) 旋涡振荡器(北京同正生物技术发展公司) Allegra 21R 台式低温离 心机(Beckman Coulter ) K30 干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司) ABI9700 实时定量 PCR 检测仪 Bio-Rad -80 ?超低温冰箱(SANYO ) JT-12F 电脑生物组织脱水机(香港兴万 电子仪器(厦门)有限公司) JB-L5 生物组织包埋机 (武汉俊杰电子有限公司) YD-B 生物组织烤 片机 (金华市益迪医疗设备厂) LEICA RM2126 石蜡组 织切片机(Leica ) OLYMPUS BX51 显微 镜(Olympus ) Galanz 微波炉(格兰仕公司) 电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司,DHP-9082 型) 。 2 实验方法 2.1 研究对象 2010 年 3 月-2011 年 2 月在我移植研究所进行同种异体肾移植术的 92 例受 者作为研究对象。 入选标准:肾移植受者年龄范围 18-60 岁;自 愿接受尸体供肾或有 HLA 错 配的亲属供肾; 术后常规选择钙调神经蛋白抑制剂 (CNI )+ 抗代谢类 药物+ 激素 的三联免疫抑制剂方案; 早期排斥反应时除外; 所有入选对象在移植术前签署知 情同意书, 并获得解放军第 309 医院伦理委员会批准, 自愿并能够参加术后随访 研究的全过程。 2.2 样本收集 血浆样本收集:EDTA 抗凝全血(3-5ml ) ,室温 2h 内 1600r/min 离心 5min 得到血浆, 转移到 1.5ml 灭菌离心管中备用。 尿液样本收集: 收集中段晨尿 20ml (不超过容器体积的 2/3 )密封送检。标本不能立即检测时置于-80 ?冰箱保存。 2.3 PCR 方法检测肾移 植受者尿液和血浆中的 BKV DNA 2.3.1 血浆 BKV DNA 制备 1)在 1.5ml 离心管中加入 100μl 待测样本, 然后加入 50μl BKV 浓 缩液,振 12早期肾 移植 术后 受 者 BK 病毒活 化的 研究正文荡 15 秒混匀; 2)将上述离心管放入台式离心机,13000rpm 离心 10min 后取出; 3)小心吸出 150μl 上 清液并弃去,保留沉淀; 4)向离心管中分别加入 25μl BKV 裂解液, 然后用吸头对准沉淀所在位置, 将其挑离管底,并吹洗 5 次(关键步骤) ; 5)振荡 15 秒将沉淀充分打散; 6)100?条件下温育 10min ; 7)13000rpm 离 心 10min 后将上清液转移至新的离心管,该上清液即纯化的 DNA 溶液。 2.3.2 尿液 BKV DNA 制备 1 将尿液送检管振荡 15s ,彻底混匀(关键步骤) ; 2 取其中 1ml 至 1.5ml 离心管中,13000rpm 离心 10min 后弃去上清; 3 加入 50μ l BKV 裂 解液, 然后用吸头对准沉淀所在位置, 将其挑离 管底, 并吹洗 5 次(关键步骤) ; 4 振荡 15 秒将沉淀充分打散; 5)100?条件下温育 10min ; 6)13000rpm 离心 10min 后将上清液转移至新的离心管,该上清液即纯化的 DNA 溶液。 2.3.3 引物与 PCR 反应 体系 1 针对 BKV 基因 组设 计的特异性引物分别为: 5’-AGAACTGCTCCTCAATGGATG-3’ ,5’-AGCTGCCCCTGGACACTCT-3’ 。 Taqman 荧光探针为 :TGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCA ,5’ 端用 6- 羧 基荧光素 (6-carboxyfluorescein,FAM ) 标记,3’ 端标记的淬灭基团是黑 洞淬灭剂 1(Black Hole Quencher 1,BHQ1)。 2 PCR 反应体系包括 10×反应缓冲液 2.5μ l ,引物 0.5μ l 和 0.2