镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇对心肌细胞Ca^2＋通道的阻滞作用

镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇对心肌细胞Ca^2＋通道的阻滞作用 镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇对心肌细 胞Ca ，通道的阻滞作用 中国预防医学杂志2O04年8月第5卷第4期ChinPreyMed.August2004.Vo1.5No.4?241? 镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇对心肌细胞 Ca2+通道的阻滞作用 彭双清,杨进生 【论着】 【摘要】目的观察镰刀菌毒素单端孢霉烯族化合物脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对培养心肌细胞ca2通道单 通道电活动的影响.方法取新生1—2日龄Wistar大鼠,分离心肌细胞,培养基为80%DMEM与20%小牛血清,于 37~C,在含5%co2与95%空气的培养箱内进行培养,于培养24—48h期间进行实验记录.采用贴附式膜片钳技术, 记录心肌细胞B,L,T三型Ca2通道单通道电活动为加入毒素前对照,然后向培养基中加入1n1g?ml,DON,以观察 DON对心肌细胞ca2通道单通道电活动的影响.结果DON浓度为1IIlg?rnl-1时,心肌细胞B,L,T三型ca2通道 均受到明显的阻滞.其阻滞作用现在使B,L,T三型Ca2通道的开放时间分别缩短 47.3%,42.1%和17.1%,关 闭时间分别延长283.3%,92.8%和40.7%,使通道的开放概率分别下降77.8%,71.1%和42.8%.而对流过B,L, T三型Ca2+通道的Ba2流幅值均无明显影响.结论DON能抑制大鼠培养心肌细胞的Ca2通道. 【关键词】镰刀菌属;毒素类;脱氧雪腐镰刀菌烯醇;心肌,细胞,培养的;钙通道;膜片钳术 moe~agEffectofDeoxyni~enol(DON)OnCaldumChannelsinCulturedCa~omyoeytesofRatsPENG Shuang一, YANGJin—sheag.&lnst/tuteofPharmaco/ogyandTox/co/ogy,8e0”/~g100850,China 【Abaract】ObjectiveTostudytheeffectofdeoxynivalenol(DON),amycotoxinp~ucedbyFusar/umgram/~,Oil calciumchannelsinculturedcardiomyocytesofrats.MethodsVentficularmyocytesfromneonatalWist arratswerecultured,andthe effectsofDONonthesinglecbannelactivitiesofB—type,L—typeandT—typeofCa2channelswerestudiedbyusingcell—attached clamptechniqueafter24—48hoursofculture.TheclmnnelopeningofL—andT—typecalciumwereevokedbyadepolarizingtestpulse from一50mVto+10mVandfrom一70mVto一10mVrespectively.While.theB—typecalciumchannelwasrecordedat一60mV withoutdepolarizingtestpulse.ThesinglechannelrecordingsweremadebeforeandafteradditionofDO Ninthebathsolutionatcono~n? trationoflmg.ml,.ResultsDONatdoseoflmg.mlsignificandyinhibitedtheactivitiesofthethreetypes ofCa2chatlildS.The opentimeofB—type,L—typeandT—typeofCa2channelsWasshortenedby47.3%,42.1%and17.1%r espectively.Theopen— stateprobabilityofB—type.L—typeandT—typeCa=channelsWasdecreasedby77.8%,71.1%and42. 8%respectively,where? astherewerenosignificantvariationsinthe帅pKtudeofcurrentflowingtt~ougl1theCa2channels.ConclusionsDONinhibitthe activitiesofcalciumclmnnelsofculturedcardiomyocytes,suggesttingthecardiotoxicityofDONmayb eduetoblockofcalcium channels. ywords】Fusarium;Toxins;Deoxynivalenol;Myocardium,Cells,cultured;Calciumchannels;Patch—clamp techniques 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是 由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)所产的单端 孢霉烯族类化合物,它是粮食和动物饲料中污染最为 广泛的天然毒素之一….由于它可以引起猪的呕吐效 应,因而也称其为呕吐毒素(Vomitoxin,VT)J. DON非常稳定,在粮食贮存和加工过程中难以降解, 从而造成对人畜的毒性危害.4】.DON能抑制细胞分 裂,抑制RNA和DNA的合成,抑制或诱导细胞凋 亡【3J.已有研究表明,对我国危害十分严重的克山 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30340004) 作者单位:军事医学科学院毒物药物研究所.北京100850 病和大骨节病的病因可能与粮食中镰刀菌毒素的污染 有关[5?.心肌病变是克山病的主要特征之一【引.与 DON同属于单端孢霉族化合物的T一2毒素可致多种 动物心血管功能障碍.9】.以前我们曾发现,大鼠 T一2毒素亚急性中毒可出现明显的心肌病变u,并 且在培养心肌细胞可抑制兴奋性膜电位与Ca2通 道【11?123.目前未见有DON引起心肌损伤的文献报 道,但我们以前的工作已经观察到DON能抑制心肌 细胞跨膜电活动,间接表明其对Ca2通道具有阻滞 作用u3I.本实验应用膜片钳技术,在培养的Wistar 大鼠乳鼠心室肌细胞的膜片上,观察B型,L型和T 中国预防医学杂志2004年8月第5卷第4期ChinPreyMed,August2004,Vo1.5?.4 型Ca2通道的单通道活动,以进一步阐明DON对心 肌细胞Ca2通道的阻滞作用及其机制. 1和方法 1.1药品与试剂:DON,军事医学科学院毒物药物 研究所分离提取,纯度99.9%以上;BaC12,开源化 学试剂厂产品;天门冬酸钾,上海生物化学试剂商店 产品;胰蛋白酶,美国Sigma产品;培养基(DMEM, DLIlbec0o’SModifiedEagleMedium),LifeTechnologies Inc,美国;小牛血清,军事医学科学院放射医学研 究所产品;聚苯乙烯培养瓶,GreinerLabortechnikInc, 德国.新生1,2d龄Wistar大鼠,性别不限,实验 等级为二级.倒置显微镜,Olympus,日本.浸浴液 (mmol?LI1):天门冬酸钾140,EGTA10,Hepes10, pH7.4;电极充灌液(mmol?L):BaC12110,Hepes 10,pH7.4.DON用浸浴液稀释至实验所需浓度. 1.2心肌细胞分离与培养:取1,2日龄Wistar大 鼠,在无菌条件下取心室肌,用含有0.1%胰蛋白 酶,0.1%牛血清白蛋白的无Ca2,MgHanks液分 离心肌细胞,置于含有80%DMEM与20%小牛血清 的培养基内,在37~C含5%CO2,95%空气的孵箱中 培养,2h后做贴壁分离,于培养24—48h期间进行 实验记录. 1.3电极制备:玻璃微电极尖端约1.5/an,用电极 充灌液充灌,电阻1.2,2.0MI2.用疏水性绝缘物质 硅酮树酯涂于微电极表面,用抛光仪将微电极尖端进 行热处理,使之光滑. 1.4Ca2单通道活动的记录:用贴附式膜片钳技术, 在培养的大鼠心肌细胞上记录B,L,T三型Ca2通 道的单通道活动.由一50mV保持电压阶跃至+1O mV,诱发L型Ca2通道活动,持续256ms;由一70 mV阶跃至一10mV,诱发T型通道活动,持续 256ms;在一60mV保持电压下,记录B型通道 的自发性单通道活动,膜片钳放大器(Dagan8800, usA)与示波器(VC10Kohden,Japan)的低通滤波 器载止频率分别设置在1kHz和10kHz.微电极与细 胞膜之间的封接电阻大于lOGQ. 1.5数据采集处理与统计:每型通道观察5个 心肌细胞,每个Ca2通道连续采样5O条原始曲线, 删除原始曲线中阶跃命令的电容伪迹,并修平基线. 用Gauss曲线拟合采样点电流序列密度直方图的方 法,得出流过Ca2通道的Ba2流幅值.用指数曲线 拟合开放或关闭时间分布直方图的方法,得出平均开 放与关闭时间.通道开放总时间除以总采样时间得出 开放概率.所有数据均用露?s表示.加入毒素前后 效应差异的比较采用配对资料的t检验. 2结果 向浴液中加入DON1mg?rnl,,结果显示心肌细 胞三型Ca2通道均受到抑制.如表1所示,DON使 B型Ca2的开放概率下降77.8%,开放时间缩短 47.3%,关闭时间延长283.3%;使L型的开放 概率下降71.1%,开放时间缩短42.1%,关闭时间 延长92.8%;使T型Ca2的开放概率下降42.8%, 开放时间缩短17.1%,关闭时间延长40.7%.DON 对心肌细胞B,L,T三型通道的Ba2流幅值均 无明显影响. 表1DON对培养心肌细胞B,L,T三型Ca2通道参数的影响 注:与相应对照组比较,一P<O.01,差异有非常显着性. 3讨论 本实验用膜片钳连细胞电压钳法,证实DON对 心肌细胞三型Ca2通道具有明显的阻滞作用.既往 实验已经证实,心肌细胞上存在着3种不同类型的 通道,即L型Ca2通道,T型Ca2通道和B型 通道【”酬.L型Ca2通道开放时间长且单通道 电导大:T型Ca2通道开放时间短,它的激活电压 较负,单通道电导较小,即微观钙流的幅度较小,在 离细胞膜片上T型通道存活的时间较长;B型 Ca2通道是一种自发发放的Ca2通道,因而被称为 背景Ca2通道,当心肌细胞膜被钳制在0,180mV 的过程中,其自发发放的概率与电导均呈电压依赖性 加大.本实验结果表明,DON对心肌细胞B,L,T 中国预防医学杂志2OO4年8月第5卷第4期ChinPreyMed,August2OO4,Vo1.5No.4.243. 《中国预防医学杂志》来稿须知 《中国预防医学杂志》为卫生部主管,中华预防医学会 主办的综合性预防医学学术期刊,国内外公开发行.本刊服 务于广大会员和从事预防医药卫生科技人员,以促进国内外 预防医学学术交流和医学科学发展,提高全民族的健康水平. 本刊热烈欢迎广大会员,医药卫生科技人员以及从事预 防医学工作者踊跃投稿,现将来稿的一般要求如下. 1.征稿范围:本刊刊登内容涵盖预防医学的各个方面, 如:流行病学,寄生虫学,社会医学,环境卫生,劳动与职 业卫生,食品卫生,公共营养,儿少卫生,放射卫生,预防 保健,卫生毒理,消毒杀虫灭鼠及药械,卫生统计及与预防 医学密切相关的新技术,新方法,卫生管理及学会工作. 2.来稿应具有先进性,科学性和逻辑性,实验合理, 论点明确,资料可靠,数据准确,文字简练,层次清楚.来 稿一式两份,若有条件最好电脑打印. 3.来稿须附第一作者单位推荐信.推荐信应注明对稿件 的审评意见,以及无一稿两投,不涉及保密,署名排序无争 议等项. 【读者?作者?编者】 4.所涉及的课题如取得国家或部,省级以上基金或 属攻关项目,请脚注于文题页左下方.如:”基金项目:国家 自然科技基金资助项目(39570188);国家’九五’科技攻关 资助项目(96—906—05—01)”. 5.作者在接到本刊回执后3个月内未接到稿件处理通知, 表明该稿正在审理中.作者如欲改投他刊,请先与本刊编辑 部联系,请勿一稿两投. 6.来稿一律文责自负,自留底稿,本刊对决定刊用的文 稿可作文字修改,删节.对不采用稿件一般不寄还,但原始 照片一律退还,若作者需退还原稿时,请在来稿时声明. 7.稿件刊出后版权归中华预防医学会所有,并酌付稿酬, 赠当期杂志1册. 8.来稿须付稿件处理费30元,稿件确认刊载后需按通知 单数额付版面费. 9.来稿请寄:北京市地安门邮局55号信箱《中国预防医 学杂志》编辑部.邮编:100009电话:010—64015653. 《中国预防医学杂志>编辑部