罗库溴铵复合维库溴铵或阿曲库铵对骨骼肌成人型和胎儿型乙酰胆碱受体的作用

罗库溴铵复合维库溴铵或阿曲库铵对骨骼肌成人型和胎儿型乙酰胆碱受体的作用 罗库溴铵复合维库溴铵或阿曲库铵对骨骼 肌成人型和胎儿型乙酰胆碱受体的作用 2TianjinMedJ,Mar2008,Vol36No3 罗库溴铵复合维库溴铵或阿曲库铵对骨骼肌成人型和 胎儿型乙酰胆碱受体的作用 安广权赵雪莲高英超 摘要目的:应用全细胞膜片钳研究罗库溴铵复合维库溴铵或阿曲库铵对骨骼肌成人型(,一nAChR)和胎儿型 (一nAChR)乙酰胆碱受体的作用.方法:通过脂质体转染法在HEK293细胞表达,一nAChR和一nAChR.分别研究 罗库溴铵,维库溴铵和阿曲库铵各药对两种受体亚型的作用.再以各药等效浓度混合,观察罗库溴铵复合维库溴铵 或阿曲库铵混和液对两种受体亚型的作用.结果:罗库溴铵,维库溴铵 和阿曲库铵呈浓度依赖性抑制乙酰胆碱对e— nAChR和一nAChR的激动作用.应用等效线图发现罗库溴铵复合维库溴铵对,一nAChR呈现协同作用,对一 nAChR呈现相加作用;罗库溴铵复合阿曲库铵对,一nAChR和一nAChR均为协同作用.结论:不同化学结构肌松药 对,一nAChR和一nAChR的抑制程度不同,而,一nAChR和一nAChR对一种肌松药的亲和力也有差异.不同化学结 构的罗库溴铵复合阿曲库铵对,一nAChR和一nAChR均为协同作 用;相同化学结构的罗库溴铵复合维库溴铵对,一 nAChR呈现协同作用,对一nAChR呈现相加作用. 关键词罗库溴铵维库溴铵阿曲库铵药物协同作用受体,胆碱能转染 膜片钳术脂质体 EffectsofRocuroniumCombinedwithVecuroniumandAtracuriumonAdult—.andEmbryonic—. MuscularNicotinicAcetVIcholineReceptors ANGuangquan,ZHA0Xuelian,GAOYingchao DepartmentofSecondSurgery,TheForthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Sho’iazhuang050011,China AbstractObjective:Thisstudywasdesignedtoexaminetheinteractionbetweenrocuroniumandvecuroniumor atracuriumonadult—andembryonic-muscularnicotinicacetylcholinereceptorswi也wholecellclamppatch.Methods:The adult-andembryonic-nicotinicacetylcholinereceptorswereheterologouslyexpressedinHEK293ceUs.Peakcurrentswere recordedinHEK293ceUstreatedbyrocuronium,vecuronium,atracuriumindividuallyusingwholecellpatchclamp technique.Drugcpmbinationscontainingequipotentconcentrationsofrocuroniumandvecuroniumorrocuroniumand atracuriumweretestedanddose-responsecurvesweredetermined.Results: Allcompoundstestedaloneandin combinationproducedrapidandreadilyreversible.concentration-dependentinhibition.Twoagentswi也similaror dissimilarstructurewerecombinedinequipotentconcentrations.Isobolographicanalysisindicatedadditiveinteractionfor combinationofrocuroniumandvecuroniumonembryonicreceptorandsynergisticinteractiononadultreceptor,whereas isobolographicanalysisofcombinationofrocuroniumandatracuriumindica and tedsynergisticinteractiononbothadult— embryonic—nicotinicacetylcholinereceptors.Conclusion:TheinteractionsofcombinationofmuscletelaxantsWi也 dissimilarstructure,rocuroniumandatracuriumweresynergistictobothadult-andembryonic-nicotinicacetylcholine receptorsandwithsimilarstructure,rocuroniumandvecuroniumweresynergistictoadult-nicotinicacetylcholinereceptors andadditivetoembryonic-nicotinicacetylcholinereceptors. Keywordsrocumniumvecuroniumbromideatracuriumdrugsynergismreceptors,cholinergictransfeetion patch-clamptechniquesliposomes 肌松药主要作用于神经肌肉突触后膜的烟碱 型乙酰胆碱受体(nAChR),阻断神经冲动的传导, 从而使肌肉松弛.突触后膜的nAChR存在两种亚 型即存在于健康成人肌细胞突触后膜的成人型乙 酰胆碱受体(8一nAChR)和存在于胎儿和某些病理 情况(如肌肉去神经支配和烧伤等)患者的肌细胞 膜的胎儿型乙酰胆碱受体(一nAChR).一些临床研 究发现烧伤患者对琥珀胆碱更敏感而对非去极化 肌松药不敏感【.为了更好反映肌松药与nAChR 的作用,本研究应用脂质体转染技术在HEK293细 胞膜上分别表达8一nAChR和一nAChR两种受体 亚型,从而可在受体水平研究罗库溴铵复合维库溴 铵或阿曲库铵对这两种受体亚型的作用. 作者单位:050011石家庄,河北医科大学第四医院外二科 天津医药2008年3月第36卷第3期 1与方法 1.1培养细胞采用无nAChR表达的HEK293细胞(中科 院细胞所提供)作为重组nAChR的靶细胞.在37?,含5% CO2的培养箱中用DMEM培养基(含10%/J’,牛血清,100U/mL 青霉素和100mg/L链霉素及2mmol/L谷氨酰胺)中培养. 实验时,用0.25%胰酶消化传代于35mm一次性培养肛(密 度为1~105),培养24h. 1.2亚克隆目的基因将含小鼠源性d,p,,8和,基因的 原核细胞表达质粒pSP65ot,pSP65[$,pSP658,pSP64~/和DB— SSK(+),(USASALK,美国索克生物研究所提供)通过亚克隆 技术连接到真核细胞表达质粒pcDNA3.1上.并用基因测序 法鉴定连接是否正确. 1.3HEK293细胞脂质体转染及功能鉴定将含有d,p, 8和,基因的pcDNA3.1质粒,以2:1:1:1的比例与DMRIE—C Reagent(Invitrogen)脂质体混合于1mL无血清培养基,孵育 45min后,铺于HEK293细胞上.培养24h后加入含血清的 培养基1mL,再培养24h后即可应用.同时,另用不含目的 基因的pcDNA3.1质粒转染HEK293细胞作为阴性对照,步 骤同上.应用全细胞电压钳观察乙酰胆碱对转染的乙酰胆碱 受体的作用.不含目的基因质粒转染的HEK293细胞,乙酰 胆碱作用不能激发电流;而含目的基因的质粒转染的 HEK293细胞,乙酰胆碱可激发电流. 1.4膜片钳研究记录转录后细胞的电流前,先以细胞外 液(NaC1140mmo1]L,KC15.4mmo1]L,CaCl21.8mmol/L,MgCl2 1.0mmo1]L,HEPES10mmo1]L,葡萄糖11.1mmo1]L,阿托品1 Ixmol/L,以NaOH调pH至7.4)替换细胞培养基.用PC一1O 微电极拉制仪(Narishige公司,日本)分两步将直径1.6-2.0 mm玻璃微电极毛胚拉制成微电极,再用MF一830微电极抛 光仪抛光.电极内液为(CsC1150mmo1]L,HEPES10mmol/L. EGTA5lnnlo1/L,Mg—ATP2mmo1]L,以CsOH调pH至7.3o 电极电阻为3-5MI1.应用全细胞电压一膜片钳记录电流.电 刺激脉冲的给出及电信号的采人均通过计算机程序 pClamp7.0及digidatal1200转换器接El来完成.采样频率 1000Hz,低通Bessel滤波0.5kHz.电极阻抗3-5MQ,封接 阻抗大于1GI1时,吸破细胞膜成全细胞状态.细胞持续以细 胞外液(1,2mUmin)灌注. 1.5给药模式因HEK293为非兴奋性细胞,从一100,40 mV的钳制电压不影响非去极化肌松药的效应I21.实验膜钳制 电压均设为一80mV. 1.5.1乙酰胆碱对,一nAChR和一nAChR的作用分别以 不同浓度(10nmo1]L,1mmo1]L)乙酰胆碱(Ach)刺激转染后 的HEK293细胞.结果显示100Ixmol/LAch可激动约93%的 受体,属于饱和浓度,因此以下试验均采用100Ixmol/LAch 作为激动药的浓度. 1.5.2罗库溴铵,维库溴铵和阿曲库铵各药单独对,一nAChR 和一nAChR的作用预先用不同浓度罗库溴铵,维库溴铵 和阿曲库铵平衡HEK293细胞30s,再给予100Ixmol/LAch 2o5 激动受体.给不同浓度肌松药前,后作单用乙酰胆碱的对照. 持续给乙酰胆碱4,5s,记录峰电流.两次用药刺激间隔2-3 min,用细胞外液持续冲洗,以减少细胞脱敏感. 1.5.3罗库溴铵复合维库溴铵或阿曲库铵对,一nAChR和 一 nAChR的作用由上述实验得出的罗库溴铵,维库溴铵 和阿曲库铵对,一nAChR和一nAChR作用的50%抑制浓度 (IC)值,按罗库溴铵,维库溴铵和阿曲库铵各自IC的比 值,等效比混合罗库溴铵和维库溴铵,罗库溴铵和阿曲库铵, 再将混合液稀释成不同浓度.混合液给药方式同上. 1.6统计学方法按改良Hill公式计算得罗库溴铵和维库 溴铵各自的浓度效应曲线.采用clampfit8.0进行图形处理和 用origin5.0进行数据分析.得出两药的IC值.数据用面?s 表示.组间比较行单因素方差分析和配对资料t检验,P< 0.05为差异有统计学意义.以等效线图法分析罗库溴铵和维 库溴铵两药间的相互作用.两药混合液的Ic值如在各自的 IC的95%有效区间内,则两药为相加作用;在95%有效区 间以下为协同作用. 2结果 2.1药物单独应用对8一nAChR和一nAChR的作 用罗库溴铵,维库溴铵和阿曲库铵可抑制Ach刺 激转染后的HEK293细胞的8一nAChR或一nAChR 的内向电流,并呈浓度依赖性,见表1,图1. 表13种药物对,一nAChR和—nAChR作用的Ic值 (Ixmol/L,面?s,n=5) P<0.05.P<0.O1 罗库溴铵对8一nAChR的IC?明显大于其对一 nAChR作用的IC?(P<0.01),维库溴铵和阿曲库铵 抑制8一nAChR的IC50值显着小于其对一nAChR 的IC50值(均P<0.01). 维库溴铵抑制8一nAChR的IC?值明显小于罗 库溴铵和阿曲库铵抑制8一nAChR的IC?值(P< 0.05或P<0.01);但对一nAChR作用罗库溴铵的 IC?值明显小于维库溴铵和阿曲库铵对一nAChR 作用的IC50值(P<0.05或P<0.01).8一nAChR对维 库溴铵的亲和力大于罗库溴铵和阿曲库铵,然而一 nAChR对罗库溴铵的亲和力大于维库溴铵和阿曲 2D6 10o O.111O100 阿曲库铵log(1~tool/L) A阿曲库铵对,一nAChR和”y-nAChR的作用 O.001O.01O.11101001010lo5 罗库溴铵log(mol/L) 静 器 量 B罗库溴铵对,一nAChR和”y-nAChR的作用 O.Ol0.1l1Ol0o1000 维库溴铵log(p.mol/L) C维库溴铵对,一nAChR和”y-nAChR的作用 图l肌松药单独应用对,一nAChR和”y-nAChR的浓度一效应曲线 库铵. 2.2药物复合应用对,一nAChR和一nAChR的作 用依照等效线图法分析发现:(1)罗库溴铵复合 维库溴铵对,一nAChR作用,两药呈现协同作用.混 合液Ic卯得出两药各自Ic卯的交点在等效线95% 有效区间以下.(2)罗库溴铵复合维库溴铵对一 nAChR作用,两药呈现相加作用.其两药各自Ic卯 的交点在等效线95%有效区间内.(3)罗库溴铵复 合阿曲库铵对,一nAChR和一nAChR均为协同作 用.混合液的Ic卯得出两药各自Ic卯的交点都在等 效线95%有效区间以下,见图2. 20o 拿150 i 疆0o 50 8哥 TianjinMedJ,Mar2008,Vol36No3 0.05678910lll2l3l4l5 维库溴铵(mol/L) A罗库溴铵复合维库溴铵对,一nAChR作用的等效线图 0102030405060708O 维库溴铵(mol/L) B罗库溴铵复合维库溴铵对”y-nAChR作用的等效线图 8:葫 铵1Cso 0.00.51.01.550100l5O20o 罗库溴铵(‘Lmol/L) C罗库溴铵复合阿曲库铵对,一nAChR作用的等效线图 O2468lO12l4 阿曲库铵(mol/L) D罗库溴铵复合阿曲库铵对”y-nAChR作用的等效线图 图2等效线图分析肌松药的复合作用 ?????加mO 一静器嚣 42O8642O (rI,I世 ??舳???加m 一瓣器嚣 ??加m 一1,Io?世翘匿 m??????加mO ???????O 3322l1 (rI,I.世 天津医药2008年3月第36卷第3期 3讨论 ,一nAChR和—nAChR均由5个亚基组成.两 者均含有2个,1个B和1个6亚基,,一nAChR 另一个亚基为,亚基,—nAChR为亚基.亚基 与,亚基结构差异导致两种受体在生理和药理特 性及代谢上的不同【.本研究结果显示,维库溴铵 和阿曲库铵对,一nAChR作用的Ic卯值均小于对— nAChR作用的Ic50值;而罗库溴铵对,一nAChR作 用的Ic卯值大于对—nAChR作用的Ic卯值.另外 肌松药对,一nAChR抑制作用由大到小依次为维库 溴铵,阿曲库铵,罗库溴铵;对一nAChR抑制作用 依次为罗库溴铵,维库溴铵,阿曲库铵.这进一步说 明,一nAChR和—nAChR与不同化学结构肌松药 的敏感性不同. 多项临床研究结果显示去神经支配或烧伤患 者对非去极化肌松药产生抗性.Martyn等[21研究发 现烧伤患者应用美维松时,通过增加剂量可达到满 意的肌松条件.而本研究结果显示维库溴铵和阿曲 库铵对—nAChR均不如对,一nAChR敏感,因此骨 骼肌乙酰胆碱受体对肌松药敏感性的变化可能是 某些病理情况下患者对非去极化肌松药产生抗性 的原因之一.罗库溴铵对,一nAChR抑制作用的Ic卯 值大于对—nAChR抑制作用的Ic卯值,说明罗库 溴铵对—nAChR更敏感,与Paul等嗍的研究结果一 致.在受体水平—nAChR较,一nAChR对罗库溴铵 更敏感.临床烧伤患者对罗库溴铵产生抗药性可能 因其他原因,比如体内分布容积增加,蛋白结合率, 代谢和清除改变等因素[2-3]. 关于肌松药复合应用的药效研究,虽然临床上 报道较多但相互矛盾.两个化学结构同类的肌松药 复合应用其结果是相加作用,如两个苄异喹啉类的 顺阿曲库铵和阿曲库铵复合为相加作用;但两个甾 类肌松药维库溴铵和罗库溴铵复合其结果为协同 作用[2-5].Meretoja等研究儿童提示维库溴铵与阿曲 库铵两药呈协同作用,其ED卯,ED分别为单用药 的0.62和0.58倍;而对于婴儿,此两药复合的结果 不及儿童明显,复合用药ED卯为单用药的81%. Naguib等【s捌的研究表明美库氯铵和阿曲库铵以及 哌库氯铵和维库溴铵复合应用其结果均为相加作 用;而罗库溴铵与美维松复合应用起效时间缩短, 表现为协同作用.本研究排除整体研究中肌松药药 效受个体差异,药物分布,结合和消除等影响,应用 2D7 了两类重组受体,从肌肉受体水平研究罗库溴铵复 合维库溴铵或阿曲库铵的作用,结果证明罗库溴铵 复合阿曲库铵这两个不属同一类化学结构的肌松 药复合对8一nAChR和—nAChR都是协同作用,且 罗库溴铵复合阿曲库铵对,一nAChR抑制更明显; 但罗库溴铵复合维库溴铵这两个同属甾类的肌松 药复合对一nAChR的作用为相加作用,而对,一 nAChR却是协同作用.同样也说明不同受体亚型对 相同的肌松药复合应用其结果也是不相同的.这种 差异也可能与两类受体的结合位点分子结构不同 有关.两药复合应用时,当肌松药与高亲和力位点 结合会提高低亲和力位点的结合能力,表现为协同 作用.罗库溴铵复合维库溴铵或阿曲库铵对,一 nAChR出现协同作用验证了这种假设.而罗库溴铵 复合维库溴铵对—nAChR作用却是相加作用,从 另一面说明一,或一的结合位点与肌松药有不 同亲和力. 参考文献 【1】MillerRD.Anesthesia[M].fifthedition.北京:科学出版社,2001: 735-751. 【2】MartynJA,WhiteDA,GronertGA,eta1.Up—and—downregulation ofskeletalmu~leacetylcholinereceptors[J1.Anesthesiology, 1992,76:822—843. 【3】KimL,HiroseM,MertynJAJ.D-tuboeurarineaccentuatesthebum— inducedupregulationofnicotinicacetylcholinereceptorsatthe musclemembrane[J].Anesthesiology,1995,83:309-315. 【4】D~ptankarD,JamesPD.Thekineticsofcompetitiveantagonismby cisatracuriumofembryonicandadultnicotinicacetylcholinerecep- tors[J].MolPharmacol,2001,60:797-807. 【5】PaulM,KindlerCH,FoktRM,eta1.Isobolographicanalysisofnon- depolarisingmusclerelaxantinteractionsattheirreceptorsite[J1. 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