实验一 精子的制片、活力及密度测定

实验一 精子的制片、活力及密度测定 实验动物繁殖育种学实验指导 实验一 精子的制片、活力及密度测定 一 目的 1. 掌握小鼠精子的制片方法。 2. 了解评定精液品质的方法。 3. 掌握精子活力的估测方法及血球计数器进行精子密度测定的方法。 二 小鼠精子制片及观察 1. 仪器和试剂 眼科手术剪、镊子、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管、载玻片、盖玻片、生理盐水、甲醇(分析纯)、2%伊红溶液 2. 动物选择 成熟的大鼠、小鼠均可使用。一般采用雄性小鼠，年龄6-8周。 3. 制片 用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml的生理盐水平皿中，以眼科剪将附睾剪成小块，用吸管将悬液轻轻吹打5-6次，静置3-5分钟，用四层擦镜纸滤除组织碎片，制得精子悬液。左手食指和拇指向上捏住载玻片两端，使载玻片处于水平状态，取此精子悬液滴至载玻片右侧。右手拿一载玻片或盖玻片，使其与左手拿的载玻片呈向右的45度角，并使其接触面在精液滴的左侧。将载玻片向右拉至精液刚好进入两载玻片形成的角缝中，然后平稳地推至左边(不得再向回拉)，做成精液抹片。必须注意精液抹片不要太厚，同时要防止用力过大而造成人为的畸形精子数增多。抹片后，使其自然风干。晾干后用甲醇固定5分钟，干燥后即可镜检。也可用2%的伊红溶液染色1-2小时后再做镜检。 三 精液品质检查 (一) 直观检查 1. 精液量:将采得的精液倒在有刻度的试管或杯中，测其容量。各种常用实验动物的射精量平均为:大鼠0.05,0.2毫升，豚鼠0.4,0.8毫升，兔0.4,6.0毫升，犬2.0,15.0毫升。 实验动物繁殖育种学实验指导 2. 观察精液的色泽并嗅闻气味。 色泽:正常精液一般为乳白色或白色，密度越高，乳白色程度越浓，其透明度也越低。其它颜色均为不正常颜色。 气味:一般为无味或略带腥味。 3. 精液的云雾状翻腾滚动。云雾状显著者以“，，，”示，有云雾状以“，，”表示，云雾状不明显者以“，”表示。 (二) 精子活力检查 精子的活动有三种类型:前进运动、旋转运动和振摆运动，评价精子活力是根据精液中呈直线前进运动的精子数占总精子数的百分率。精子活力是评价精液品质的一个重要指标，与精子受精力密切相关。 1. 目测评定法 是采用显微镜放大100-400倍下判断活力。这种评定方法完全是凭检查者的主观评定，可以在显微镜上装置闭路电视或显微镜投影法反映在荧屏上。评定精子活率等级，通常采用十级评定法，即按视野中呈直线前进运动的精子数占总精子数的估计百分比评定，100%直线前进运动者评为1.0，90%者评为0.9，80%者评为0.8，以下类推。检查时，取一滴精液于载玻片上制成压片标本，放在400倍显微镜下观察，浓度大的精液先用生理盐水或等渗稀释液稀释后检查。前进运动的精子占总精子数的比例不低于70%，即活力不低于0.7方可作进一步处理。 2. 血细胞计数器计数法 2.1 将擦洗干净的血球计数板放于显微镜的载物台上，盖上盖玻片。 2.2 将试管中稀释好的精液滴一滴于计数板盖玻片的边缘使精液自动渗进计数室，注意不要使精液溢出于盖玻片之外，并不可使精液不够而致计算室内有气泡或干燥之处，如有这些现象应重做。 2.3 找到计数室和第一个中方格:将计数板固定在显微镜的推进器内，用100倍放大找到计数室，再用400倍找到计数室的第一个中方格。 2.4 计数精子:计数左上角至右下角五个中方格的总精子数，以精子的头部为准，依数上不数下，数左右不数右的原则进行计数位于格线上的精子，计数顺序从中方格第一排小格向右，至第二排向左，第三排向右，第四排向左。 实验动物繁殖育种学实验指导 2.5计数四角及中央共五个大方格即80个小方格内的非直线(包括死精子、摆动旋转运动的精子)运动精子数X，求出每毫升精液中非直线运动的精子数。由五个大方格(80个小方格)所数到的精子数代入下式，即得出每毫升的精子数， (X/80)×400×稀释倍数×10000=每毫升内所含精子数 2.6将血球计数板放入120?干烤箱中烤5分钟，利用高温杀死精子后，计数四角及中央五个方格中的精子数，求出每毫升精液中的总精子数。 精子活力=(总精子数-非前进运动精子数)/总精子数 为了减少误差，必须进行两次计数，如果前后两次误差大于10,，应作第三次检查。最后在三次检查中取两次误差不超过10,，求出平均数，即为所确定的精子数。 (三)精子的密度检查 1. 目测法 取一小滴精液于清洁的载玻片上，加上盖玻片，使精液分散成均匀一薄层，但不得有气泡，也不能使精液外流或溢于盖玻片上，置显微镜下放大400,600倍观察，按下列等级评定其密度。 密——在整个视野中精于密度很大，彼此之间空隙很小，看不清楚各个精子运动的活动情况，这一级属于“密”，每毫升含精子数约在10亿以上。 中——精子之间的空隙明显，精于彼此之间的距离约有一个精子的长度。有些精子的活动情况可以清楚地看到。这种精液的密度评为“中”，每毫升所含精子数约在2—10亿之间。 稀——精子分散存在，精子间的空隙超过一个精子长度，这种精液每毫升所含精子在2亿以下。 2. 计数法(方法同活力检查，略) 计算精子密度:精子密度=5个中方格总精子数×5×10000×稀释倍数 如5个中方格的总精子数是95，则精子密度=95×5×10000×200=9.5亿/ml 实验动物繁殖育种学实验指导 实验二 死、活精子和畸形精子的观察 一 目的 1. 掌握鉴别死活精子的操作技术，以此来评定精液品质的优劣。 2. 掌握区别各种畸形精子的方法。 二 死、活精子的鉴别 1. 原理 死活精子测定也是目前常用用来评定精子活力的一种方法。主要根据死精子和活精子对染色剂亲和力不同的特性，采用特殊的染色方法，来区别死活精子的比例。通常采用苯胺黑---伊红染色法，死精子能染上粉红色，而活精子则不着色。 应用染色法仅能区别精子的死活，而不能正确的表明精子的运动情况，因为具有旋转运动和摆动的精子仍属于活精子，所以用此法评定精子活力的结果，往往要比直接观察精子活力的方法要高一个等级。 2. 仪器和试剂 眼科手术剪、眼科镊子、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管，载玻片，盖玻片、5%伊红溶液，10%苯胺黑溶液、0.5,的龙胆紫酒精液 3. 操作步骤 3.1 取一滴精液，一滴5%伊红溶液和2滴10%的苯胺黑溶液与载玻片上(最好保持35?)，然后用玻棒将精液与伊红溶液迅速融合，再混入10%的苯胺黑溶液，搅拌数秒后，再取混合的精液一小滴，置于另一张载玻片的一端，用一张边缘平整的载玻片，成约35度角度与精液接触，待精液沿接触面扩散后，均匀地用力推至载玻片的另一端，做成精液抹片。 3.2 将做好的精液抹片至于显微镜下放大400倍进行观察。在苯胺黑的背景上，可清晰的看出死精子染成粉红色，活精子头部为无色透明。一般精子死亡时间越长，它的着色越深。 3.3 计算死、活精子的百分数:随机观察不同时也中的精子500个，然后按下列计算出死活精子的百分数: 死精子的百分数= (死精子数/计数的总精子数)×100% 二 畸形精子观察及百分率测定 实验动物繁殖育种学实验指导 在正常的精液中总是存在一些畸形精子的，凡是形态属于不正常的精子，统称为畸形精子。畸形精子的种类很多，一般常见的有头部膨大、头部小于正常大小、双头、头部不完整尾部残缺、折回、尾部卷曲、尾部套索、双尾、断尾以及尾部带原生质的未成熟精子。精液中畸形精子数过多，会影响受胎率。 1(以细玻璃棒蘸取精液一滴，滴于载玻片一端。 2(制片:(方法同实验一)。 3(固定染色:用0.5,的龙胆紫酒精液染色三分钟，水洗、待干后即可镜检，(也可由普通红蓝墨水代用)。 4(载玻片放在400倍的显微镜下进行观察，随机计数若干个视野500个左右的精子。然后按下列公式计算出畸形精子的百分数: 死精子的百分数= (死精子数/计数的总精子数)×100% 图1 精液抹片示意图 图2 左图为正常精子(左下为原生质小滴)，右图为各 种畸形精子 实验动物繁殖育种学实验指导 三 注意事项 1. 在该实验过程中，虽然将镜子悬液采用离心等方法除去组织残渣后再制片效果会更佳，但这使制片过程变得复杂化且更易造成人为误差。 2. 在镜检时要注意制片过程中人为造成的精子损伤。特别要注意由于精子重叠和交叉所造成的如多头、双头、双尾等畸形假象。