[doc格式] 巨细胞病毒感染与早期胚胎组织细胞染色体着丝粒及染色体变异关系研究

[doc格式] 巨细胞病毒感染与早期胚胎组织细胞染色体着丝粒及染色体变异关系研究 巨细胞病毒感染与早期胚胎组织细胞染色 体着丝粒及染色体变异关系研究 ? 30?中国优生与遗传杂志2008年第16卷第5期 巨细胞病毒感染与早期胚胎组织细胞染色体着丝粒 及染色体变异关系研究 刘彦慧.王明波.何永明.宋娟.黎丽芬.石静 (中山大学附属东华医院医学遗传研究室,东莞523110) 摘要:目的研究人类巨细胞病毒与早期流产的胚胎组织染色体着丝粒点(cd)变异的关系,以及导致胚胎染色体畸 变机理,探讨人类巨细胞病毒对早期胚胎发育的不良影响.方法选择早期流产的孕妇56例,曾有异常妊娠史3—5次, 取静脉.rkrXELISA法检测人类巨细胞病毒抗体,阴性者(IgG+/IgM一或IgG一/IgM一)作为未感染组,阳性者(IgG+/ lgM+或IgG一/IgM+)列为感染组,取其流产的胚胎组织采用常规短期组织培养法制作染色体,以同步银染法观察cd变 异情况,变异率与人类巨细胞病毒感染的关系,以G显带进行染色体核型分析,进一步研究cd变异与胚胎组织染色 体畸变的关系,另选择10例做人工流产的胚胎组织为正常对照组.结果56例中共有22例孕妇人类巨细胞病毒抗体阳性, 其早期流产胚胎组织cd畸变率显着高于非感染组和对照组,之间具 有极显着性差异,但对照组和未感染组染色体畸变率 之间无显着性差异.两组染色体畸变率之间无显着性差异,但均高于 对照组,之间均具有显着性差异(P<0.001),结论 人类巨细胞病毒可导致早期胚胎组织cd变异,使细胞分裂时染色体 复制错误或丢失,从而引起胚胎发育异常而导致死 胎,流产. 关键词:巨细胞病毒;早期流产;胚胎组织;染色体畸变;染色体着丝粒 点 中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编 号:1006—9534(2008)05—0030—03 rsiv,523110) Abstract:Objective:Tostudytherelationshipbetweentheaberrationofchmmosome,chromosomalcentrimericdots(Cd)of tissueoffotusandtheinfectionofhumanctomegalovirus.Methods:56casesofwomenwhohadspontaneousabortionearlywere studied.Firstly,weexaminedantibodyofhumancytomegalovirus(HCMV)intheirperiferalbloodbyELISA.Thentheywerebreak- downintoinfectiongroup(IgG+/lgM+orIgG一 /lgM+)andnoinfectiongroup(IgG+/lgM—orIgG一/lgM一)accordingtothe resultsofHCMVexamined.Theirfetustissueabortedearlywerepreparedchromosomesbyshorttermculturetechnique.Andkaryo- cyteswereanalyzedbyGbandingandCdwereanalyzedbySimultaneoussilverattainingtechnique.Acontrolgroupwas10healthy womenwhodidartificialabortion.Results:22outof56caseswerepositiveofHMCVwhoseaberrationrateofCdoffetustissuewas higherthangroupofnoinfectionandthecontrolgroup,beingdifferentsignificantly.Andfortherateofchromosomeaberration,there wassignificantlydifferentbetweenthetwogroupsandthecontrolgroup,butnosignificantlydifferentbetweeninfectiongroupandno infectiongroup.Conclusion:HumancytomegalovirusCanleadtochangetoCdoffetustissue.AndtheaberrationofCdcauseerroin theduringofmeiosisofgermcellsordeletewhichcanleadtoaneuploidaberration. Keywords:Humancytomegalovirus;Spontaneousabortionearly;Fetustissue;Chromosomeaberration;Chromosomalcentro- mericdots cd是一个复杂多蛋白结构,该结构定位于染色体着丝 粒处,是染色体在细胞分裂期进行准确分配的重要保证…. 研究发现,单纯疱疹病毒可影响Cd结构稳定性,从而导 致胚胎染色体异常而使胚胎发育不良,畸形,死胎和流产等, 人类巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)感染在人群 中普遍存在,而孕妇于孕早期感染HCMV可导致胚胎发育异 常【3J,引起新生儿黄疸肝炎,胆道闭锁,先天性巨结肠,小头 畸形,智力低下以及耳聋等多器官,多系统病变,是导致先天 性畸形的重要感染因素之一,但HCMV是否可引起胚胎 组织染色体cd畸变以及胚胎染色体畸变未见文献报道. 基金项目:广东省东莞市科技局医学科研项目20060315 资料与方法 1.资料 (1)主要设备与试剂OLYMPUSBXS1光学显微镜,美 国SHELLCO培养箱,国产电热水浴恒温箱,重庆天海染色 体分析系统,眼科剪子,镊子,湘雅基因公司的外周血淋巴细 胞培养基和lOpLg/ml秋水仙素,500u/ml肝素,Giema染液, Cd—NOR同步银染相关试剂,0.075mol/L氯化钾,甲醇和冰 醋酸等.TORCH试剂 (2)标本来源及分组 1)标本来源所有研究病例均为我院门诊或住院患 者. 2)实验分组选择早期流产的孕妇56例,流产时间 52d一95d,平均69d,曾有异常妊娠史3—5次,包括死胎,畸 中国优生与遗传杂志2008年第16卷第5期?31? 形,流产等,年龄21—37岁,平均26岁.根据外周血HCMV 检测结果分为感染组(22例)和未感染组(34例).感染判 断:感染IgM+/IgG+或IgM+/IgG一,未感染IgM一/ IgG+或IgM一/IgG一. 对照组为10例健康志愿者女性,因某种家庭或社会原 因做人工流产,HCMV阴性(IgM一/IgG+或IgM一/IgG一), 已有正常生育史,无不良孕产史和有毒害物质接触史等,年 龄22—35岁,平均26岁. 2.方法 (1)标本采集流产的胚胎绒毛组织要求在1h内采 集,采用眼科剪子和镊子取胚胎不同方位绒毛组织,放在无 菌注射用生理盐水中,反复冲洗取掉血液,以备染色体制作 用;外周血一般选择肘前静脉采集3ml,分离血清检测HC— MV. (2)HCMV检测采用ELISA法. (3)绒毛组织染色体制作采用短期培养法.绒毛组 织采集后及时按下述过程操作:将新鲜组织放入秋水仙素平 衡盐水中,以眼科镊子和剪子将其剪碎,再用10ml注射器通 过针头反复吸入推出数次,移入离心管中,1500rmp离心 10min,弃上清,沉淀中加入新鲜的含秋水仙素的平衡盐水 中,37%水浴1.5h.1500rmp×10min,弃上清,沉淀加固定 液(甲醇:冰醋酸3:1)约8ml固定30min,再连续固定2次后 每份标本制片5—10张,于65%干烤箱中过夜.室温放置1 — 12天. (4)染色体cd分析采用改良着丝粒一核仁组织区 (Cd—NOR)同步银染技术制备染色体cd标本J,基本步 骤:玻片于65%干烤箱中过夜后室温放置10—12天.然后 取染色体标本片2张,浸入已预热至约25?的0.01%NaOH 溶液中20—30s,蒸馏水冲洗后放入湿盒中,加50%AgNO 数滴,以布满玻片为度,于6o?水浴箱内静置约30min,当玻 片四周有白色银粒时,及时以蒸馏水冲洗,气干.然后,在玻 片上分别加2滴甲醛和40%氨银液,混匀后于室温静置显 色,并于显微镜下观察,染色体呈浅棕色时立即用蒸馏水冲 洗以终止显色,气干待检. 每张玻片油镜下观察10—50个核型,计数异常cd.观 察指标(参照文献):?正常cd:中期染色体着丝粒区两侧 各存在一个深色球形小体,大小一致.?小cd:即某条染色 体的一个或两个cd小于同一核型其它正常cd的1/2.? cd消失:某条染色体上未见或仅见一个cd.?cd迟滞:某 条染色体上着丝粒区只有一个未分离的球形cd.?cd— NOR融合:近端着丝粒染色体随体区NOR处银染物和其它 染色体cd融合一起.?银染近端着丝粒染色体联合(Ag— AA):即近端着丝粒染色体随体之间有银丝连接,若为三条 近端着丝粒染色体相连,但未形成封闭环者计为两个Ag— AA,若形成封闭环,则计为3个,以次类推.?银染核仁组 织区(Ag—NOR):在近端着丝粒染色体随体区有银染点. (5)染色体核型分析玻片于65%干烤箱中过夜,然后 采用胰蛋白酶消化法进行G显带分析,根据玻片上分裂相多 少,每张玻片随机分析10—50个核型. 5.统计分析采用SAS9.0软件对数据进行分析. 1各组之间染色体Cd变异比较 结果 注:感染组和对照组相比:x=2019.1312P<0.0001未感染组和对照组相比:x=0.001P=0.9742 感染组和未感染组相比:x=2782.4732P<0.0001 表2两组之间染色体畸变率比较 感染组和对照组相比:P<0.01(Fisher) 未感染组和对照组相比:P<0.01(Fisher) 感染组和未感染组相比:x=0.0000P>0.5 讨论 cd是附着在染色体着丝粒区的一对可被特殊方法着色 的球形小体,是纺锤丝微管的附着点,在细胞减数分裂时将 染色体的两个单体拉向两极.cd功能失活,结构畸变等均 可能影响纺锤丝微管的附着,其结果导致染色体分离错 误. 表1分析数据显示,具有HCMV感染的孕妇,其早期流 产胚胎组织的染色体Cd畸变率明显增高,分析9292条染色 体,具有cd不同类型畸变的为7245条,畸变率约0.77,而对 照组5290条染色体中,2166条可见畸变,畸变率约0.41,两 组之间具有级显着性差异(P<0.0001).提示HCMV对cd 结构畸变具有明显的影响.研究结果还显示,HCMV可导致 cd发生不同结构畸变,包括使cd体积变小,cd消失,迟滞 复制以及cd融合等,但以小cd和cd消失比较多见.无 HCMV感染孕妇流产的胚胎组织中,计数10556条染色体, 其中4325条染色体cd发生畸变,畸变率约0.40,与感染组 相比也具有显着性差异(P<0.0001),而与对照组相比无显 着性差异(P>0.5),提示cd对HCMV比较敏感. 染色体畸变可引起其功能异常,将导致染色体在减数分 裂时分离错误.从表2中可以看出,HCMV感染组中22例 中有l6例孕妇胚胎绒毛组织发生畸变,畸变率约0.72,未感 染组34例中有18例绒毛组织染色体发生畸变,畸变率约 0.52,略低于感染组,但两组之间无显着性差异(P>0.5). 这是因为造成孕妇早期流产的原因多而复杂,文献显示早期 (下转第14页) - 14-中国优生与遗传杂志2008年第16卷第5期 胎盘血管网络,而后合体滋养细胞从细胞滋养细胞中分化出 来.胎盘细胞滋养细胞与合体滋养细胞共同承担着母儿问 的营养物质,气体交换及代谢功能,还有分泌雌激素及多种 细胞因子的功能,所以滋养细胞的增生,分化与凋亡在胎盘 形成和发育中起重要作用,对妊娠结局的影响至关重要.如 果胎盘形成缺陷或浸入过浅就可导致妊娠期高血压疾病, 此时由于血管内皮的病变,使胎盘灌流不足,缺血,缺氧,释 放毒性因子便诱导大量的滋养细胞凋亡,有关研究用蛋白免 疫印迹技术测定妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中血管内 皮生长因子(VEGF)的表达,并用抗F,8因子抗体标记胎盘中 的血管密度,结果显示妊娠期高血压疾病患者胎盘VEGF及 血管密度显着降低,在恶性肿瘤发生的癌基因研究中,不少 学者提出了多基因协同作用假说,认为两者存在某种内在联 系.一方面,在肿瘤血管形成早期,VEGF可诱导内皮细胞产 生组织因子和MMPs;另一方面,MMPs通过对基底膜的水 解,促进VEGF和其他血管形成的作用,促进毛细血管芽的 形成(绒毛外滋养层细胞具有类似恶性肿瘤细胞的生物学特 性,不同的是受着严密的调控).据有关研究表明生长因子 与黏附因子均被认为与肿瘤血管生成有关,且生长因子和黏 附因子又均可介导细胞与基质的信号传递,从而影响细胞的 生长和分化,这提示整合素和生长因子信号通路在某些位点 相遇.研究表明妊娠期高血压疾病患者胎盘细胞滋养细胞, 合体滋养细胞,蜕膜细胞的凋亡数量均明显高于正常妊娠 组,所以笔者认为VEGF表达减少有可能通过上调整和素来 促进血管生成.但是随着VEGF表达减少与它相联系的 MMPs表达也下降,要证明这一推测需要加大样本例数同时 要引进相关的因子. 目前有关研究已发现妊娠期高血压疾病早中期血浆中 MMP一9阳性率均低于非妊娠期高血压疾病组,且两组间有 显着性差异,这一结果为妊娠期高血压疾病的早期无创检测 提供了实验依据.因此,笔者希望下一试验时增大样本例数 的同时应用ELISA检测妊娠期高血压疾病组和对照组血浆 中MMP-9和Integrin~3以及相关因子的表达并与胎盘组织 中两者的表达对照,检测血浆和胎盘中两者表达是否同步, 从而早一些使妊娠妇女血中MMP-9和IntegrinB3的检测有 望成为临床妊娠期高血压疾病早期诊断提供一种无创初筛 的新方法. 参考文献 [1]林其德.妊娠高血压综合征病因学研究与展望[J].中华妇产科 杂志,2003,38(8):47l一472. 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