细胞增殖BrdU

细胞增殖BrdU 细胞增殖检测技术 -- BrdU法 一、 基本原理 BrdU,5-溴脱氧尿嘧啶核苷,法检测细胞增殖原理,BrdU是胸腺嘧啶的衍生物,常用于标记活细胞中新合成的DNA,可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中,细胞周期S期,。这种掺入可以稳定存在,随着DNA复制进入子细胞中。 BrdU 特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入,从而判断细胞的增殖能力。 二、 操作步骤 5,1,细胞以1.5×10 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中,内放置一盖玻片,,培养1 d,用含0.4,FBS培养液同步化3 d,使绝大多数细胞处于G期。 0 ,2,加入BrdU,储液,1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml,,37?,孵育40min。 ,3,弃培养液,玻片用PBS洗涤3次。 ,4,甲醇/醋酸固定10 min。 ,5,经固定的玻片空气干燥,0.3,HO-甲醇30 min灭活内源性氧22 化酶。 ,6,5,正常兔血清封闭。 ,7,甲酰胺100?,5 min变性核酸。 ,8,冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗,工作浓度1,50,,阴性对照加PBS或血清。 ,9,按ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数,LI,。 三、注意事项 1.BrdU配制,10 mg溶于10 ml双蒸水,4?下避光保存 2.BrdU会肌体造成不可逆损伤,使用时注意安全,避免吸入BrdU粉尘。