重组人粒细胞刺激因子注射液

重组人粒细胞刺激因子注射液 Chongzu Ren Lixibao Cijiyinzi Zhusheye Recombinant Human Granulocyte Colony stimulating Factor Injection 本品系由高效达人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度 纯化后制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。 1 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 2.1菌菌种 2.1.1名称及来源 重组人G-CSF工程菌株系由带有人G-CSF基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。 2.1.2种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。 2.1.3菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1划种LB琼脂平板 应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。 2.1.3.2染色镜检 应为典型的革兰阴性杆菌。 2.1.3.3对抗生素的抗性 应与原始菌种相符。 2.1.3.4电镜检查（工作种子批可免做） 应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。 2.1.3.5生化反应 应符合大肠杆菌生物学性状。 2.1.3.6重组人G-CSF表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.7质粒检查 该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。 2.1.3.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。 2.2原液 2.2.1种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接 种用。 2.2.2发酵用培养基 采用适宜的不含任何抗生素的培养基。 2.2.3种子液接种及发酵培养 2.2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件， 如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录? G）。 2.2.4发酵液处理 用适宜的收集处理菌体。 2.2.5初步纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。 2.2.6高度纯化 经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，即为重组人G-CSF 原液，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。 2.2.7原液检定 按3.1项进行。 2.3半成品 2.3.1配制与除菌 2.3.1.1稀释液配制 按经批准的配方配制稀释液。配制后应及时用于稀释。 2.3.1.2稀释与除菌 将检定合格的重组人G-CSF原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。除菌过滤后即为半成 品，保存于2～8?。 2.3.2半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.4.3规格 应为经批准的规格。 2.4.4 包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3 3.1原液检定 3.1.1生物学活性 依法测定（附录? E）。 3.1.2蛋白质含量 依法测定（附录? B第二法）。 3.1.3比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于6.0×10 7IU。 3.1.4纯度 3.1.4.1电泳法 依法测定（附录? C）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加 样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或 5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2高效液相色谱法 依法测定（附录? B）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水 溶液：取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取1.0ml三氟 乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（0～70％B 相）。上样量不低于10μg，于波长214nm280nm处，以G-CSF色谱峰计算理论板数应不低 于1500。按面积归一化法计算，重组人G-CSF主峰面积应不低于总面积的95.0%。 3.1.5分子量 依法测定（附录? C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样 量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为18.8kD?1.988kD。 3.1.6外源性DNA残留量 每1支次人用剂量应不高于10ng（附录? B）。 3.1.7宿主菌蛋白残留量 应不高于总蛋白质的0.10%（附录? C）。 3.1.8残余抗生素活性 依法测定（附录? A）。不应含有残余氨苄西林或其他抗生素活性。 3.1.9细菌内毒素检查 每300μg蛋白质应小于10EU（附录? E凝胶限量试验）。 3.1.10等电点 主区带应为5.8～6.6，供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致。（附录? D）。 3.1.11紫外光谱扫描 用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波长230nm～ 360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为 278nm?3nm（附录? A）。 3.1.12肽图（至少每年测定1次） 依法测定（附录? E），应与对照品图形一致。 3.1.13 N-末端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列仪测定，其N-末端序列应为： （Met）-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu。 3.2半成品检定 3.2.1细菌内毒素检查 每300μg蛋白质应小于10EU， 300µg/支以上规格的，每支应小于10EU.（附录? E凝胶限 量试验）。 3.2.2无菌检查 依法检查（附录? A），应符合规定。 3.3成品检定 3.3.1鉴别试验 按免疫印迹法（附录? A）或免疫斑点法（附录? B）测定，应为阳性。 3.3.2物理检查 3.3.2.1外观 应为澄明液体。 3.3.2.2可见异物 依法检查（附录? B），应符合规定。 3.3.2.3装量 按附录? A中装量项进行，应不低于标示量。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1pH值 应为3.5～4.5（附录? A）。 3.3.3.2渗透压摩尔浓度 依法测定（附录V H），应符合批准的要求。 3.3.4生物学活性 应为标示量的80%～150%（附录? E）。 3.3.5残余抗生素活性 依法测定（附录? A）。不应含有残余氨苄西林或其他抗生素活性。 3.3.6无菌检查 依法检查（附录? A），应符合规定。 3.3.7细菌内毒素检查 每1支次人用剂量应小于10EU（附录? E凝胶限量试验）。 3.3.8异常毒性检查 依法检查（附录? F小鼠试验法），应符合规定。 4 于2～8?避光处保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。 5 应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。