左卡尼汀口服液抗氧化作用研究

左卡尼汀口服液抗氧化作用研究 青岛大学 硕士学位论文 左卡尼汀口服液抗氧化作用研究 姓名:梁孝印 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:王春波 20090527左卡尼汀口服液抗氧化作用研究 中 文 摘 要 目的:研究左卡尼汀口服液体内血浆、尿液及体外的抗氧化作用。方法:名 健康受试者单剂量口服盐酸左卡尼汀口服液 和服药后 后,分别于服药前 ,. , . ,. ,. ,. ,. ,. ,. ,. ,取前臂静脉血 置肝素试管中, ?离心,分离血浆,同时收集给药后 ,~ ,~ , ~ ,~ ,~ 的尿液,.?冷冻待测。对不同时间点的血浆与尿液,采 用酶生物化学法测定抗氧化指标超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、谷 胱甘 肽过氧化物酶的活性、总抗氧化能力、抑制羟自由基能力、抗超氧阴离子能 力、一 氧化氮浓度、丙二醛浓度。测定左卡尼汀口服液稀释倍数与黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶 反应体系产生超氧阴离子自由基能力及反应体系产生羟自由基能力的线性 ~ 关系。结果:中国健康受试者单剂量口服盐酸左卡尼汀口服液 后 , 血浆超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活力和抗超氧阴离子、抗 羟自由基能力以及总抗氧化能力均较服药前 显著增加.尔后降 低;血浆一氧化氮、丙二醛浓度均较服药前先降低.尔后增加; 尿液超氧化物歧化酶活性、总抗氧化能力、抗超氧阴离子、抗羟自由基能力均较服 药前 显著增加.尔后降低;尿液一氧化氮、丙二醛浓度均较服 药前先降低.尔后增加。体外抗氧化实验明,在左卡尼汀口服液 ?至 ?浓度范围内,左卡尼汀口服液稀释倍数与超氧阴离子自由基 产生能力的线性方程为..奉,..;在 ?。 至 ?浓度范围内,左卡尼汀口服液稀释倍数与羟由基产生能力的线性方程 为..木,.尸.。结论:左卡尼汀口服液在体内外 均具有显著抗氧化作用。 硕士研究生梁孝印药理学 指导教师王春波教授 关键词:左卡尼汀口服液;健康中国人;抗氧化: .: , ,. , ,. ,. ,. . ,. ,. ,. ,. , ,~ ,~ , ~ 一? . ,~ ,~ ,、、?、, ,..: ,、、 、 ; . . . 、 . ; . .’ ’., 邱..宰 .尸.. ’?,..事伍... :? ? , . , . : . :; ;学位论文独创性声明学位论文知识产权权属声明 学位论文独创性声明 本人声明,所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文 中依法引用他人的成果,均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意 义上已属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人己用于其他学位申请的论 文或成果。 本人如违反上述声明,愿意承担由此引发的一切责任和后果。 魄。了年川自 论文储虢张甲 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品,知识产权归属学 校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本 人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时,署名单 位仍然为青岛大学。 本学位论文属于: 保密口,在 年解密后适用于本声明。 不保密? 请在以上方框内打“?” 眺。年箩月和 论文作者躲黯甲 吼明年月驴 导师躲确拨 本声明的版权归青岛犬学所有,未经许可,任何单位及任何个人引言 引 言 左卡尼汀,,即左旋肉毒碱,于年由两位俄国科学家 在肌肉萃取物中首次发现【,又名维生素,化学结构为.羟.三甲胺丁酸盐。 是人体细胞的一种基本组成成分,是哺乳动物能量代谢中必需的体内天然物 质,其主要功能是促进脂类代谢,可促进产生而提供能量,是心、脑、肾 等组织器官的主要能量来源,同时也具有促进蛋白降解、抗氧化、保护细胞 膜等 作用。脂类代谢障碍可引起脂酰一堆积,线粒体内长链脂酰卡尼汀堆积,导 致游离卡尼汀大量消耗而减低。堆积的脂酰.导致膜结构改变、膜相崩解而 引起细胞死亡。足量游离的卡尼汀可使堆积的脂酰.进入线粒体内,减少其 对腺嘌呤核苷酸转位酶的抑制,使脂酰在线粒体酶的作用下进行伊氧化【】, 氧化磷酸化得以顺利进行。因此,可以使缺血、缺氧时堆积在线粒体内的长 链脂酰进行顺利的氧化磷酸化,从而纠正脂肪酸代谢障碍导致的能量代谢 失衡,预防脂质过氧化。近年来越来越多的研究表明,与代谢疾病、心血 管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病及肾脏等疾病有关。 众多的学术研究使在临床上逐渐广泛应用。美国科学家 与 于年发现,当存在时,鸽子心脏线粒体产生过氧化氢的速率 变慢,认为具有抗氧化活性【】。此后研究发现,具有预防线粒体膜遭受自 由基损伤的重要作用。的这一作用使其对神经系统】、。管系统【、 肝脏、肾脏【盈】、内分泌系统、生殖系统【等许多器官都具有保护 作用。 】于年通过不同的抗氧化试验方法进行的体外抗氧化试验表 明,可有效清除自由基、超氧阴离子,过氧化氢,清除能力略低于洳 生育酚,但高于其水溶性类似物。在小鼠身上的实验表明【】, 可有效降低衰老小鼠脑部氧化应激诱导的脂质过氧化反应速度,提高抗氧化 酶的活性。郭文怡等【】采用原代培养乳鼠心肌模拟缺血再灌注损伤的研究 表明, 组随用药浓度增加,升高的丙二醛含量逐步恢复正常,超氧化物歧化酶活性 逐步升高,细胞凋亡率逐步降低。 左卡尼汀在血浆中呈游离状态,不与血浆蛋白【】结合,主要以原型经肾脏排 泄,经肾小球滤过后,%以上经肾小管重吸收进入血液循环。左卡尼汀的体内 代谢过程说明其在血浆与尿液中也具有抗氧化作用,因此对血浆和尿液的研 究是 探讨抗氧化作用的关键。 由于在临床上的广泛应用,因此临床剂型较多,包括注射液、片剂、泡 腾片和口服液等,国内主要以注射液和口服液两种剂型为主。口服液具有携 带与 服用方便的优势,其应用更为普遍,因此本课题主要研究口服液的作用。虽 青岛大学硕士学位论文 然既往对的抗氧化作用研究较多,但体外抗氧化活性与浓度的线性关系未见 报道。本课题研究了国内晦床常用口服液对黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应体系 产生的超氧阴离子自由基和反应产生的羟自由基能力的影响,并做了线 性关系研究。此外,多数关于的研究都集中在有病机体的各种疾病的治疗方 面,未见有对健康人抗氧化研究的报道。本试验系统研究了单剂量口服口服 液对健康人体内和体外的多种抗氧化酶及超氧化物、氮氧化物含量的影响, 为预 防脂类代谢障碍性疾病的研究及脂质代谢障碍的患者与健康人的比较性研 究提 供了理论依据 第一章实验材料 ..仪器 可见分光光度计:上海精密科学仪器厂 .电热恒温箱:北京八方世纪科技技术有限公司 单列两孔电热恒温水浴锅:天津市泰斯特仪器有限公司 一 型旋涡混匀器:太仓市科教仪器厂 纯水发生器:密理博上海公司 一电子天平:青岛远博仪器设备有限公司 .?高速台式离心机:上海安亭科学仪器厂 微量加样器:北京百晶生物技术有限公司 .试剂 冰醋酸分析纯:北京化工厂,批号: 丙二醛测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号: 超氧化物歧化酶测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号: 谷胱甘肽过氧化物酶.测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号: 过氧化氢酶测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号: 抗羟自由基能力测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号: 第一章实验材料 无水乙醇分析纯:烟台化学试剂有限公司,批号: 盐酸分析纯:连云港化学试剂厂,批号: 一氧化氮测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号: 抑制超氧阴离子能力测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号: 总抗氧化能力测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号: 左卡尼汀口服溶液东维力,. ?支。:东北制药总厂,批号: ?一, ..样本 本实验样本为采自单剂量口服 左卡尼汀口服溶液的位健康志愿者不 同时间点段的血浆与尿液。 ..受试者 本实验共招募例健康志愿者,男女各例,年龄. .岁,体 重指数. .?。受试者均无心、肝、肾、消化道、神经系统、代 谢异常等病史,无烟、酒等不良嗜好,试验前 及试验期间未服任何其它药 物。经全面体检,实验前、后健康志愿者血、尿常规,肝、肾功能、血脂、线 透视、血压及心电图均无异常发现。实验前均签订知情同意书。 ..服药方法 随机确定名志愿者的服药顺序,给药前一天晚餐清淡饮食后开始禁 食 ,第二天早上主动排空尿液收集尿液后空腹给药。左卡尼汀口服液 温开水送服。服药后 后方可饮水, 后进统一标 单次给药【】, 准餐。为排除食物中左卡尼汀对试验的干扰,以及食物中维生素、等对体内 自由基的影响,本试验的餐一律不含肉类、乳制品及富含维生素、的蔬 菜及水果,以清淡饮食、素食为主。试验期间禁烟、酒、茶、咖啡及含相应 成份 的食品或饮料。避免剧烈活动和长时间卧床。 ..血样采集 ,. ,. ,. ,. ,. ,. ,. 于服药前 和服药后. ,. 经静脉留置针取前臂静脉血 ,置肝素试管中, ?离心, 分离血浆,保存于。?冰箱中冷冻待测 青岛大学硕士学位论文 ..尿样采集 用药前 应主动排空尿液,给药后 ,~ ,~ ,~ ,~ , ~ 分段收集【,分别保留在干净的容器里,分别加 盐酸作为防腐剂。 每次排尿后应补充 水以维持尿量,每次大便时收集小便,切勿损失。将 各时间段的尿液混匀,然后各取于塑管中,密封,.。保存,待测。 第二章实验方法 .体内抗氧化实验 首先进行蛋白定量的测定,根据双缩脲反应原理,蛋白质的肽键能与碱性铜 溶液作用,生成紫色复合物,该复合物在 左右处有最大光吸收。根据公 式:蛋白?测定管吸光度值?标准管吸光度值×蛋白标准浓度?., 求出被测样品中的总蛋白含量,然后用试剂盒测定健康志愿者血浆、尿液中 的下 述各项指标。 ..超氧化物歧化酶活性的测定 用亚硝酸盐、法【,取. 样本浆或尿液,按试盒操作法加入试 剂,反应体积为. 。反应管震荡混匀,?恒温水浴 ,加入显色剂 后,反应液呈紫色,于 处测吸收度值。活性单位定义为每毫 升反应液中抑制率达 %时所对应的量为一个活力单位 。按公式:总活性?对照管吸光度值一测定管吸光度 值?对照管吸光度值?%×反应体系的稀释倍数,求出被测样品中的 活性。 ..谷胱甘肽过氧化物酶. 活性的测定 谷胱甘肽过氧化物酶 ,?可以促进过 氧化氢与还原型谷胱甘肽反应生成及氧化型谷胱甘肽 ,?的活性可用其酶促反应的速率来表示,测定此酶促反应中还 原型谷胱甘肽的消耗,可求出此酶的活性,计算时扣除非酶促反应引起的还 原型 谷胱甘肽减少的部分。规定每. 血浆在反应 ,扣除非酶促反 应作用,使反应体系中浓度降低 ?为一个酶活力单位。按公 式:.活性非酶管值一酶管值?标准管值一空白管 值×标准管浓度 ?×稀释倍数×样本测试前稀释倍数,计算 的活性。试验根据试剂盒说明书进行。 第二章实验方法 ..过氧化氢酶活性的测定 过氧化氢酶,活性的测定采用可见光法【。过氧化氢酶分解 的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止,剩余的与钼酸铵作用产生一 种淡黄色络合物,在 处测定其生成量,可计算出的活力。规定每 毫升血浆每秒钟分解的的量为一个活力单位。血清中活力 ?对照管值.测定管值×??取样量×样本测 试前的稀释倍数,计算过氧化氢酶活性值。试验根据试剂盒说明书进行。 ..总抗氧化能力的测定 机体中有许多抗氧化物质,能使”还原成,后者可与菲啉类物质形 成稳固的络合物,通过 处比色可测出其抗氧化能力的高低。在?时, 每分钟每毫升尿液使反应体系的吸光度每增加.时,为一个总抗氧化能力单 位。的测定采用化学比色法’?,取 样本血浆或尿液按试盒操 作法加入试剂,充分混匀,?水浴 ,再向对照管加入试剂 ,两 , 管同时加显色剂,混匀,静置 处,光径,双蒸水调零,测 各管吸光度值。依公式:单位?所测的吸光度值?.?×稀 释倍数测定管值.对照管值?.?×反应液总体积× 取样量样本测试前的稀释倍数,计算值。 ..抑制羟自由基能力的测定 羟自由基的检测采用反应体系州。反应是产生羟基自由基 最常用的反应,是利用和反应生成和?,的量和 反应产生的?量成正比,反应产生的?可以与水杨酸反应生成,.二羟基苯 甲酸,在 处有最大吸收。规定每毫升血浆尿液在?下反应 , ?为一个抑制羟自由基能力单位。按公式: 使反应体系中心,浓度降低 抑制羟自由基能力?对照管值.测定管值?标准管 值一空白管值×标准管浓度. ?.?取样量×样本测 试前的稀释倍数,计算抑制羟自由基能力。试验根据试剂盒说明书进行。 ..抗超氧阴离子能力的测定 超氧阴离子自由基的检测采用黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体 系,所产生的超氧阴离子自由基可与氯化硝基四氮唑蓝反应形成蓝色, 于 处测定吸收度。抗超氧阴离子自由基活力单位的定义为:在反应系统中, 每升血浆尿液在?反应 所抑制的超氧阴离子自由基相当于 的 维生素所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位【。其 青岛大学硕士学位论文 为:血清/浆尿液中抗超氧阴离子活力单位?.管吸光度.测 定管吸光度?对照管吸光度一标准管吸光度×标准品浓度. ?‘ × ×样本测试前的稀释倍数。试验根据试剂盒说明书进行。 ..一氧化氮浓度的测定 浓度的测定采用硝酸还原酶法。亚硝酸盐。和硝酸盐‘为 稳定的终末代谢产物,利用测定。和’含量可间接地反映的 产生量。可与试剂%对氨基苯磺酸,.%..萘基.乙二胺,% 】发生重氮反应,产物为粉红色,呈色反应强度与。浓度成正 比。以可见分光光度计在 最大吸收峰波长下测样品的吸光值,亚硝酸 钠作标准品。测定。时先以金属镉、硝酸根还原酶或其它还原剂将其还原为 。,再与试剂反应附。按公式:含量?.测定管吸光 度.空白管吸光度?标准管吸光度一空白管吸光度×标准品浓度 ?×样本测试前的稀释倍数,计算一氧化氮浓度。 ..丙二醛含量的测定 浓度的测定采用比色法【】,可与硫代巴比妥酸缩 合,形成红色产物,在 处有最大吸收峰。取样本血浆或尿液. , 按试盒操作法加入试剂,反应终体积为. 。混匀,塑料薄膜封口,刺一小 孔,?水浴 ,取出后流水冷却, ?,离心 ,取上清于 处, 光径,蒸馏水调零,测各管值。依公式:含量测定管吸光度值一测定空白管吸 光度值?标准管吸光度 ?.,计算的含量。 值一标准空白管吸光度值×标准品浓度 ..体外抗氧化实验 ..对超氧阴离子自由基生成的影响 对超氧阴离子自由基生成的影响:超氧阴离子自由基的检测采用黄嘌呤 与黄嘌呤氧化酶反应体系,所产生的超氧阴离子自由基可与氯化硝基四 氮唑蓝反应形成蓝色,于 处测定吸收度以蒸馏水作对照,以 . 标准品作标准。产生超氧阴离子自由基能力单位的定义为,在反应系统中, 每升克物质在?反应 所产生的超氧阴离子自由基 相当于的维生素所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位。 左卡尼汀口服液浓度为 ?,用双蒸水分别稀释,,,倍后进行 测定,每个浓度测三次,结果取平均值。 第三章实验结果 ..对羟自由基生成的影响 羟自由基的检测采用反应体系,利用和反应生成 和.一,的量和反应产生的?量成正比,反应产生的?可 以与水杨酸反应生成,.二羟基苯甲酸,于 处测定吸收度以蒸馏水作 对照,以.%标准应用液作标准。规定每毫升或每毫克物质或每立方 ?为 厘米内个细胞在本反应体系中使反应液中的浓度增加 一个产生羟自由基能力单位。左卡尼汀口服液浓度为?,用双蒸水分 别稀释,,,,,,倍后进行测定,每个浓度测三次,结果取平均 值。 .统计学处理 采用.软件和软件对结果进行统计分析,方差齐时用随机 区组设计进行方差分析,方差不齐时用近似检验进行方差分析。 第三章 实验结果 .血浆抗氧化酶活性及自由基含量 ..血浆抗氧化酶活性及总抗氧化能力测定结果 用药后~ 、.、活性以及均逐渐升高,至 、. 、. 、. 、. 达高峰,尔后~ 逐渐降低。服药后. 、 各时间点所采血浆的?、活性均与服药前 相比有显著差异, . 、 、. 、. 、. 、. 、 各时间点所采血浆的活性均与 、. 、. 、. 服药前 相比有显著差异, 各时间点所采血浆的 均与服药前 相比有显著差异,见表..。 青岛大硕士学位论学文 .士. .士. .土. .士. .士.? . . . . .士. 一 ?????一???????一一????????????????????????????????????、?~?一 .士.宰 .士.聿幸 .士.事奎 .士.掌 .士.奉宰 .士.幸事 .士.事事 .士. .士.事幸 .士.幸事 .士.?事 .士.幸 .士.宰事 .士.事拳 .士.幸幸 .土. .士.宰奉 .士.枣事 .士. .士. .士. .士. .士. .士. 抡 .士. .士. .土. .士. .士. .士. .士. .士. 注:与服药前比较,叩.,宰. ..血浆自由基及丙二醛浓度测定结果 用药后~ 抑制羟自由基能力、抗超氧阴离子能力均逐渐升高,至 、. 、. 、. 、. 、 达高峰,尔后~ 逐渐降低。服药后. . 、. 各时间点所采血浆的抑制羟自由基能力、抗超氧阴离子能力均与服 药前 达最低, 相比有显著差异。用药后~ 浓度逐渐降低,至 、. 、. 尔后~ 逐渐升高。. 各时间点所采血浆的浓度均 与服药前 达 相比有显著差异。用药后~ 浓度逐渐降低,至 逐渐升高, ~ 各时间点所采血浆的浓度均 最低,尔后~ 与服药前 相比有显著差异。见表..。 第三章实验结果 注:与服药前 比较,叩.,霉宰. .尿液抗氧化酶活性及自由基含量 ..尿液抗氧化能力测定结果 用药后~尿液活性、.、抑制羟自由基能力、抗超氧阴 离子能力逐渐升高,至~ 时相达高峰,尔后~ 逐渐降低至用药前 、~ 、~ 、~ 水平。~ 各时段所集尿液的活性、 、~ 、 .抗超氧阴离子能力均与服药前 相比有显著差异,~ ~ 相比有显著差异。 各时段所集尿液的抑制羟自由基能力均与服药前 见表..。 青岛大硕士学位论学文 .士. .士. .士. .士. ~ .士.事奎 .士. .圭. .士.幸搴 ~ .士.? .士.幸 .士.幸 .士. ~ .士.事 .士.幸 .士. .士.宰 ~ .土. .士. .士. .士. ~ .士. .士. .士.盼 .士. 注:与服药前比较,中.,叩. ..尿液、浓度测定结果 时相达 用药后~ 尿液浓度、浓度均逐渐降低,至~ 比较, ~ 最低,尔后逐渐升高。与服药前 间各时段所收集尿液的 尿液浓度、浓度均具显著差异。见表..。 表..各时段尿液自由基浓度测定结果::, 注:与服药前比较,叩.,幸叩. .体外抗氧化实验结果 ..对超氧阴离子自由基生成的影响 黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系中产生超氧阴离子自由基的能力随左卡尼 汀口服液浓度降低而显著增加,且呈量效关系表..。 第三章实验结果 表..左卡尼汀口服液稀释倍数与黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生:。能力的关系 图..左卡尼汀口服液稀释倍数与与黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生:‘能力的 线性关系示意图 由图可以看出,黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生。的能力随左卡尼 汀口服液稀释倍数增加而增加,即随浓度降低而增加。在稀释一倍与稀释十倍范 围内,稀释倍数与超氧阴离子由基产生能力的线性方程为..幸 ,相关系数为.尸.。 ..左卡尼汀口服溶液对羟自由基生成的影响 反应体系产生羟自由基的能力随左卡尼汀口服液浓度降低而显著增 加,且呈量效关系表..。青岛大硕士学位论学文 表..左卡尼汀口服液稀释倍数与反应体系产生羟自由基能力的关系 图.左卡尼汀口服液稀释倍数与反应体系产生羟自由基能力的线性关系示意图 由图可以看出,反应体系产生羟自由基的能力随左卡尼汀口服液稀 释倍数增加而增加,即随浓度降低而增加。在稀释一倍与稀释一百倍间 ?线性关系良好,稀释倍数与羟自由基产生能力的线性方程为. .木,相关系数为..。 第四章 讨论 第四章讨论 自由基和人类多种疾病均有密切关系,英国于年就率先提出自 由基与机体衰老和疾病有关【。自由基是人体进行生命活动时所产生的一种活性 氧化产物。正常情况下,自由基具有调节细胞间的信号传递和细胞生长的作用。 生物体可通过自身的酶系统或非酶抗氧化剂清除体内不断产生的自由基,使自由 基的产生和清除保持动态平衡。但如果体内自由基过多,则可引起蛋白质、核酸 变性,这是由于自由基是氧失去一个电子而产生,因失一个电子,化 学性质极不稳定,为趋于稳定,自由基便抢夺体内其它化合物蛋白质、酶、细 胞内的等的电子,如果自由基侵占的一个电子,该便遭到破 坏,被破坏的便不断复制出有缺陷的,导致组织器官损伤,从而诱发 各种疾病。例如,自由基攻击白细胞造成白细胞大量死亡,引起溶酶体酶大量释 放而杀伤或杀死组织细胞引发炎症【捌;损伤视网膜导致晶状体组织破坏引 发白内 障【】;攻击基因诱发癌症;攻击动脉血管壁和不饱和脂肪酸使之发生氧化反应 生成过氧化脂质,造成动脉硬化症并诱发冠心病等其他心血管疾病【;当肺巨噬 细胞受到自由基侵袭,释放蛋白水解酶类物质导致肺组织的损伤破坏蚓;作用于 免疫系统,引起淋巴细胞损害,人体免疫功能下降,并且也能导致自身免疫性疾 病网。此外,自由基与胃炎冈、消化性溃疡、原发性肾小球疾病【、糖尿病【】、 支气管哮喘、肺气肿【、缺铁性贫血嘲、大骨节病【】、克山病嗍、震颤麻痹症 嗍等疾病都有着密切的关系。因此,应用抗氧化剂及时清除体内过多的自由基, 减少自由基堆积和过氧化反应,可起到防御自由基损害、抵抗疾病、延缓衰老的 作用。目前使用较多的是合成抗氧化剂,随着近年来抗氧化剂的迅速发展,已从 单纯的合成抗氧化剂逐渐发展成为天然抗氧化剂与体内自由基清除剂。而合 成抗氧化剂的动物实验表明它们有一定的毒性和致癌作用,。因此寻找天然、 高效、低毒抗氧化剂成为目前抗氧化剂发展的一个必然趋势,是生物物理学、 医 学和药学交叉的研究热点。 左卡尼汀.,是重要的内源性物质,是人体脂类代谢的重要 、 介质。的广泛研究使之在临床上得到广泛应用,目前主要用于帕金森病 阿尔茨海默症阮、冠心病【】、心衰【’、糖尿病【,、肝硬化陬、肾病综 合征圈等疾病的治疗。鉴于既往未见有对健康人体内血、尿抗氧化指标,及 体外抗氧化活性与浓度线性关系报道,本课题系统研究了携带与服用方便的 口服液对健康人体内和体外的多种抗氧化酶、超氧化物、氮氧化物含量的影响, 研究发现,口服液不但在体外抗自由基能力与其稀释倍数呈良好的线性关系, 而且能显著提高健康人体内抗氧化酶的活性,对健康人体内自由基也有很好 的清除作用。 体外试验证明,黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系中产生超氧阴离子自由基的 青岛大硕士学位论学文 能力随左卡尼汀口服液浓度降低而显著增加,左卡尼汀抗自由基的能力与其稀释 倍数呈良好的线性关系。黄嘌呤氧化酶是体内核酸代谢中一个重要的酶,胞质中 黄嘌呤脱氢酶可转化成黄嘌呤氧化酶,后者以次黄嘌呤或黄嘌呤为底物产生超氧 阴离子和过氧化氢。超氧阴离子是带负电荷亲水性自由基,本身并不太活泼,不 能穿透细胞膜,超氧阴离子在参与和催化下,通过.反应生成羟 自由基郾】,超氧阴离子也可和过氧化氢相互作用产生氧化性更强的羟自由基和单 线态氧,跨越细胞膜,扩散到较远的距离,到达靶位,诱发多不饱和脂肪酸的脂 质过氧化造成组织细胞的进一步损伤嗍。此外,超氧阴离子还可以使过氧化氢酶 、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶失活【,因此,超氧阴离子的产生减少可以减轻 其对组织、细胞的损伤。本试验通过研究左卡尼汀口服液对超氧阴离子产生的影响 证明,左卡尼汀口服液浓度为. 时,黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产 生超氧阴离子自由基的能力为. ?。左卡尼汀口服液稀释倍后,黄嘌 呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基的能力变为. ?.。黄 嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基的能力随口服液随稀释倍 数的增加直线上升,且稀释倍数与黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离 子自由基能力值呈良好线性关系,线性方程为..宰,回归系 数为.。这说明左卡尼汀可显著抑制黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生超 氧阴离子自由基,使超氧阴离子的来源减少,从而可有效抑制超氧阴离子所引起 的脂质过氧化反应。 细胞内羟自由基的水平与内环境的稳定有密切关系【】。当羟自由基产生过 多,或机体清除能力下降时,可通过电子转移、夺取氧原子和羟基化等反应,使 糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等发生氧化,机体遭受损伤与破坏,从而引 起脑缺血、帕金森氏症、风湿性关节炎、呼吸窘迫综合症、心血管疾病和癌症等 疾病【。。为研究左卡尼汀口服液对羟自由基清除能力的影响,本课题通过体外试 验证明左卡尼汀可降低反应体系产生羟自由基的能力,并随左卡尼汀口 服液稀释倍数增加而显著增加,且呈量效关系。 机体中的羟自由基主要通过超氧阴离子自由基衍生而来,电离辐射也可使细 胞中的水电离成羟自由基,是辐射损伤的主要原因【】反应引起的 反应是生物系统产生羟自由基的主要来源之一【,也是体外产生羟自由 基最常用的体系唧】。在反应中加入一定量的螯合剂,可以增加羟 自由基的产率【。通过反应产生的羟自由基是氧化活性最强的氧自由基 【叼,比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性还强,反应性极强,几乎可以与所有细 胞成 分发生反应,对机体危害极大【】。羟自由基可参与磷脂抽氢,引起一系列反 应, 第四章讨论 导致细胞膜损伤,从脱氧核糖上抽氢,生成各种产物,引起细胞突变;羟 自由基与、的嘌呤或嘧啶碱基发生加成反应,在氧气存在的情况下, 进一步反应生成胸腺嘧啶自由基,损伤的碱基和糖骨架,引起键的断裂, 细胞无法修复这些严重损伤时,则引起细胞突变和死亡。因此,为避免羟自由 基 对机体细胞攻击,需要从源头上有效抑制羟自由基的产生。 本研究证明,左卡尼汀口服液浓度为. 时,其反应体系产生 羟自由基的能力为. ?,并且反应体系产生羟自由基的能力随左 卡尼汀口服液稀释倍数的增加而增加,稀释倍的左卡尼汀口服液其反 应体系产生羟自由基的能力增加为. ?~,而稀释倍后反应 体系产生羟自由基的能力增加为. ?,且稀释倍数与反应体系 产生羟基自由基能力值呈良好线性关系,线性方程为..幸, 回归系数为.。说明随着左卡尼汀口服液浓度的升高,其抑制反应 体系产生羟基自由基的能力也随之升高,反之亦然。 上述体外试验证明,左卡尼汀口服液可有效抑制黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应 体系中产生的超氧阴离子自由基能力及反应体系产生羟自由基的能力, 且稀释倍数与超氧阴离子、羟基自由基能力值呈良好线性关系,的增多使超 氧阴离子和羟自由基来源减少,遏制其对机体的氧化损伤,具有体外抗氧化 作用。 目前国际上有关的体内研究主要在患病机体的治疗方面,未见有健康人 的试验,鉴于是重要的内源性物质,内环境稳态的破坏可使其消耗增加,因 此有必要研究补充外源性对健康人的作用,因此选择健康人作为研究对象; 半衰期短,但是抗氧化作用较强,由于是以原型通过肾脏排泄,服用 口服液后尿中各项抗氧化指标的变化未见有报道,因此,本课题系统研究了 口服液对健康人体内血浆和尿液抗氧化指标的变化。 体内试验证明,可提高健康受试者血浆及尿液的抗氧化酶和抗氧能 力,并能清除血浆及尿液的和。单剂量口服盐酸左卡尼汀口服液 。 后 ,可提高健康受试者血浆抗氧化酶,?和尿 液和血浆及尿液的抗氧能力总抗氧化能力、抗羟自由基能力和抗超氧阴 离子,并且血浆、尿液抗氧化酶和抗氧能力均较服药前显著增加,抗氧能力在 达最高, 逐渐降低至正常水平;同时左卡尼汀口服液可降低血浆和 尿液和的含量,和分别在和降低,而后逐渐恢复正 常水平。本课题组既往进行了口服液单次给药后在中国健康受试者体内 . ,~ 的药代动力学研究,血浆中蚴为. 尿液中含量最高, . 为. 。血浆与尿液中各检测指标的变化与左卡尼汀口服后在体 内的吸收代谢时间相一致,说明可通过提高机体的各种抗氧化酶提高抗氧能 青岛大硕士学位论学文 力来清除自由基,不但清除氧自由基而且也能清除氮自由基,从而发挥其抗 氧化 作用,维持内环境的稳态。具体机制如下分述。 生物体内自由基的清除主要是酶促系统,..主要包括,和? 等,它们可分别作用予自由基链锁反应的不同环节,在体内担负着清除自由 基的 重要任务。 广泛存在于各种细胞中,是机体内清除自由基的重要抗氧化酶,其功 能主要是对超氧阴离子自由基起歧化作用,超氧阴离子自由基歧化生成, 根据自由基链锁反应的典型特征,仅单纯提高一种抗氧化酶的活力,改善一 个环 节的抗氧化能力并不能完全解决问题,可进一步被分解生成,从 而有效地阻止自由基链锁反应【。的活性中心有一个金属离子、 或,使两个超氧阴离子自由基不需要接触,通过金属离子就可以不断交换 电子,大大加快了反应速度。若无,超氧阴离子自由基反应生成单线态氧; 有时,不生成单线态氧,其催化超氧阴离子的反应速率提高倍【】,能 有效地清除自由基,防治自由基对人体的毒害作用。对机体的氧化与抗氧 化平衡起着极其重要的作用,活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能 力。裴媛等研究显示, 及.活力对机体的抗氧化活性起指示作用, 、.活力高,说明机体抗氧化活性强‖。左卡尼汀因可提高健康受 试者血浆抗氧化酶,.和活力,因此具有有效清除自由基 和脂质过氧化物。衰老可引起自由基产生增多,刺激活力增强,以保持人 体处于相对平衡状态。一旦失衡,可引发老年性痴呆、脑损伤、肿瘤等。脑 血管 病发病机制之一是自由基的损伤,提高的水平能减轻脑血管病的损伤程度 【】。另外,肿瘤局部水平大多下降,尤以锰下降居多。据报道, 具有抗癌活性,能维护正常细胞功能。提高水平,有利于肿瘤的防治,并 能减轻肿瘤治疗过程中的全身与局部反应,增进食欲【叫。在老年痴呆的防 治中也 有显著意义【叫。临床上,许多药物及食物能显著增强活力,提高人体的 抗病能力。因此,左卡尼汀可通过提高,清除超氧阴离子自由基,起到抗 氧化、预防衰老、肿瘤等疾病的作用。 早在年,提取了过氧化氢酶,,后来发现几乎所有 需氧生物体内都广泛存在过氧化氢酶【】。是金属酶,也是一种末端氧化酶, 是细胞抵御活性氧伤害的一种很重要的酶【】。是自由基的前体,可催 化分解为,降低细胞中浓度,防止细胞膜脂质过氧化。 等研究显示,大鼠服用左卡尼汀后,可提高缺氧机体的和,降 低; 等研究发现左卡尼汀可降低辐射引起的细胞质的 第四章讨论 含量,升高和,对抗辐射引起的氧化应激【。与上述研究一致,本研 究证明左卡尼汀提高含量的同时也可以提高,使与协同, 通过链式反应清除催化的反应产物过氧化氢,即将超氧阴离子自由 基歧化生成,然后由将进一步分解生成,从而有效清除自 由基,发挥抗氧化作用。 ?是一种重要的抗 谷胱甘肽过氧化物酶 , 氧化酶,主要存在于胞浆和线粒体基质中,?在细胞中的比例高达%, 线粒体中为%。?是含硒的酶蛋白,由二种酶组成,起主要 作用,负责催化及有机过氧化物的还原;另一部分仅还原有机过氧化。的 缺乏使.活性低下,引起组织损害。?不直接清除自由基,其中的 巯基能与活性氧结合,将有毒的过氧化物还原成无害的羟基化合物,使过氧 化物 天后可明显降 得以分解和清除【。等人研究发现【,服用 低老年大鼠的脂质过氧化物,并且提高谷胱甘肽过氧化物酶、和,并 显著抑制老年大鼠淋巴细胞的损伤、凋亡和.的水平,可能通过抗氧 化作用提高免疫系统的功能。与该研究类似,本试验证明左卡尼汀也可提高 血浆 中的.,抑制自由基的生成,避免氧自由基氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸 形成脂质过氧化物,从而保护组织细胞。 左卡尼汀提高血浆和尿液中的上述抗氧化酶含量必定会提高机体的抗氧化 能力,进一步检测血浆和尿液中左卡尼汀的抗氧能力,证明左卡尼汀可提高 机体 的总抗氧化能力 ,、抗羟自由基能力和抗超 氧阴离子能力。 是机体抗氧化力量的总体体现,是机体抗氧化自由基的主要体裂聪。 该防御体系有酶促与非酶促两个体系,酶促体系包括超氧化物歧化酶、 谷胱甘肽过氧化物酶?、过氧化氢酶、谷胱甘肽一转移酶 等;非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。该体系的抗氧化作 用主要通过三条途径:?消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化;?分解过氧 化物,阻断过氧化链;?除去起催化作用的金属离子。防御体系各成分之间具有 协同、代偿和依赖作用。因此提高健康人血浆和尿液的,可以避免自 由基过度产生和机体的抗氧化防御体系功能严重受损,有效阻止自由基造成的细 胞及生物分子的氧化损伤【】。 等研究氧化损伤对糖尿病免疫机制的影响中 发现,可以抑制氧化损伤脂过氧化物,蛋白质氧化,、钙等,提高 、线粒体膜电位、凋亡诱导因子 ,和,提示通过抑制 氧化损伤、凋亡诱导因子,增强线粒体功能而提高糖尿病患者的免疫机能【。 抗超氧阴离子能力的增高可使超氧阴离子的产生减少,体内抗氧能力检测表 青岛大硕士学位论学文 明,可提高健康志愿者的抗超氧阴离子能力。单次口服左卡尼汀口服液 后,血浆抗超氧阴离子自由基的能力亦逐渐增高, 达最高,而后再逐渐降低 至正常水平,与左卡尼汀口服后在体内的吸收代谢时间相一致。而尿液的抗超氧 阴离子自由基的能力也随着左卡尼汀在尿液中排泄量的变化而变化,先增高而后 逐渐降至正常水平。 还可提高健康志愿者的抗羟自由基能力。单次口服左卡尼汀口服液 后, 血浆抗羟基自由基的能力亦逐渐增高, 达最高,而后再逐渐降低至正常水平, 与左卡尼汀口服后在体内的吸收代谢时间相一致;尿液的抗羟基自由基能力也随 着左卡尼汀在尿液中排泄量的变化而变化,先增高而后逐渐降至正常水平。因此, 补充外源性左卡尼汀,可以升高体内左卡尼汀水平,预防与阻断羟自由基对机体 的损伤与破坏,从而防止多种疾病的发生、发展,并能提高机体抗辐射能力。 一氧化氮 ,是由.精氨酸.,胍基氮经合 酶烈 ,的催化发生氧化而形成。既兼有第二信使和神经递质 的功能,又是效应分子,介导和调节多种生理和病理过程。神经退行性疾病与一 氧化氮自由基有一定的关系,在发病过程中都有一氧化氮自由基的产生和参 与 【‘是内皮松弛因子,可以松弛血管,降低血压【,理论上讲,对组织 缺血再灌注损伤应该有保护作用,但有许多研究表明,自由基在组织缺血再 灌注损伤时起着相反的作用。如对大鼠脑和心脏进行缺血再灌注,与缺血再 灌注产生的氧自由基协同作用,损伤神经细胞和心肌【”】。 可与超氧阴离子自由基快速反应生成过氧亚硝基,质子化后生成 和类羟基自由基。这些化合物相互反应在生物体内生成一系列具有重要生理功能 的自由基和硝基化合物【】。过氧亚硝基在碱性条件下相当稳定,允许它由生成 位置扩散到较远的距离;一旦周围体液稍低于生理条件,立即分解生成氧化 性更强的和类羟基自由基,二者具有很强的氧化性和细胞毒性。过氧亚硝 基在生物体内具有特别重要的意义,生理情况下,多形核白细胞在吞噬过程中释 放和超氧阴离子自由基,病理情况下,如心肌缺血再灌注损伤时也是释放 和超氧阴离子自由基,说明无论是生理过程还是病理过程体内都会产生大量 过氧亚硝基【】。因此,研究左卡尼汀对健康人的清除具有重要意义,国际 上对健康人血浆及尿液一氧化氮自由基研究的报道很少,本研究旨在观察有 效清除氧自由基同时是否具有清除氮自由基的能力。 治疗临床疾病的研究显示,一氧化氮抑制作用是治疗疾病的药理基 础。许多研究表明,左卡尼汀对老年痴呆症【】、中风【、心肌缺血【】等疾病 有明显疗效。 研究报道可降低成纤维细胞的活性,使产 第四章讨论 生减少,调节对抗过氧化氢的能力【。与上述研究类似,本研究证明,对健 康志愿者体内的产生也具有抑制作用,单次口服左卡尼汀口服液 ,在体 内吸收入血由肾脏排除的过程中,检测到血浆和尿液中一氧化氮的含量随着 时间 的推移是先降低后升高,充分说明左卡尼汀具有降低一氧化氮生成,清除氮 氧自 由基的作用。 丙二醛是机体内脂质氧化产生的脂质过氧化物,的高低间接 反映了机体细胞受自由基攻击的程度【们。氧自由基可以通过攻击生物膜中 不饱 和脂肪酸,形成一系列脂质过氧化物,是这些脂质过氧化物的降解产物。 作为脂质过氧化的终产物,丙二醛能使膜蛋白、酶发生交联反应,引起蛋白 质交联变性、断裂,加重细胞的功能结构损害,破坏组织结构。含量 对机体的抗氧化能力起指示作用,含量低,说明机体抗氧化能力增强【。 发现,尼卡汀缺乏,引起大鼠血浆,增高,降低肾的 水平,可诱发肾病【。本研究证明,健康志愿者单次口服左卡尼汀口服液 后,其血浆中的水平呈不断降低的趋势,至小时降至最低,由服药前的 . ?降至. ?,而后又不断升高,至小时升至. ?,各点之间有显著性差异;健康志愿者尿液中量也有显著变化, ?,~ ?。血 服药前为. 间收集的尿液含量最低,为. 浆与尿液中含量先低后高的变化与左卡尼汀口服后在体内的吸收代谢时间 相一致,说明左卡尼汀可通过降低体内含量降低体内脂质过氧化的发生, 从而保护体内膜蛋白、,细胞的功能结构,预防疾病发生。 总之,口服液在体内外通过提高健康受试者血浆抗氧化酶,. 和尿液以及血浆及尿液的抗氧能力总抗氧化能力、抗羟自由基 能力和抗超氧阴离子,降低,不但清除氧自由基,还可以清除氮自由基, 使左卡尼汀在防治自由基相关疾病方面比一般的抗氧化剂更具有优势,是优质的 氧自由基和氮自由基清除剂。 结论 通过本实验可以得到以下结论: .本试验首次测定了不同浓度左卡尼汀溶液对体外生成超氧阴离子自由基、羟 自由基能力的影响,并建立了稀释倍数与自由基生成能力的线性方程,证明左卡 尼汀具有体外抗氧化活性。 .本试验首次测定左卡尼汀溶液对健康中国人血浆、尿液自由基浓度及抗氧化 酶活性的影响,证明左卡尼汀可显著提高抗氧化酶活性及抗自由基能力,降 低 青岛大硕士学位论学文 自由基及浓度,表明左卡尼汀可以明显提高健康人体的抗氧化能力。 参考文献 【】. . ,:?. 】. .【】. , ,. ,,:.. , 【】. , , . : . ,:?. , , ., 【】. . 磁 ,:?. . 【】. ,. . .,:?. .【】. , , . . ,:. 【】. ,. . . , :?.. 【】. 八 , . , ,:?. . 】. . . ?. ;: 【.林修,叶榕,王耀新.卡尼汀治疗急性脑梗死】.中国新药与临床杂志,,. , , , 【 】. .?. ,, :. 参考文献 , , 【. , . . ,,:. , ,, .. ,,:. , , 【. , . ? .,, :. .涂向阳,魏世超等.贝康亭治疗例有机磷中毒心肌损害临床观察【】.福建医 学杂志, ,:. 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