BTLA介导的负调共刺激信号对混合淋巴细胞反应抑制的研究

BTLA介导的负调共刺激信号对混合淋巴细胞反应抑制的研究 BTLA介导的负调共刺激信号对混合淋巴 细胞反应抑制的研究 1366 ? 论着? BTLA介导的负调共刺激信号对 重庆医学2006年8月第35卷第15期 混合淋巴细胞反应抑制的研究 冯嘉瑜,宋波,张艮甫,黄赤兵,王平贤,范明齐,肖亚,贾维胜,方针强 (1.第三军医大学西南医院泌尿外科,重庆400038;2.第三军医大学新桥医院泌尿外科,重庆400037) 摘要:目的HVEM基因突变体腺病毒载体对大鼠混合淋巴细胞反应(MLR)的影响.方法RT—PCR获得人HVEM的 cDNA,使其与uGHT分子结合的表位点突变,保留与BTLA结合的关健位点.构建经修饰的HVEM基因的复制缺陷型腺病毒 载体Adv—mHVEM-IRES2一EGFP并对其进行鉴定和转染效率测定.将该载体用于混合淋巴细胞反应中,观察对淋巴细胞增殖的 影响.结果成功构建HVEM突变体和EGFP复制缺陷型腺病毒载体,经过测序与预期一致,体外培养细胞转染效率达到95 以上.该载体能够对大鼠MLR有明细的抑制作用.结论构建的腺病毒载体能够共表达目的基因的产物HVEM突变体和 EGFP蛋白,对体外细胞具有高效转染能力.该载体能够对大鼠混合淋巴细胞反应有明显的抑制作用. 关键词:共刺激信号;HVEM;突变体;BTLA;腺病毒表达载体 中图分类号:Q26文献标识码:A文章编号:1671—8348(2006)15—1366—03 COnstructiOnandidentificatiOnOfAdv-mHVEM-IRES2-EGFP FENGjia—yu,ZHANGGen—fu,HUANGChi—bing,eta1. (1.DepartmentofUrology,SouthwestHospital,MilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China; 2.DepartmentofUrology,XinqiaoHospital,MilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China) Abstract:ObjectiveToobservetheefficacyofHVEMgeneAdvvectorinmixedlymphocytereaction(MIR).Methods HVEMcDNAbinddomainofLIGHTwasmutatedbyRT— PCRandPCR.AdenovirusexpressionvectorAdv_mHVEMIRES2一EG— FPwasconstructedwithmHVEMandEGFPbymeansQfAD-Easysystem.Thevectorwasidentifiedandevaluatedtheefficiency oftransfection.Theadenovirusvectorwasusedinmixedlymphocytereaction(MLR).ResultsHVEMandEGFPwereexpressed intheculturecellstransfectedbythevectorwithatransfectionefficiencyover95.MRLcouldbeinhibitedbytheadenovirusvec— tor.ConclusionTherecombinatevectorAdv—mHVEM—IRES2一 EGFPcouldexpresstheproteinofmHVEMandEGFPineellline withhightransfectionefficiency.MRLcouldheinhihitedbytheadenovirusvector. Keywords:co—stimulatorysignals;HVEM;mutant;BTLA;adenovirusexpressionvector 在移植免疫中,T细胞的需要MHc_抗原肽一TCR提供的 第1刺激信号和共刺激分子提供的共刺激信号方能激活,二者 缺一不可.近年来对共刺激分子的研究发现,共刺激信号不仅 有提供正性共刺激信号的分子(如:CD28一B7,CD40一CD154), 也有提供负性共刺激信号的分子(CTLA4一B7,PD1一PDIL,BT— LA—HVEM其中后2个分子均是在近年来得到克隆和鉴 定)_】].HVEM属于TNF受体超家族的成员,它扮演一个双 相调节T细胞激活的角色,通过LIGHT配体提供给T细胞一 个阳性信号],通过Ig超家族的BTLA提供给T细胞一个抑制 性信号J,通过竞争性结合和突变显示了BTLA与HVEM 结合的位点在HVEM的CRD1去的酪氨酸残基上.BTLA 在HVEM上的结合位点是保守的TNFR-UI144区,出现在人 类的巨细胞病毒(CMV)中,UL144只与BTLA结合而不和 LIGHT结合,并抑制T细胞的激活].本研究拟对HVEM 的LIGHT结合区进行点突变,使其仅与BTLA结合,达到抑 制T细胞增殖的作用.将经过修饰的HVEM和EGFP构建 到复制缺陷型腺病毒表达载体中,用于后期观察该分子对负调 共刺激信号的激活作用. 1与方法 1.1主要试剂各种限制性内切酶,T4DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶,RT—PCR试剂盒购自ROCHE公司.PCR产物 *基金项目:国家自然科学基金资助项目(3057l863). 通信作者 试剂盒,小量质粒提取试剂盒,琼脂糖凝胶回收试剂盒,DNA 快速连接试剂盒,TaKaRaMutanBESTKit购自宝生物公司. 脂质体转染试剂盒LipofectinReagent购自Invitrogen公司, AdEasyXLAdenoviralVectorSystem试剂盒购自Stratagene 公司. 1.2质粒及抗体pGEMT—Easy质粒购自美国Promaga公 司,pUC18,pUC19购自宝生物公司,plRES2一EGFP(Clontech 公司)质粒由第三军医大学西南医院烧伤研究所贺伟峰博士惠 赠,HVEM质粒购自ATCC(ATCCNumber,MGC一3753), HVEM(Cw1O)PE抗体购自SantaCruz公司. 1.3菌株及细胞株大肠杆菌JM109由第三军医大学西南 医院烧伤研究所提供,293细胞株,PK15细胞株由第三军医大 学西南医院烧伤研究所提供. 1.4方法 1.4.1通过PCR方法扩增HVEMcDNA片断,扩增的cD— NA连接到pGEMT—Easy质粒中进行大量扩增.按照文 献口'中介绍的氨基酸残基位点对HVEM的LIGHT结合区 进行点突变,突变采用TaNaRaMutanBESTKit试剂盒进行. 得到的mHVEM(突变后的HVEM)片断与plRES2一EGFP质 粒连接,连接后得到pmHVEM—IRES2一EGFP,同时转DH5d感 受态菌株进行扩增,酶切和电泳鉴定.SalI酶切得到的mH— 重庆医学2006年8月第35卷第15期 VEM—IRES2一EGFP片断与pShuttle质粒进行连接,得到进行 同源重组的穿梭质粒pShuttle-CMV-mHVEM-IRES2一EGFP, 同时转DH5d感受态菌株进行扩增,酶切和电泳鉴定.pShut— tle-CMV—mHVEM—IRES2一EGFP穿梭质粒在BJ5183菌株中 与pADEasy-I质粒进行同源重组,将目的基因重组到腺病毒 基因组质粒中得到pADEasy.CMv_mHVEM—IRES2一EGFP质 粒,同时进行克隆扩增和酶切鉴定. 1.4.2ADEasy—CMV-mHVEM—IRES2一EGFP重组腺病毒的 生产按以下步骤完成(1)293细胞株的培养;(2)转染293细 胞,4,7d后观察细胞病变效应(cytopathiceffectCPE);(3)收 集病变的293细胞和培养上清液反复冻融,离心后进行脱水浓 缩得到重组腺病毒.293细胞培养48h后进行铺片,待细胞融 合达到8O%后室温下进行腺病毒转染,第3天用4甲醛固 定,用HVEM(CWlO)PE抗体进行免疫荧光染色,6O甘油 封片,共聚焦显微镜下观察mHVEM和EGFP的表达.感染 重组腺病毒的PK一15细胞培养72h后,取出细胞铺片,4的 甲醇固定10min,共聚焦显微镜下观察EGFP荧光蛋白表达, 并测定转染效率. 1.4.3用供者(BN大鼠)和受者(Lewis)脾淋巴细胞进行混合 淋巴细胞反应.通过淋巴细胞分离液进行淋巴细胞的收集,用 1O小牛血清的1640培养液将细胞密度调整为1×10/ml. 腺病毒平均感染强度(M0I)为1和1O的ADEasy-CMV-mH- VEM-IRES2一EGFP重组腺病毒感染BN大鼠淋巴细胞,并作 为刺激细胞,细胞浓度为:1×10/ml,经丝裂霉素处理后,分别 以50#l/;K,10倍稀释后再加入3个复孔.再加入浓度为1× 10/ml的Lewis大鼠淋巴细胞lOO~1.37?,5COz,饱和湿 度条件下,培养96h.结束前18h加3H-TdR,0.5微居里/孔. 用细胞收集器将细胞收集于滤纸上,PBS洗涤数次,无水乙醇 固定,晾干;液闪液避光3h.液闪计数CPM值,结果用3孔平 均值表示. 2结果 2.1HVEM片断通过TaKaRaMutanBESTKit试剂盒进行 点突变,得到的目的片断经过测序与预期相符.ADEasy试剂 盒中提供的pShuttle-CMV质粒与mHVEM—IRES2一EGFP质 粒连接,构建pShuttle—CMV-mHVEM—IRES2一EGFP穿梭质 粒,凝胶电泳鉴定可见到9.5kb大小的片段,与预期相符. pShuttle—CMV-mHVEM—IRES2一EGFP穿梭质粒在BJ5183菌 株中与pADEasy—I质粒进行同源重组,在XHindllIDNA marker做对照时,可以观察到紧位于23Kbp带的位置的电泳 带,证明同源重组成. 2.2激光共聚焦显微镜观察mHVEM和EGFP的表达,红色 为PE标记的HVEM单抗结合点,绿色为EGFP表达产物的 荧光.证明构建的腺病毒表达载体能够同时共表达mHVEM 和EGFP蛋白.构建的腺病毒载体体外转染PK15细胞72h 后用激光共聚焦显微镜观察,>95细胞能够表达EGFP,证 明构建的腺病毒载体对体外培养的细胞具有高效的转染能力. 表1不同感染强度的腺病毒对混合淋巴细胞反应的影响 组别 腺病毒平均感染强度(MOI) l10 1367 2.3感染ADEasy—CMV-mHVEM—IRES2一EGFP复制缺陷型 腺病毒的BN大鼠淋巴细胞进行MLR时,对PBMC增殖能力 有明显的抑制作用P<O.01,见表1. HVEM腺病毒载体对混合淋巴细胞反应在M0I为1和 1O的时候有显着抑制. 3讨论 T细胞的活化和分化是一个非常复杂且有多种调节因子 参与的有序过程,移植免疫的最终目标是诱导抗原特异性耐 受,即抑制特异性移植物免疫反应而保留对炎症和肿瘤抗原的 免疫反应.多年来对于共刺激信号的研究,对相关分子结构和 功能的认识已大大深化,特别是其中的B7分子及其受体家 族.该家族的负向调控作用是通过其抑制性受体来实现的. 目前已发现3种抑制性受体:细胞毒性T细胞相关分子(CT- LA_4),程序性死亡分子(PD-1)]和B,T细胞弱化因子(BT— LA)EaJ.B,T淋巴细胞弱化子(BandTlymphocyteattenuator BTLA)是新近发现的一种淋巴细胞抑制性受体,含有2个免 疫受体酪氨酸依赖性抑制基序(ITIM),可以介导抑制T细胞 的作用,BTLA缺陷鼠表现自身免疫紊乱的发病率增高及其严 重性增强_9. 过去文献显示BTLA的天然配体可能是B7H4和 B7S1l_113],但是不久就有直接证据证明BTIA的配体是 HVEM(人类疱疹病毒侵入介导分子).BTLA属于免疫 球蛋白超家族成员,而HVEM属于TNF受体超家族成员,新 近的发现把这2个家族也联系起来.HVEM与BTIA的酪氨 酸抑制性Motif结合,诱导酪氨酸磷酸酶活化,从而提供给T 细胞一个负向调节信号,抑制T细胞的激活.然而,HVEM 还可以和TNF超家族的LIGHT和LTa分子结合,提供给T 细胞一个激活信号.所以HVEM扮演着一个双相调节T细 胞激活的角色_5]. 本研究通过对HVEM的基因进行突变修饰,将HVEM 与LIGHT结合的区域进行点突变,保留和BTLA分子结合的 CRD1(酪氨酸富集区1)区域.进一步构建修饰过的HVEM 基因的腺病毒表达载体.复制缺陷型腺病毒表达载体用于体 外细胞转染和在体转染具有特有的优势,具有毒性小,免疫原 性弱,转染效率较高,目的基因产物表达时间较长等优点.本 研究构建的ADEasy_CMV—mHVEM—IRES2一EGFP载体.通过 鉴定和检测具有表达目的基因的能力,并共表达示踪蛋白EG— FP,对体外培养的细胞具有高效的转染能力,可以进行对BT- LA—HVEM信号通路研究的工具载体.BN—Iewis大鼠MLR 具有高反应的特点,我们利用构建的HVEM突变体载体转染 其反应体系,观察其对MLR的作用,而且我们也发现该分子 的基因通过蛋白表达,能够显着抑制混合淋巴细胞反应的细胞 增殖程度,作为一个负向共刺激信号调节分子,它也有希望对 移植耐受的诱导提供更多的策略E"]. 参考文献 [1] E2] LatchmanY,WoodCR,C:hernovaT,eta1.P【)-L2iSa secondligandforPD-1andinhibitsTcellactivation[J~. 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