牛膝高分子物质的细胞毒性及其组成的初步研究

牛膝高分子物质的细胞毒性及其组成的初步研究 牛膝高分子物质的细胞毒性及其组成的初 步研究 ,f一, ? 中药及天然药物? 牛膝高分子物质的细胞毒性及其组成的初步研究 , 巢志茂波浞庸一神藤平三郎松本潮竹谷孝一糸川秀治(北京[0070D中国中医研究院中药研究所;_东 景裔奔孚菇筝部)一 摘要目的:研究牛膝对P388白血痛细胞的体外细胞毒性及其活性成分.方法:牛膝根以水提取,经ToyopearlHW一,IOC凝 腱过滤,得到高分子物质部分一以P388白血病细胞的体外培养确定细胞毒活性.以SephacrylS一200进行分离和纯化. 以’H-NMR进行初步的组成鉴定:结果:牛膝水提取物的高分子物质部分有细胞毒性,Ic弼值为52,ml.多耱为其主要 成分,由禾糖,甘露耱和果耱等单耱做成.结论:牛膝水提取物的高分子物质部分对P388白血病细胞有显着的体外细胞毒 性.;耱可能是细胞毒性成分=,-,, 关键词牛睦;细胞毒性;P388白血痛细胞;多耱;高分子物质.,? 年, Cytotoxicityofhigh?molecularextractfromAchyranthesbidentatar6otanditschemicalcomposition ChaoZhimao(ChaoZM),YoichiShibu~wa,Hei~bumShindo,etal(InstituteChineseMateriaMedica,C;hinaA— cadernyo{TraditionalChinese,Medicine,BeijinglO0700) ABSTRACT0BJ哪? E:Tostudytheactivecompositionof1heextractfromAchyranthesbido~tataroot.Bl(amaranth~ceae)and itscytotoxicltyagai~P388】 eukerniacellsinvitroMETIiODS:,vatermaceratingextractofA.b/dg~fafarootobrainedandiso- latedbyR?dHW一 40cfihrationtogetahigh-molecularpartInvitroc.vtotoxicitywasbasedonculturingP388leuk~ia ceils.Activecompositionw~peratedandpurifiedwithSephacrylS一 200fromtbehigh-molecularpartandidentifiedwithNMR spectralR瞪iuI:(0咖city(I(5.2pg?ml)Willsdetectedandapolysacchaddef伽ndtobeamainoc~positionofthe high-molecularpart,whichwoncomlxr~a:lofxy|ese.mann(精 e,fract~eandsoonCONCLUSION:High—molecularpartfromwater maceratingextractof_4b/dgnta~roothasaremarkablec~ntotoxicityagainst P388|eukmaiacellsinz4troThepolysaccharideofA b/dentaterootmaybec)~otoxic KEYWORDSAchyranthesbidentata,c}~totoxieity,P388ieukmaiaceils,p olys~ccharide,high-molecularextract 中药牛膝为苋科植物牛膝(Achyranthesbiden. tatClB1,)的干燥根,朴肝肾,强筋骨,逐淤通经,引 血下行,用于腰膝酸痛,筋骨无力,经闭癍瘕,肝阳眩 晕.现代药学研究已将牛膝试用于肿瘤的辅助治 疗. 多糖为牛膝中一类含量较高的组分,通过分离, 已得到一个相对分子量为23x10的肽多糖,其中 肽含量占24,7%_1J,以及由6个葡萄糖残基和3个 甘露糖残基组成的九聚糖一.通过药理实验证明, 牛晾的粗多糖在小鼠体内试验中能明显增强机体免 疫功能,抑制肉瘤S180的生长_3J,能从细胞和分子 水平增强小鼠巨噬细胞的功能,对细胞因子IL.1及 肿瘤坏死因子TNF-n产生促进作用_4;在体外试验 中能增强天然杀伤细胞(NK)的活性,促进伴刀豆球 蛋白(ConA)诱导的肿瘤坏死因子卢的产生_5J但 尚未见到牛膝多糖对肿瘤细胞有直接作用的研究报 道我们就牛膝的高分子物质部分对P388白血病 细胞体外培养的细胞毒性及其化学成分的分离纯化 和初步鉴定进行了研究,现报道如下 l材料和仪器 牛膝为日本束京汉方药店市售的中国产牛膝的 生药饮片,经中国中医研究院中药研究所谢宗万研 究员鉴定为苋科植物牛晾Achyranthesbidentata B1的干燥根;P388白血病细胞来源于日本癌研究 所化学疗法部,蓝葡聚糖(bluedextran2000)和 SephacryIS一200购自瑞典Pharmacia公司.Toy一 0pear1HW一40C凝胶购自日本TOSOH株式会 社’H.NMR采用BrukerAM,400型核磁共振光 谱仪,D)o溶剂,TSP内标;Uv采用日本岛津 U一1200分光光度计. Chint:gaa~』.t999Maytw34No5,299 2方法和结果 2.1提取 牛膝lo00g,分装于4个2000ml三角烧瓶中, 共加入50oom1蒸馏水,置于转速100r?min..,温度 (23?1)?的摇床内振摇24h,过滤.药渣以蒸馏水 按上述条件再振摇提取2次,每次3000ml.合并3 次滤液,离心(5000r?rain×20min,4”C),取上清 液,冷冻干燥,得到浅白色的粉末状提取物616g,收 得率为61.6%. 2.2分离 22.1凝胶过滤柱的装备ToyopearlHW-40C凝 胶以蒸馏水漂去上浮颗粒,按自然落差填充法装入 玻璃柱(3.74cm×43.5era),测得凝胶柱床的总体积 (Vt)为478ml,以蓝葡聚糖测得凝胶颗粒之间的液 相体积(Vc,),即”空隙体积”或”外水体积”为 149ml. 2.2.2凝胶过滤的操作取10g提取物,蒸馏水溶 解至10ml,离心(8000r?rain×10min,412)除去少 量不溶物后,装入ToyopearlHW一40C凝胶色谱 柱,蒸馏水洗脱,流速l5ml?rain,自动收集仪收 集,每份20.合并相关部分,冷冻干燥,从而分离 成3个部分.第一部分(GF1);第6,10份白色粉 末,0.59g,电导值为0.0mS,系280ikrrl紫外吸收的 第1个峰,蒽酮浓硫酸反应阳性,为高分子物质部 分.第2部分(GF2):第1l,21份,7.18g,电导值 为01,07InS,系280nm紫外吸收的第2个峰.第 3部分((F3):第22,70份,103g,电导值为00 mS,系280rim紫外吸收第2个峰的拖尾部分. 2.3体外细胞毒性测定 23.1测定方法每毫升3.0×104个P388白血 病细胞液,以每穴100”l添加于96穴中,以 RPMI1640.2ME和10%ns培养.将一定浓度的 试液加入培养液中培养48h,每穴加入MTT(5mg- ml)20”l继续培养4h,然后每穴加入的10%SDS- 0.01tool-LHCI溶液100ul,使MTTformazan溶 解,测定组与对照组进行定量比色对照.提取物的 50%抑制值(I0)低于30,ug?ml即被认为有 效[. 23.2测定结果GF1的|c50值为5.2t.tg?ml, GF2,GF3和提取物的Ic?值均大于100~g-ml,. 以100~g?ml的剂量给药,测得GF2,GF3和提取 物的抑制率分别为46%,30%和11%. 24GF1的组成分析 241GF1的分离与纯化取100mgC-F1,置于 ?-chinPharatJ,1999May,.34No5 S,ephac~lS一200色谱柱(250cm×380cm,t为 186ml,Vo为73)上,蒸馏水洗脱,每8ml收集一 份,以280nm紫外检测蛋白质的吸收,以蒽酮浓硫 酸反应后的550nm可见光检测多糖的吸收.合并 相关部分,冷冻干燥GS1:第9,13份(保留体积 为65,104m1),上述2种吸收均阳性,6mg,纯化收 率为6%GS2:第l7,2l份(保留体积为137, 168nil),无蛋白质的吸收但有多糖的吸收,67mg,纯 化收率为67%. 2.42GS1和GS2的初步鉴定GSl:白色粉末状 固体rO交换后的H-NMR图谱显示,除具有与 下(;s2相似的质子吸收峰外,还有硒.20,5.10, 5oo.4.95,4.84,2.11,1.75,1.oo的吸收峰,基线 不平稳结果表明古有除多糖之外的其它成分; GS2:白色粉末状固体..交换后的H-NMR图 谱显示,5524(bs)为糖元端基质子的吸收峰,84.09 , 332为糖元骨架上的质子吸收峰.除此之外,无 其它吸收峰,且基线平稳.结果表明(S2为比较纯 净的多糖. 2.43GS2的单糖组成取20mgO盟,加2 tool?LCF3OOOH2ml,于121?反应100min.反 应物与多种单糖标准品同时进行硅胶薄层层析,结 果显示在与木糖,甘露糖和果糖相同的位置有相同 颜色的斑点. 3小结与讨论 3.1中药牛膝以水浸提取,在ToyopearlHW-40C 凝胶颗粒的液相体积(vb)附近,得到的高分子物质 部分(GF1)对P388白血病细胞体外培养有显着的 细胞毒性,I0为52,ug-ml.而低分子物质部分 (GF2,GF3)和水提取物无效.关于牛膝对肿瘤细 胞的这种直接作用,系首次报道. 3.2通过SephacrylS一200凝胶过滤的应用,将牛 膝的高分子物质部分(GF1)分离成保留体积为液相 体积(vo)附近及之后的两个部分.在液相体积之 后的部分(GS2)经初步鉴定为一个比较纯净的多 糖,为(1的主要成分,其收率相当于生药的 244%.该多糖由术糖,甘露糖和果糖等单糖组成, 其纯度,分子量,结构的测定及与细胞毒性的关系等 工作有待我们的进一步研究. 参考文? 1方积年.张志花.莉柏年牛瞎多糖昀化学研究药学. 】990.25(7):526. 2惠永正,邻卫,田庚元牛辟根中一活性寡精tAl:,s)的分离和结 构研究化学.1989,47(6):621. 3何道斌,李晓玉牛膝多糖对免疫缺陷动物的免疫调节作用中 国药理通讯,1992,9(3);33 国药学杂志1999年5月第34卷第5抽 4何道斌.李晓五牛膝多糖对小鼠巨嚆细胞功能的增强作用.中 国药理通讯.1992,9(3):32 5向道斌.蒋超,李晓玉牛膝多糖对T淋巴细胞和天然杀伤细胞 功能的影响.中国药理学与毒理学杂志.1994,8(3):209 歹I一,上 秦岭太白野葛根异黄酮成分的研究 6hokawaH.”funY.MonmH.etalCytotoxlc”nsfrom “sofAngelicagigasna由INaturudMediclne~1994,(4): 334 (收稿:19984)7.23) 张尊听王小玲刘谦光陈战国高子伟(西安7l.062陕西师范大学化ri 摘要目的:对秦岭太白野葛根(PuerariaLobata)的异黄酮成分进行分离鉴定.方法:以甲醇冷浸提取物.硅胶柱居析分离. 理化常数和光谱数据确定异黄酮类化舍物的结构.结果:分得6十异黄酮成分,分刺鉴定为芒栖花素(I),戈豆苷元(?),3’一 甲氧基葛根素(?),8.碳.芹菜糖(卜6)葡萄糖戈豆苷(?),戈豆苷(V)和葛根素(?).结论:化合物(I),(?)和(?)系首次 从谊植物中分得 关键词曼蔓;尊葛根走 聃 Studiesoni~flavonoidconstituentsofrootsofQinmountainTaibaiPuerarial obata ZhangZunting(ZhangZT),WangXiaoling(WangXL),LiuQianguang(Liu QG),et(1~partmentfCl~n istry,ShanziNormo!Uniz~sity,Xi’an710062) ABSI’RACI”oBJ肼 IVE:Tostudyisoflavonoid0f~/kc,tJtttenlsofroot8ofQjnii’loLintain血 Lo~ttam: Isoflavonoid?mp(Ve~/’eseparatedbymo~,iisofooolmethanolextractic~a ndchrotrtatographyonsilicadIBstructurewerede. termiridbyphys~,chcmicaIandraldata.RlUU[s;Sixisoflavonoido锄 plndsVe~/’eisol~ted[mmmethanolandidcntifiedas (1)[3onnonc~etin,(2)Daidzein,(3)3’-methoxypuerarln,(4)8一 C.osy1(1—6)gIuo.sideofdaidzein,(5)Daidzinand(6)Puerarin. COI~’LUSION:Compotrand(1j,(3)and(4)Wely~separatedfromChinesePuerariaLforthefirsttime KEYWORDSPuerarlal~bata(WilldjOhwi,isoflovonid.puerafin 野葛根[Puerariakd~ata(Willd.)Ohwi]为豆科 葛属植物,广泛分布于秦岭太白山区,为常用的祛风 解表药.具有降低血管阻力,改善心,脑血液循环, 减慢心率,降低心肌耗氧量等药理作用l.野葛 根主要有效成分为异黄酮类化合物,据报道我国方 起程,陈妙华和国外Jun—eiKinjo等L对其进行过 化学成分研究.关于秦岭太白野葛根化学成分研究 文献仅有3个异黄酮成分的定量分析6,对其化学 成分的提取,分离尚未见报道.为了深人探讨不同 地域野葛根的化学成分,我们对陕西秦岭太白山区 生长的野葛根的化学成分进行了研究,从其甲醇提 取物中分得6个异黄酮成分,其中3个系从该植物 中首次分得,现报道如下 1仪器与材料 x4型显微熔点测定仪(温度计未校正):AC 80型核磁共振仪;PE一2400元素分析仪;60SXR FTIR红外分析仪.太白野葛根,1997年1O月购于 陕西太白县药材公司,经陕西师范大学生物系黄可 国药学杂志1999年5月第34卷第5 教授鉴定为PuerariaI~tta(wIId)Ohwi;大豆苷 元和葛根素对照品(中国药品生物制品检验所)柱 层析硅胶(200--300目)为青岛海洋化工厂产品,其 余试剂均为分析纯. 2提取与分离 将太白野葛根粉碎,取5.Okg,甲醇冷浸提取3 次,提取液减压浓缩,回收甲醇,依次用乙酸乙酯,正 丁醇萃取,得乙酸乙酯提物80g,正丁醇提物262g. 乙酸乙酯提物20g经硅胶柱层析,以苯;乙酸乙酯(8 :1)及氯仿:甲醇(6:1)梯度洗脱,得化合物I(g), ?,?,1V;正丁醇提物15g,经硅胶柱层析,以氯仿: 甲醇(10:1,4:1)梯度洗脱,得化合物?,?,V,?. 所得各化合物在葛根中的含量为I(0.20%).? (O11%),?(0.05%),?(015%),V(0.12%),? (3.5%). 3鉴定 化合物I:无色针晶(丙酮),mp258,260? (未校正).元素分析cl6H12q,实验值(%):C Ch/n?J,1999May.Vo/34No5?301