【doc】人胎盘滋养层细胞的分离和鉴定

【doc】人胎盘滋养层细胞的分离和鉴定 人胎盘滋养层细胞的分离和鉴定 肖敏等人胎盘滋养层细胞的分离和鉴定第18期 人胎盘滋养层细胞的分离和鉴定? ? 2567? ? 实验与基础研究? 肖敏凌斌?姚凤球周颖?陈峥峥程志祥?高宗侠沈国栋? 安徽医科大学附属省立医院妇产科(安徽合肥)230001 中国图书分类号R714文献标识码B文章编号1001-4411(2008)18-2567-03 【摘要】目的:体外分离足月妊娠胎盘滋养层细胞,观察其形态学特点,检测人类白细胞抗原一E(HLA—E)在滋养 层细胞的表达情况.:采用0.25%胰酶和胶原酶I联合消化法及Pereoll密度梯度分离法分离人足月妊娠胎盘组织中滋养层 细胞,光学显微镜观察分离出的细胞形态,透射电镜观察分离出的细胞超微结构;RT—PCR技术检测分离出的滋养层细胞HLA — E的表达.结果:光学显微镜下初分离的细胞呈大圆形,以单个核为主;透射电镜下可见细胞表面的微绒毛丰富,胞质丰富, 内质网扩张明显,有丰富的糖原颗粒,髓样小体和明显的脂滴.在分离的细胞上检测到HLA—E的表达.结论:采用胰酶和胶 原酶I联合消化及Pereoll密度梯度分离法可获得高纯度的滋养细胞,在透射电镜下可见到超微结构,同时检测到滋养层细胞上 表达HLA—E. 【关键词】滋养层细胞纯化分离人类白细胞抗原一E Isolationandidentificationofhumanplacentacytotrophoblast XIAOMin,LINGBin,YAOng— Qiueta1.DeptofObstetricsandGynecology,TheAffiliatedProvincialHospitalofAn- huiMedicalUniversity.Hefei23o001.Anhui,China (Abstract]Objective:Toisolatecytotrophoblastsfromtermhumanplacenta,observetheirmorphologycharacteristic.Todetectthe expressionpatternofhumanleukocyteantigenHLA— EmRNAinnormalhumantllirdtrimesterplacenta.Methods:Cytotrophoblastswere preparedfromtermhumanplacentadigestedwithtrypsin,coUagenase1anddensitygradientseparation,toevaluateamorphousandformation ofcytotrophoblastbylightmicroscopeandtransmissionelectronmicroscope(TEM);Semiquantitativereversetranscription—PCR(RT— PCR)techniqueswereusedtodetecttheHLA— EmRNAincytotrophoblasts.Results:Cytotrophoblastsshownround.singlecore.Microvil lusandcytoplasmwereabundant.endocytoplasmicreticulumdilateobviously,glycogenosome,marrowcorpuscleandlipiddropletwereafllu— ent.HLA— EWasexpressedontheisolatedcytotrophoblast.Conclusion:Highlypurifiedcytotrophoblastsareobtmnedfromtermhumanpla— centadigestedwithtrypsin,collagenaseIanddensitygradientseparationpercoll.andobserveduhrastructur~withTEM.SimilarlyHLA—Eis expressedonthecytotrophoblasts,whichmaybeimportamfactorinthematernal— fetalinterface. [Keywords~Cytotrophoblast;Isolationandpurification;HLA—E;RT—PCR 胎盘是胎儿与母体之间进行物质交换的重要器官,由滋 养层细胞,毛细血管内皮细胞以及二者之间基膜所构成的胎 盘屏障,是各种营养物质和某些药物,病毒,激素等从母体 进入胎儿的必经之路.滋养层细胞来自于胚胎的滋养外胚层, 对胚胎的植入过程起重要的调节作用,其增殖,功能失常与 多种妊娠相关疾病的发生发展有密切关系,因此,值得人们 去研究.它可以为产科很多疾病的体外模型的建立打下基. 人类胎盘滋养层具有独特的白细胞抗原(humanleucocyteanti— gen,HLA)表达模式,即不表达任何HLA—A,B及全部的 HLA一?类分子,而是限制性地表达HLA—E.目前人们认为 HLA—E表达在胎盘上,但由于胎盘组织中有多种组织类型 的细胞,在本篇文章中用分离纯化的滋养层细胞检测HLA—E 的表达. ?基金项目:安徽省卫生厅临床医学应用技术项目(06B040) ?责任作者 ?安徽省立医院分子医学重点实验室 1材料和方法 1.1研究对象随机抽取2006年4,12月安徽省立医院产 科住院因社会因素于临产发动前行剖宫产的正常产妇16例, 产妇年龄为25,32岁,孕周为37,39周,均为单胎妊娠. 1.2主要试剂来源DMEM购白美国GIBCO公司,Percoll 细胞分离液购自美国Phamacia公司,HEPES购白Promega公 司,胶原酶,DNaseI购白Sigma公司,总RNA抽提试 剂购自Invltrogen公司,RT—PCR试剂盒购自Promega公司, DEPC购白Amresco公司,DNA分子量标准购自Fermentas公 司,其余常规试剂均为国产分析纯. 1.2.1培养液和试剂的配制DMEM细胞培养基:DMEM1 袋加入HEPES5.0g,加入NaHCO3.7g,加入L一谷氨酰胺 3.0g溶人1L去离子水中,磁力器搅拌帮助溶解.用1mol/L NaOH溶液调pH值至7.2—7.4后,用0.22皿微孔滤器过滤 除菌分装,4?冷藏备用.DMEM完全培养基:以配制好的 DMEM中加入经56?水浴30min,灭活补体成分的新生牛血 清,按加入血清的体积比配制成含10%血清浓度的完全培养 基;消化酶配制:0.25g胰蛋白酶粉溶入100ml1×PBS中配制 成0.25%胰蛋白酶液,过滤消毒,4?保存.将0.1g胶原酶I 溶入10ml1×PBS中,配制成最终浓度为1250U/ml的母液. 1.3方法 1.3.1单细胞悬液的制备取剖宫产术后的无菌胎盘组织, 在无菌条件下剪取蜕膜层与羊膜层之间的绒毛组织,以无菌 等渗盐水反复洗涤3次,将绒毛组织剪碎至1—3mm,并尽 可能去除肉眼可见的小血管及纤维连接成分.以0.25%胰蛋 白酶液及20U/mlDNaseI,胶原酶I于37?恒温摇床内消化 30min,消化产物经100目不锈钢筛网过滤后,滤液加入预先 ,1000r/min离心10 加有5Tnl小牛血清的50ml离心管内 min,弃上清,含血清DMEM培养液重悬沉淀,未消化组织重 复消化2次,收集3次细胞悬液,稀释至1×10.个/ml. 1.3.2Percoll密度梯度液制备用9.0%NaC1与Percoll以1 :9混合,以达到等渗性渗透压,再以0.9%NaCI稀释为60% 和30%两个浓度,按浓度从大到小将两个不同密度的Percoll 溶液逐层缓慢加入10ml离心管内,每个浓度3ml. 1.3.3细胞的纯化与培养将收集的细胞悬液2ml缓慢加 于Percol1分离液上层,以2500r/min离心20min,用吸管小心 吸取云雾状的中层置于一50ml离心管内,DMEM稀释4倍,1 000r/min离心10min,弃上清,以含20%胎牛血清,100U/ml 庆大霉素,25mmol/LHEPES的高糖型DMEM培养液重悬沉 淀,将细胞悬液浓度调整至(5—6)×10/ml,置于培养瓶或预 先有盖玻片的6孔培养板内,37?,5%CO孵箱内培养. 1.3.4电镜标本制作细胞纯化后,收集细胞悬液及培养 48h的细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后的细胞悬液各2ml, 移入1OTnl离心管内,以4?预冷的PBS洗涤1次,2000r/ min离心20min,弃上清液,以4?预冷的2%戊二醛于4? 冰箱固定过夜,送本院病理科检测. 中国妇幼保健2008年第23卷 1.3.5RT—PCR检测每1×10个/Tnl加入1mlTfizol充分 混匀,按试剂盒说明提取RNA,经逆转录成cDNA,按下述条 件进行PCR反应:94?变性1min,58?退火1min,72? 延伸1min,最后72?延伸8min.HLA—E上游引物: 5CAGCATGAGGGGCTACCCG3:下游引物:5GTGTGAGGAAGG GGGTCATG3,预期扩增片段长度为447bp.每次扩增均以 DEPC处理水代替模板为阴性对照,阳性对照则将目的基因与 内参照基因共扩增.取10扩增产物,1.5%琼脂糖凝胶电 泳鉴定,自动凝胶成像系统进行凝胶成像. 2结果 2.1光学显微镜下观察体外分离的滋养层细胞见图1. 图1光镜下初分离滋养细胞形态观察(×100) 收集分离后的中层细胞在光学显微镜下观察以单个核细 胞为主,细胞体积大,胞浆丰富,核大卵圆形,多核的合体 滋养细胞极少,贴壁细胞多呈上皮细胞样生长,形如铺路石. 2.2透射电镜动态观察体外培养的滋养细胞见图2. a单个核滋养层细胞;b过渡型的滋养层细胞;c合体滋养层细胞 图2透射电镜下滋养细胞的观察结果(×5000) 透射电镜观察分离纯化后的细胞显示,视野中以单个核 的细胞滋养细胞为主(图2一a),可见过渡型滋养层细胞 (图2一b),偶见合体滋养层细胞(图2一c).细胞滋养细胞 呈不片状,核大,表面有丰富的绒毛,细胞质内有丰富 的线粒体,发达的高尔基体以及脂滴等上皮细胞样结构. 2.3滋养层细胞HLA—E的表达所扩产物为HLA—E,长 度为447bp,见图3. 2 ()(J{) 500 jf)0 1,5均为从胎盘分离出的滋养层细胞 图3滋养层细胞mA—E的表达 l{I_^?E 7bDj 18 3讨论 ,巨 胎盘是母体与胎儿之间重要交换场所,由滋养细胞 噬细胞,成纤维细胞,基质细胞,间充质干细胞等多种细胞 组成,主要由滋养层细胞构成.滋养细胞为一层扁平细胞构 成囊胚壁,至胎盘形成时可分为两种类型:合体滋养细胞和 细胞滋养细胞.合体滋养细胞是由细胞滋养细胞分化而来, 是行使功能的细胞;细胞滋养细胞,参与胚胎发育过程中营 养,代谢,内分泌和免疫等功能. 目前滋养层细胞的分离方法总括起来有酶消化法和组织 块法原代培养两种,但都存在一定的缺陷.以Kliman等…的 Pereoll连续密度梯度分离纯化方法应用最多,细胞纯度可达 85%以上,但是操作步骤繁琐,费时间,费用较高.程勇前,郑 伟等l3将Kliman的方法加以简化,将分离梯度简化为两层: 分别用22.5%和45%,35%和45%两种不同浓度的Percoll细 胞分离液分离纯化细胞.依据文献报道,我们应用35%和 45%两个浓度PercoU进行滋养层细胞的分离,结果两界面之间 不易出现一层云雾状细胞带,而在离心管底部出现较多的细 胞,显微镜下观察除大量红细胞,成纤维细胞外,还有大多数符 合滋养细胞形态.分析结果,我们发现,根据Percoll的密度, 35%浓度时溶液的密度为1.045g/ml,45%浓度时溶液的密度 为1.055g/ml,而Kliman得出滋养层细胞的密度约为1.048, 1.062g/ml,45%浓度Percoll溶液密度稍低,不能使滋养层细 胞出现在此密度梯度上.根据上述结果我们调整了Percoll的 浓度,选择密度为1.04Og/ml的30%浓度和密度为1.080g/ml 的60%浓度的PercoU细胞分离液分离和纯化滋养层细胞,结 果在两个浓度梯度之间形成了白色云雾状的细胞带. 光学显微镜下见除红细胞外,单个核细胞为主,体积较 大,胞浆丰富,细胞核较大,符合上皮细胞的形态.电镜观 察发现,细胞多以单个核的形态为主,可见过渡型的滋养层 细胞,偶见合体滋养层细胞.细胞滋养层细胞核较大,染色 质均匀而分散,胞质基质着色深,游离核糖体较多,粗面内 质网较少,高尔基体较发达,线粒体较大,细胞表面微绒毛, 被膜小凹,细胞内膜小泡,脂滴,粗面内质网及微丝逐渐增 多,这些结构有效地增加了母胎间的接触面积,并有利于其 完成合成蛋白,激素及物质转运功能.本实验运用此法获得 较高纯度的滋养层细胞,高纯度滋养层细胞的获得,可以为 很多滋养细胞疾病的研究以及疾病模型的建立奠定基础. 人MHC—I类基因分两类:经典的Ia基因(包括HLA— A,HLA—B,HLA—C)和非经典的1b基因(主要包括HLA — E与HLA—G,HLA—F)J.人类白细胞抗原HLA—E是一 类保守的非经典的主要组织相容性复合物,广泛表达于人类 各组织和细胞表面】.人类滋养层细胞不表达经典的一类抗 原,如HLA—A,HLA—B;非经典的HLA—E抗原表达在胎 盘上. HLA—E抗原是NK细胞受体的配体,高亲和力的相互作 用可以抑制NK细胞毒活性】.HLA—E可以和蜕膜自然杀伤 细胞的抑制性受体结合,可抵制自然杀伤细胞对胎儿胎盘单 位攻击的可能性】.在母胎界面上,存在着这样一种平衡: 既允许胎儿滋养层细胞伸人母体组织建立起营养运输通道, 又必须通过某种机制将外绒毛滋养层细胞局限在子宫内膜的 某一部位.滋养层细胞表达HLA—E分子,而蜕膜中的NK细 胞大多数表达抑制性受体(CD94/NKG2A)受体,这二者相 互作用对允许胎儿滋养层与母体组织融合有着重要的作用. 滋养层细胞表面表达大量的HLA—E,可有效抑制蜕膜自然杀 伤细胞的细胞毒活性维持母体对胎儿的免疫耐受.彭冰 用原位杂交免疫组化法检测到HLA—E表达在晚孕胎盘绒毛 外滋养层细胞中.本实验经RT—PCR证实在母胎界面细胞滋 养层细胞上大量表达HLA—E,因此,HLA—E分子被认为在 妊娠过程中保护胎儿免受母体免疫反应攻击的重要调节分 子. 在生殖免疫学领域,母胎免疫耐受是近年来研究的热点 之一,分离纯化出高纯度的滋养层细胞意义显得更为重大, 获得高纯度的胎盘滋养层细胞可为很多疾病研究及侵袭实验 及共培养模的建立奠定基础.胎盘滋养细胞表面的HLA—E 抗原分子在母胎界面免疫调控机制中起着极为重要的作用, HLA—E分子在母胎界面免疫耐受中的作用值得进一步研究. 4参考文献 1KlimanILl,NestlerJE,SermasiE,et.Purification,chz~ctefizs- tion,andinvitrodifferentiationofcytotrophoblastsfromhumantermpla- centa~Endocfinol,1986,118(4):1567—1582 2程勇前,聂青和,周永兴,eta/.人胎盘滋养层细胞的分离培养及 IgG,Fc,Rill在滋养层细胞的表达.医学研究生,2002, 15(2):105一ll1 3郑伟,石一复.人胎盘滋养层细胞的培养与体外HCG释放的研 究.细胞生物学杂志,1996,18(4):176—179 4BraudVM,AllanDS,McMichaelAJ.FunctionsofnonclassicalMHC andnon—MHC—encodedclassImolecule~CurtOpinImmunol,1999, ll(1):100—108 5TripathilP,NaiklS,AgrawalS.HIA—Eandimmunobiologyofpreg- nancy.TissueAntigens,2006,67(3):207-213 6Vales—GomezM,ReyburnH,StromingerJ.Molecularanalysesofthe interactionsbetweenhumanNK~ptorsandtheirHIAligands.Hum Immunol,2000,61(1):28—38 7LeeN,LIaBOM,CarreteroM,daLm—Eisamajorligandforthe naturalkillerinhibitoryreceptorCD94/NKG2A.Pr0cNailAcadSci USA,1998,95(9):5199—52o4 8彭冰,刘淑芸,邢爱耘aL人类自细胞抗原G,E在人胎盘组 织中的表达及其意义.现代妇产科进展,2006,15(7):525-530 (2008-04-24修回) [编校崔建华]