猪血凝性脑脊髓炎病毒PK细胞膜受体的鉴定.doc

猪血凝性脑脊髓炎病毒PK细胞膜受体的鉴定.doc 猪血凝性脑脊髓炎病毒PK细胞膜受体的鉴定 农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(1): 20~23?? ? 研究猪血凝性脑脊髓炎病毒 PK 细胞膜受体的鉴定 *?陆慧君,?贺文琦,?宋德光,?刘立国, 常灵竹,?李志萍,?陈克研,?高 />(吉林大学畜牧兽医学院， 长春 130062) ( 摘要: 在毕赤酵母 ( ) 中达猪血凝性脑脊髓炎病毒HEV) 67N 株 S丰?**获得兔抗 HEV?S 蛋白特异性抗体; 提取 PK 细胞膜蛋白， SDS?PAGE 电泳后， 蛋白片段， 纯化后免疫家兔， 转印 NC 膜， 以纯化 利用改进的病毒铺覆蛋白结合试验 VOPBA) PK 细胞膜受体进行鉴定， ( 对 结果扩增获得 1 797 bp 的 的 S1 蛋白代替病毒， 用 目的基因片段， 特异性引物和 重组酵母菌经 通用引物 PCR 鉴定结果表明， 实验成功地构建了重组酵母表达质粒， 在培养基上清中检测到 73 kD 目的蛋白。 该重组蛋白可与 HEV 多克隆抗体发生特异性血 1%甲醇诱导， embrane?LU Hui?jun, HE em?PER Eukaryotic Membrane?Protein Extraction Kit 进行提取。取样与等量 100? 的 2伊SDS 上样缓冲液混合， ? 煮沸 5 min， 进行 ? SDS?PAGE 分析。1.5 SDS?PAGE 电泳及蛋白转印Zeocin 药品购自美国 Invitrogen 公司; 4? DNA 连接 T酶、X玉、 DNA 片段凝胶回 酸 DNA Marker DL?15000+2000、 pGEM?T 载 收试剂盒等均购自大连 TaKaRa 公司; 体为美国 Promega 公司产品; 辣根过氧化物酶标记DNA 聚 合 酶 (5 U/滋L) ? 、玉、 分子量核 玉等各种限制性内切酶、R玉、5% 配置 12%的分离胶， 的浓缩胶，每个泳道加 样品 18 滋L。电泳结束后，采用半干转印法按 0.6? ?2 mA/cm? 的电流室温下转印 12 h， 将蛋白转移到 NC膜上。 1.6 VOPBA 鉴定 按传统的 VOPBA 略有改进。转印完毕， 1% 用的羊抗兔 IgG 购自美国 Sigma 公司;培养基 YPD、 BMGY 和 BMMY 均为加拿大 BBI 公司试剂;引物 合成和测序由上海生工生物工程公司完成。 1.2 HEV ?S1 蛋白的真核表达 设 根据 GenBank 中 HEV S 蛋白全基因序列， 计合成了 1 对特异性引物，用于 S1 区的 1?797 bp 基因片段的扩增， 引物序列:?P1: 5'?CGGAATTCGTGCCATCTATTAGCTCTGAAGT?3'?? P2: 5'?TTGCGGCCGCAAGTATGCCCTGGCCTGTAATG?3'。 ( 的牛血清白蛋白 BSA) 封闭 NC 膜 2 h， 加入纯化的 S1 重 组蛋白， ? 过夜，用 TBST 洗 3 遍，每次 5? 4?min， 000 稀释 的 HEV 洗去未结合的蛋白。再与 1颐1 ? ST) 3 遍， 洗 每次 5 min， NC 膜浸入辣根过氧化 将 物酶 HRT) ( 标记山羊抗兔抗 体溶液中 2 h， 如上漂洗( 3 遍， 每次 10 min。 焦碳酸二乙酯 DAB) 显色直至蛋 白条带清晰，用磷酸缓冲液 (PBS) 终止反 应。用兔抗血清作用 2 h， TL) ? 切和 PCR 方法鉴定获得阳性 重组质粒 pPICZ琢A 。 ? 将线性 pPICZ琢A 电转至酵母感受态 细胞 GS115 ? P2 内。 用 基因特异性引物 P1、 以及 通用引+ 选 择表型为 Mut? 的阳性菌落进行 物进行 PCR 鉴定， 诱导表达， 每隔 24 h 补加甲醇至其终浓度为 1%。通基因片段 PCR 产物与预 期值 1 797 bp 大小相符 (图 1) 。将构建的 重组质粒 pPICZ琢 A ? 母感受态细胞。用 线性化后电转化至 GS115 酵 + 基因特异 性引物对 Mut? 表型得到 1 797 bp 大小的条 重组酵母菌进行 PCR 扩增， AOX1 通用引物进行 PCR 扩增， PCR 产物有 带; 其过 SDS?PAGE 和 , DNA marker DL?2000? 1,?图 4. VOPBA 鉴定 HEV 在 PK 细胞上的受体蛋白Fig.4. Receptor protein of HEV in PK cells identified by? VOPBA?M, protein molecular arker? 1and 2, membrane protein of PK?图 2. 重组酵母菌的鉴定结果Fig. 2. Results of recombinant yeast?M, DNA marker DL?15000+2000? 1,4,7 and 10, PCR product ers by?cells? 3 and 4, receptor protein.?2.4? enzyme cutting? 2,5,8 and 11, recombinant?primers? 3,6,9 and 12,? primers.HEV 在 PK 细胞膜上的受体鉴定 用纯化的 S1 重组蛋白代替病毒进行 VOPBAyeast by PCR amplification binant yeast by PCR amplification binant yeast transformed by pPICZ琢A? ?M, protein molecular arker? 1, uninduced recombinant yeast?? 2, 8, induced recombinant yeast? 9, 11, atsnyama and Taguchi,?定， 表达量高。在本实验设计时， 外源 基因附加载体 使表达的蛋白分泌到细胞外， 更有利 本身的信号 肽， 于目的蛋白的纯化。 目 VOPBA 是较早用于病毒受体鉴定的 方法， 前该方法已成功用于多种病毒受体的鉴定 (郭爱珍 和陆承 平, 2000) 但是， 。 使用完整的病毒与细胞膜蛋 白结合， 由于 病毒蛋白成分较多， 容易出现非特异性 本实验根据 VOPBA 的原 理， 用重组 S1 结果。因此， 用 蛋白代替全病毒， HEV?S1 蛋 白的多抗作为一抗， 降低了实验中假阳性结果的出现，并成功地获 得 1 条与 HEV?S1 蛋白特异结合的分子量为 90 kD 的可 并且 能 受体蛋白条带。而 HEV 可以感染 PK 细胞， ( 能够产生典型的 细胞病变效应 CPE) 那么在该细 ， 胞膜表面应该存在 HEV 的 受体，该受体的鉴定为 进一步研究猪体原代细胞受体提供了基本资 料。in the Tohoku district of Japan (J).? 1999, 122: 545~551? Jin Q (金 奇). Medical Molecular Virology (M). Beijing: Science? Press, 2001, 29~30? Krueger D K, Kelly S M, Leurine coron?? avirus spike protein impact the initiation of membrane fusion? (J).? 2001, 75(6): 2792~2802?2002? Krueger?, 2001? Callagher and Buchmeier,?2001? Taguchi and Shimazaki, 2000) 因此， 。 本实验在经 毕赤酵母中 表达了 HEV S1 蛋白， and Buchmeier M J. Coronavirus spike proteins? in viral entry and pathogenesis (J).? 371~374? David E olecular determi?? nants of species specificity in the coronavirus receptor? aminopeptidase N (CD13): Influence of N?linked glycosyla?? tion(J).? , 2001, 75: 9741~9752? Gao F( 高丰 ), Deng Z ( 丁壮 ), Zhang M L ( 张茂林 ), Pan Y Q? ( 潘耀谦 ), Hou S K( 侯世宽),Cheng J(成军 ), atsnyama S and Taguchi F. Communication beturine coronavirus spike protein is im?? portant for virus entry into cells expressing CEACAM1b re?? ceptor(J).? 2002, 295(1):160~171?发), Chen D F(陈东富) and Zhang B S(张百顺). Outbreak of?piglet coronavirus encephalomyelitis in three farms (J).? (中国预防兽Mcferren J B , Clarke J K, Cornner T J and Knox E R. Serologi?? cal evidence of the presence of? in Northern Ireland (J).? , 1971, 88: 339~340? Roe C K and Alexander T J L. A disease of nursing pigs previ?? ously unreported in Ontario (J).? 1958, 22: 305~307? Taguchi F and Shimazaki Y K. Functional analysis of an epitope? in the S2 subunit of the murine coronavirus spike protein: In? vovlement in fusion activity (J).? 2000, 81(Pt 12): 2867~2871? Xu Y X ( 徐耀先),Zhou X F ( 周晓峰) and Liu L D (刘立德 ).? Molecular Virology(M).).Beijing:? Science Press,1997:690~692医学报), 2000, 22 (2) : 151~152 (in Chinese an coronavirus and swine?