猪二胺氧化酶(DAO)ELISA试剂盒使用说明书.doc猪二胺氧化酶(DAO)ELISA试剂盒使用说明书.doc
本试剂盒仅供研究使用
产品编号:E0656p
ELISA法定量测定猪血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中二胺氧化酶(DAO)含量。
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中DAO水平。用纯化的抗体包被微孔
板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入DAO抗原、生物素化的抗猪DAO抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,
并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的DAO呈正相关。用酶标仪...
猪二胺氧化酶(DAO)ELISA试剂盒使用说明书.doc
本试剂盒仅供研究使用
产品编号:E0656p
ELISA法定量测定猪血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中二胺氧化酶(DAO)含量。
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中DAO水平。用纯化的抗体包被微孔
板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入DAO抗原、生物素化的抗猪DAO抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,
并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的DAO呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
1. 酶联板:一块(96孔)
2. (冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,
然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为10 U/mL,做系列倍比稀释后,分别稀释成10 U/mL,
5 U/mL ,2.5 U/mL,1.25 U/mL,0.625 U/mL,0.312 U/mL,0.156 U/mL,其原液直接作为
最高标准浓度,样品稀释液直接作为标准浓度0 U/mL,临用前15分钟内配制。
如配制5 U/mL标准品:取0.5ml 10 U/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的
Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
3. :1×20ml/瓶。
4. A:1×10ml/瓶。
5. B:1×10ml/瓶。
6. A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以A 1:100稀释,稀释前根据预先
计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul
检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。 7. B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以B1:100稀释。稀释
同检测
溶液A。
8. 溶液:1×10ml/瓶。
9. 浓:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. :1×10ml/瓶(2N H
SO4)。 2
1.细胞培养物上清:请离心后收集上清,并将标本保存于-20?,且应避免反复冻融。
2.血清:标本请于室温放置2小时或4?过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20?保存,但应避免反复冻融。
3.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8? C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20?保存,但应避免反复冻融。
实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。
每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂
盒的检测范围。
1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul,余孔分别加
或待测样品100ul,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,
轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37?反应120分钟。
为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加A 100ul(取1ul检测溶液A加99ul
检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37?,60分钟。 3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干。 4. 每孔加BA 100ul,37?,60分钟。 5. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干。 6. 依序每孔加90ul,37?30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有
明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
7. 依序每孔加50ul,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底
物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。 8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行
检测。
:
1. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2NH2SO4。
测量时先用此孔调OD值至零。
2.为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。 3. 未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8?保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B
工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或
检测溶液B工作液。
4. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水 纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需 要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
本试剂盒可同时检测重组或天然的猪二胺氧化酶,且与其它相关蛋白无交叉反应。
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上
绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物
的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品
浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
1. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
2. 一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 3. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。
4. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。 5.在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。 6.底物请避光保存。
0.156 U/mL -10 U/mL
1.试剂盒保存:-20?(较长时间不用时);2-8?(频繁使用时)。 2.有效期:6个月
3.浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影
响。
5.中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。
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