【doc】检测987p^＋肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立

【doc】987p^＋肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立 检测987p^，肠毒素性大肠埃希氏菌PCR 方法的建立 中国兽医科技第32卷第1期2002年3 检测987P+肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立 华荣虹.张书霞,何孔旺,倪艳秀.插宗照. (1.南京农业大学动物医学院,江苏南京210095;2江苏省农业科学院农业部畜禽疫病诊断 重点开放实验室,江苏南京210014;3.杭州市畜牧兽医总站.浙江杭州310020) 摘要:以987P茸毛蛄构基固保守序列为靶序列.最计台成了1对可扩增459bp目的片段的引物,建立了幢剥肠毒素 性大肠埃希氏茵987P茵毛基因的PCR方法.谊方法对K88一(+为首毛阳性),K99一,F4l一参考菌株和链球茵,葡萄球 菌,巴氏杆茴的拴剥结果均曲阴性;谊方l岳的敏感度可这10CFU.对20株腹泻仔猪粪幔分离物进行检测,有1株为阳性一 与血清学拴剽的结果一致.蛄果表明.此方法特异性和敏感性都租高.可用于临床987P晒毒索性大肠壤希氏苗病的快速 诊断和流行病学调查. 关键词:肺毒素性大脑壤希屯茴;茵毛基PCR 中图分类号:s852.512文献标识码:B文章编号:1000—6419(2002)01—0003—03 肠毒素性大肠埃希氏菌是动物腹泻病的主要病原之一,该 菌的致病性与其具有粘附性菌毛和产肠毒素密切相关:287P 牯附性菌毛是致仔猪腹泻肠毒素性太肠埃希氏菌的粘附性菌毛 之一检测粘附性苗毛对大肠埃希氏苗性腹泻病的诊断有重要 意义.目前检测肠毒素性大肠埃希氏菌苗毛的方法有电子显微 镜检查法,D一甘露糖抵抗血凝试验,细胞枯附试验,基因探针技 术和免疫血清学反应以及硫酸铵盐析法',但这些方法都比 较费力,费时,特异性也不高而且需要进行菌毛化培养.而 987p菌株在体外培养条件下极易非苗毛化,这就限制了一般检 测方法的应用.本试验以987P菌毛特异的引物通过PCR扩 增987P基因,旨在建立从基固水平检测肠毒索性大肠埃希氏 菌987P菌毛的新方法. 1材料与方法 11菌株 大肠埃希氏菌标准菌株C82903(O141:K85,K88ab), C83914(t)l01{K30.K99),C83921(()101:K27.F41:H一), C83:317(09:K103,987p:NM)购自中国兽药监察所.太肠埃 希氏苗分离株分离自江苏省一些猪场1,7日龄腹泻仔猪鼠 伤寒沙门氏菌,链球菌,巴氏杆菌,金黄色葡萄球菌均为江苏省 农业科学院畜牧兽医研究所农业部畜禽疫病诊断重点开放宴验 室分离保存的菌株 1.2主要试剂 TaqDNA聚合酶,dNTP,MgCI2为上海Promega公司产 品.DL2000Marker,EcoRT限制性内切酶为大连宝生物工 程有限公司产品.987P单因子血清购于中国兽药监察所. l_3细菌培养及DNA模板的制备 将各菌株分别接种于5mILB肉洒中.37?振荡(140 r:'rain)培养18h{取1mL培养物经[00000r/min4?离心 5rain{沉淀用500,uLTE缓冲液重悬.于100C水浴i0rain后 立即置冰浴中冷却.100000r./min4?离心5min.取上清液 收穑日期:200】一】0—08 作者简介:华荣虹<1976—1,爿.期北省蕲春县^在读硕L 于一2O?保存.作为DNA摸板. 14引物设计与合成 根据已发表的大肠埃希氏菌菌毛基因序列一选取结构 基固内保守区段为目的片段.用DNAStar软件设计了1对扩 增片段长度为459bp的引物: P1引物:5一cTGccAGTcTATGccAAGTG一32Obp(位 于结构基因开放阅读框124~143bp) P2引物:5一AcGGTGTAccTGcTGAAcGAATAG一3 24bp(位于结构基因开放阅读框559~582bp) 1.5PCR扩增 PCR反应在0.5mLEppendorf菅中进行一采用50L反应 体系.各反应成分为:1O×PCR缓冲液5.0ptL.25mtno1.,"L MgCl22.0I…25n]n]oI/'LdNTP4.0L,50mo】L987PPl 0.5L,j0,umo1.."L987PP20.5,uL+ddH2O325,aL,DNA模板 5.0FL,TaqDNA聚合酶(ju/L)0.5L.按以下温度条件进 行热盖循环反应:94?4train+之后"g4?30s,56?30S, 72?1min进行3O次循环,再72?5rain一4?保存. 1.6PCR特异?眭试验 分别对标准菌株C83917,C83903,C93914,C83921和鼠伤 寒沙门氏苗,金黄色葡萄球菌,链球菌,巴氏杆菌按上述条件进 行PCR扩增,鉴定其特异性. 1.7PCR敏盛性试验 将参考菌株C8391737?振荡(140r/mi[])培养18h的菌 液倍比稀释,分别对含10,10.CFU,,"mL不同稀释度的菌液按 上述条件进行PCR扩增,测定PCR反应的敏感性. 1.8PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定 采用常规琼脂糖凝胶电泳法进行电泳.琼脂糖凝胶浓度为 20g/L.含溴化乙锭0.25ptg,,"mI.缓冲液为05×TBE以i00 v衡压电泳30rain后.置紫外灯下观察分析. 1.9PCR产物的酶切鉴定 根据预期的PCR扩增产物序列.利用DNAStar软件进行 酶切位点分析;选取单一酶切位点的EcoR【进行酶切.酶 切反应成分:l0倍缓冲液2LEcoRI1,uL.PCR产物10,uL ChineseJournalofVeterinaryScienceandTechnologyVo1.32Nol2002 ddHO7L,总体积20Il反应于37'水浴中进行.2h后用 l0倍加样缓冲液终止反应,进行琼脂糖凝胶电流检查 ll0对太肠埃希氏菌分离株的检测 对lO株大肠埃希氏菌分离株按上述方法进行PCR{殳洲; 将各分离株接种于Slanetz培养基.37培养l8h后用987P 单园子血清进行玻板凝集反应. 2结果 2.1对各参考菌株的检测 对C83917参考菌株扩增出与预期大小…致的条带.对 C83914,C8392I,C83903参考菌株和鼠伤寒沙门氏菌,链球菌, 巴氏杆菌,金黄色葡萄球菌等阴性对照菌株均未扩增出任何条 带(图1). 囤2PCR产物的酶切结果 1.DL2000Marker;2.K88tCR产物}3.K88产糟酶切 2.3敏感性试验 对不同稀释度的C839I7菌株培养物进行PCR检测,结果 表明,该法能检测到10.CUF987P(+为菌毛阳性)菌(图3). 2.4对分离株的检剥 IO十分离株经PCR检测有l株为阳性.即从I株分离菌 扩增出大小为459bp的条带,与987P单园子血清玻板凝集反 应结果一致 2000 1000 7S0 500 250 100 图3PCR敏感性试验 1.DL2000Marker;2l9CFU:3.10CFU:419CFU 5.10CFU:6.10CFU;7.10CFU:8.171性对照 3讨论 肠毒素性大肠埃希氏菌是仔猪大肠埃希氏菌性腹泻病的病 原,常致l,7日龄和20日龄前后的仔猪隍泻,发病率高,传染 性强.粘附性菌毛和肠毒素是其主要的毒力因子.猪源肠毒索 性大肠埃希氏菌常具有K88,K99,F41,987P粘附性菌毛中的 一 种或几种.常规检测肠毒素性大肠埃希氏菌菌毛的方法有电 子显微镜观察法,D一甘露糖抵抗血凝试验,细胞枯附试验和免 疫血清学技术.这些方法操作繁琐,特异雎不高.太部分不能对 菌毛进行分型检测,需用专门培养基进行纯化培养,而987P菌 株在体外培养时极易非菌毛化.这些因素影响常规检测方法的 检测效率 本试验建立的PCR方法可从基因水平检测987P茁毛,操 作简单,快速,不需要复杂的DNA提取步骤.具有很好的特异 性和较好的敏感陛该方法可用于仔猪太肠埃希氏菌性腹泻病 的快速诊断和流行病学调查 参考文献: [I:方海.大肠埃希氏菌:M]石家庄:河北科学技术出版 社.I9974II一430 豫香.肠毒紊性大肠杆菌菌毛的快速检测方法_J:.中国 人兽其患病杂志.1987.3(3):4042. 姜泊,张亚历,周殿元分子生物学常用方法[M].北京: 人民军医出版社,I995l07. SchifferliDM,AlrutzMA.Permissivelinkerinserfion itintheoulerFlleFI1braneproteinof987Pfimbriae0f Escherzchiacoli[J].JBacter[o1.I994t176(4): 1099iIIO. KhanAS,SchilferliDM.Aminor987Pproteindiffer一 ?tfrothes%ruet?lfimhrialsubunitistheadhosinEJ] lntcctImrnun,l994,62(19):42334243 CaoJ,KhanAS.BayerME.a1.Orderedtransloea m 中匡兽医科技第32卷第l期2002年 细粒棘球绦虫eDNA克隆EgA31在大肠埃希氏菌M15中的 表达及重组蛋白的纯化和复性 傅玉才,王进成,张壮志.,季雄. (1.汕头大学医学院,广东汕头515031;2 3.新疆地方病防治研究所,新疆乌鲁术齐 .AFwle—FrancoisePetavy,GeorgesBosquet 新疆畜牧科学院兽医研究所.新疆乌鲁术齐830000~ 830002}4法国里昂第一大学,法国里昂695373) 摘要:为了获得细粒棘球绦虫66ku抗原的重蛆蛋白和抗血清.月该抗原的eDNA克隆EgA31构建了pQE30一 EgA31重组质粒,在太肠埃希氏茵M15中表达,经亲和层折获得纯度较高的EgA31重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白 免疲动物.获得EgA3l重组蛋白抗血清.奉正就重组蛋白的稳定性和在复性处理中遇到的问题进行了讨{旨 美键词:细粒棘球绦虫;抗原;重组蛋白 中国分类号:R383.33;Q753文献标识码:A文章编号:1000—6419(2002)0l一0005—03 细粒棘球蚴病叉称囊性包虫病,是危害严重的^兽共患病 之一.在我国主要分布在西部和北部省区nJ从20世纪80 年代开始.我国在细粒棘球蚴病主要流行区采取以对犬驱虫为 主的综合控制措施,取得了一定的进展.但由于经济,^文和自 然条件等原因,这些措施推广效果不够理想.近年来的胡 查贤料显示.人和家畜细粒棘球蚴病的感染率仍较高,并呈现自 收}鬲日期:2C01一.8—06 基金项目:寡自然科学基盘资勘瑚I=1r3960c7.1) 作者筒彳r:傅玉才(1957一),男,山东省县^,副教授,博f 西部和北部向东部和南部扩散的趋势=为彻底控制细粒棘球 坳病的流行,有必要开展该病的免疫预防研究.为了获得细牡 棘球缘虫优势抗原,作者用免疫学方法对一细粒棘球绦虫成虫 cDNA表达文厍进行筛选.获得l3株阳性克隆,其中克隆 EgA31的免疫反应最强,进而对该克隆在大肠埃希氏菌M15 中的表达和重组蛋白的纯化及复性进行了探讨 1材料与方法 I.1EgA31eDNA克隆的表达 EgA3leDNA阅读框包含l803对碱基.本试验是将其 tionof987PfimbrialsubunitsthroughtheOHtCrYllet~ braheofEscherichiacoillJ].JBacterio1.1995,177(13) 3704—37l3 [7]DeGradFK.KIaasenPNueIeoddesequenceofthegene encodingthe987Pfimbria[subunkofEsckerichia cofiJ].FEMSMicrobiolLett,1987,42f253—258. Detectionof987ppositiveEnterotoxigenicEscherichiacoliby PolymeraseChainReaction HUARong—hong.Z|tANGShu—xia.HEKong—wang NIYan—xiu:.YANGZongrzhao (1.VeterinaryMedwineCollege.b~njingAgricultura(University,Nanjing210095,Ch";2K eyLab(Animal DiseasesLb'agnostic.Ministr2,o.fAgriculture,Jiang~u.Academyof_,144ricultura(Sciem -es.Naing210014,China: 3.GeneralStationofAnimalHusbandryandYZeterinary,MedicineHangzhou.Hangzhou3 10020,China) Abstract:987pfimbriaeisoneoftheadhesivefimbriaeantigensofetlterotoxigenicEscherich iacoli.Apolymerasechain reaction(PCR)methodwasdeveloped"tOdetect987PpositiveEscher~chiacolibyrt~eartsofarnp[ifing987pfimbriaegene.Theprimer usedinthisassaywasdesigaedfromtheconservedsectionof987pstructuralgencsequences.ThedetectionspecificityofthisPCR nmthodwasconfirmedwithPCRassayofcnter0toxigen1cEscherichiacdire{erenceslrains.Salmonellat3,phimurium,Streptococcus? Sta"D~'OCcHsaswe[1asFaste"rn声 ""m~tropica20t~cherichiacolistrainsisolatedfromltO7daysolddiarrheapiglets weredetectedwiththisPCRmethod.andoneoftheseispositi~,efortheenter.tox_gcnlcpropertyAndtheSatTICresultwasachieved withslideagglutination.TheresultsdemonstratedthatthisPCRwasspecificandsensitive.Itwillbeusefulforidentificationof987P positiveEscherichiacoHstrains. Keywords:enterotoxigenlcEscher2chiacoli;{imbriaegcnc;PCR