宫颈染色体3p14杂合性缺失和微卫星不稳定性研究

宫颈染色体3p14杂合性缺失和微卫星不稳定性研究 宫颈染色体3p14杂合性缺失和微卫星不稳 定性研究 中国现代医药杂志2005年8月第7卷第4期MMJC,Aug2005,Vol7,No.4 宙 口 和 颈染色体3p14杂合性缺失 微卫星不稳定性研究 刘炯孙小妹龚志强许小明王川来李燕坤 【摘要l目的探讨宫颈癌染色体3p14区域D3S1300,D3S1600位点微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MS1) 及等位基因杂合性缺失(1ossofheterozygosity,LOH)频率,为准确定位宫颈癌相关肿瘤抑制基因位点提供实验依据,并探 讨LOH及MSI与宫颈癌临床分期,病理分级的相关性.方法选择3p14区域两个微卫星多态性位点,显微分离提取4l 例宫颈癌石蜡切片中的正常组织和肿瘤组织,经PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色,进行LOH及MSI研究. 结果4l例样本中有25例至少存在一个位点的LOH,D3S1300位点LOH的频率为35%,D3S1600位点LOH的频率为 28%.MSI发生频率相对较低,D3S1300的MSI频率为7.5%,D3S160O的MSI频率为12.8%.D3S1300,D3S160O位点LOH 的发生率与临床分期,病理分级相关性有显着意义(P<O.05),而MSI与之无显着的差别(P>O.05).结论3p14区域内 D3S1300,D3S160O位点具有较高的LOH,提示这两个微卫星位点附近可能存在尚未克隆的与宫颈癌发生,发展相关的肿 瘤抑制基因.宫颈癌染色体3p14区域LOH与临床分期,病理分级成正相关,提示检测该区域的LOH可作为病程进展及 预后的重要参考指标.MSI在本研究中与宫颈癌临床分期,病理分级无明显相关. 【关键词】宫颈癌杂合性缺失微卫星不稳定性染色体3p14肿瘤抑制基因 Studyoflossofheterozygosityandmicrosatelliteinstabilityonchromosome3p14incervicalcarcinomaLiuJiong,Sun Xiaomei,GongZhiqiang,et.DepartmentofPatholog3",TheGenero1Hospito1ofChinaAerospace,Beijing100076 【Abstract】 ObjectiveTodeterminethe~equencyofLOHandMSIon3p14incervicalcarcinoma(cc),facilitatethe isolationofthecandidatetumorsuppressorgenesassociatedwithCCanddiscussthepossiblerelationsbetweenLOHandMSI, clinicalstageandclinic-pathology.MethodsAnalyzedLOHandMSIin41casesofCCusingthepolymerasechainreaction foramplificationwith2polymo~hicmicrosatelliterepeatsonchmmosome3p14.ReslIIts25ofCCcasesshowedatleastone lociofLOH.ThelociofD3S1600was28%,thehigherfrequencyofD3S1300was35%.TheoccourenceofLOHshowedsignif- icantcorrelationindifferentclinicalstageandclinic-pathology.ThefrequencyofMS1were7.5%and12.8%respectively.But nosign~eantdifferenceinstatisticalanalysis.ConclusionLOHonchmmosome3p14alecommoninhighgradeofCC.These implythatLOHon3p14aretheimportantdeterminantsofclinicalstageandclinicopathologicalcharacteris'ticsofpatientswith CC.Tumorsuppressorgenethatplayaroleincervicalcarcinomamaybelocatedonthe3p14,1ikelyatornearD3S1300, D3S16OOloci. 【Keywords】 CervicalcarcinomaLossofheterozygosityMicrosatelliteinstabilityChromosome3p14Tumorsup. pressorgeBe 宫颈癌是妇女生殖系统最常见的恶性肿瘤之 一 ,占世界妇女全部恶性肿瘤的第2位.频发的遗 传学改变是宫颈癌发生的重要因素,这种遗传学改 变有多种形式,杂合性缺失尤为常见.宫颈癌等位 基因杂合性缺失涉及多条染色体,表明在多条染色 作者单位:100076北京航天总医院病理科(刘炯,孙小妹, 王川来,李艳坤);江西医学院病理教研室(龚志强,许小明) 第一作者简介刘炯,男,33岁,毕业于江西医学院,医学硕 士.北京航天总医院病理科从事病理诊断,教学及科研工作. 发表论文多篇. 体上可能存在多个抑癌基因对肿瘤的发生,发展起 作用.利用微卫星作为标记物,分析特定染色体上 的LOH,不仅可以准确定位宫颈癌相关的抑癌基 因,还可以作为病变进展及预后的指标.现有研究 颈癌染色体lp及3p,4p16,4q21—25, 表明:在宫 6p21.3-6p25,1lq22—24等多个区域有频发的LOH. 特别是3p14.2—13是目前研究的热点.MSI反映错 配修复系统的失活,可能是肿瘤发生的一种新的机 制[3J.本研究选择3p14区域D3S1300,D3S1600两个 ? 32?中国现代医药杂志2005年8月第7卷第4期MMJC,Aug2005,~ol7,No.4 微卫星位点分析41例宫颈癌组织LOH与MSI的 改变.现报道如下. 1材料与方法 1.1病例资料由江西省妇幼保健院病理科为本研 究提供41例宫颈鳞癌石蜡切片标本,每例为4张 10um连续切片及1张5urn切片.所有患者术前均 未接受其它治疗,其中病理分级I级10例,?级22 例.?级9例,临床分期I期25例,?期16例. 1.2标本与显微切割I4I运用NCI(美国国家癌症研 究中心)实验手册提供的方法,进行显微分离前切片 准备,取已准备好的切片,先确定肿瘤组织区域,在 倒置显微镜(10X或20X)视野下观察肿瘤组织区 域,右手持无菌细长针头,寻找目的区域,刮除肿瘤 组织.针尖部刮下的组织小心地放入已装有蛋白酶 K缓冲液(50mMTris,1mMEDTA,1%Tween20, 0.1mg/ml蛋白酶K,PH=8.0)的小离心管中(刮下组 织应占缓冲液容积的25%,30%);同样方法刮除切 片上的正常组织做为对照.将装有显微分离的肿瘤 组织及正常组织的蛋白酶K缓冲液的小离心管置 于37cc水浴锅中孵育过夜. 1.3微卫星多态标记D3S1300,D3S1600微卫星标 记物购自上海生物工程公司.序列见表1. 表1引物序列 物的电泳条带与相应正常组织比较,若肿瘤组织中 某一等位基因条带消失或其中一条相对密度减少 50%以上.判定为LOH.若出现等位基因条带的增 多或长度大小的改变记录为MSI. 1.7统计分析不同位点间LOH及MS1分布差异 与临床分期,病理分级关系采用检验. 2结果 对宫颈癌标本染色体3p14区域的2个微卫星 位点的LOH和MS1分析结果见图1,2,不同位点的 LOH和MSI频率见表2. D3Sl600D3Sl300 图lD3S1300,D3Sl600位点微卫星不稳定性电泳图 N:表示正常宫颈组织;T:表示宫颈癌组织;箭头(一)表 示肿瘤组织发生MSI.图片下方为微卫星位点名称. 微卫星位点引物序列产物长度 1.4PCR扩增251M反应体系中加入蛋白酶K缓 冲液消化的(预先经95oC,10min灭活蛋白酶 K)5l,dNTP0.5l(终浓度为2001~mol/L),上下游 引物混合液2.5l(终浓度0.51,zmol/L),MgC1溶液 1.5l(终浓度1.5mmol/L),TaqDNA聚合酶0.5l (1.5u),94cc预变性5min,94oC30S,59oC,60cc30S. 72oC45S,35个循环后,72cc延伸5min 1.5变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显带将PCR 扩增产物5l加入等体积的上样缓冲液(95%去离 子甲酰胺,20ramEDTA,0.05%溴酚兰,0.05%~-甲苯 青)经98cc变性10rain,立即置于冰水浴中,上样于 8%变性聚丙烯酰胺凝胶(含尿素7M),接通电路后, 经0.2%AgNO,染色显带. 400V电压下电泳2小时, 1.6LoH与MSI判定[51宫颈癌组织PCR扩增产 TNNT D3Sl3Ll0D3Sl6O0 图2D3S1300,D3S1600位点LOH电泳图 N:表示正常宫颈组织;T:表示宫颈癌组织:箭头(一)表 示肿瘤组织发生LOH.图片下方为微卫星位点名称. 2.1临床分期与LOH和MSI的关系对41例标 本临床分期进行分组,结果显示LOH在临床I,?分 别为48%,81%,统计学分析表明两组中的差异有显 着性意义=4.53,P<0.05),提示LOH发生频率与 宫颈癌病程进展相关.MSI在临床I期为12%,II期 为31%,不同临床分期中MSI无显着差异=2.30, P>0.05). 2.2临床病理分级与LoH和MSI的关系对41 例标本按病理分级分组,在病理I,II,?级中LOH 发生频率分别为20%,68%,89%,各组之间的差异 有显着性意义~--10.66,P<0.05),提示LOH与宫颈 中国现代医药杂志2005年8月第7卷第4期MMJC,Aug2005,Vol7,No.4 表2两个多态位点LOH,MSI结果 注:信息个数指同一标本癌组织及正常对照均成功扩增,且呈杂合态. 癌恶性进展有关.而MSI发生率分别为20%,16%, 33ok.统计学分析MSI的发生率在各组中无显着性 差异=1.435,P>0.05). 3讨论 肿瘤抑制基因和DNA损伤修复基因的失活与 癌基因的激活是恶性肿瘤发生,发展的分子基础,染 色体LOH分析为定位肿瘤相关的抑制基因及DNA 通过Internet查询分布 损伤修复基因提供了便利. 于某一染色体区段的高密度微卫星多态标记并检测 其LOH.可将等位基因的共同缺失区缩小到较小的 范围,从而使与其紧密连锁的相关肿瘤抑制基因的 分离与克隆成为可能. 目前的研究表明在宫颈癌3D各个信息位点都 有LOH发生.一部分LOH是肿瘤的原发性因素,即 它们的发生和病因有关:而另一部分是继发性 LOH,是肿瘤发展,转移中伴随的现象.我们认为寻 找在肿瘤发生,发展过程中起关键作用的LOH.才 是准确定位肿瘤抑制基因的关键.因而结合以往的 资料_6I7】.本研究选择位于FHIT基因下游的2对高 度多态性的微卫星位点,对41例宫颈癌组织进行 LOH分析后发现,25个病例至少存在一个位点的 LOH,其中D3S1300位点为35%,D3S1600为28%. 与以往的研究相比较,本研究所检测到的等位基因 杂合性缺失频率相当,25例LOH患者中.10例表现 出D3S1300和D3S1600位点的共同缺失.因而认为 在这两个位点附近可能存在候选肿瘤抑制基因.进 一 步的工作尚需在D3S1300和D3S1600位点之间 及其附近采用高密度的微卫星再次检测LOH.缩小 遗传学距离.克隆宫颈癌相关的肿瘤抑制基因 在本研究中LOH频率在临床分期中I期为 48%.II期为81%.经统计学分析有显着性差异(P< 0.05),以往的研究中Cheung等发现在?,IV期的 宫颈癌中.有4个位点的LOH明显高于早期肿瘤_8_ Wong等用微卫星分析64例宫颈鳞癌标本.LOH在 I,?期为43%,而在III,VI期为79%I9].Lars0n等利 用微卫星对宫颈上皮内瘤变进行LOH分析,I期为 0%.?期有25%,?期有41%的病例出现3条或更 多的染色体区域的L0H,与本研究的结论相同,提 示LOH的发生可能与病程进展有关.因而检测 3p14区域的LOH可作为宫颈癌病程进展的重要指 标.但本研究由于取材所限只研究了临床分期为I, ?期的病例.尚需增加?,?期样本进一步研究. 41例标本中不同病理分级的LOH阳性率分别 为I级20%,?级68%,?级89%,可见2位点多态 性分析阳性率与病理分级呈正相关,统计学分析不 同的病理分级之间的差异均有显着性(P<O.05),提 示2位点的L0H在宫颈癌的恶性演变过程中起着 重要的作用. 微卫星不稳定性是指由于复制错误(replication errors.RER)引起的微卫星DNA长研究中微卫星不 稳定性发生率较杂合性缺失低,D3S1300,D3S1600 位点MSI发生频率分别为7.5%,12.8%,略高于Chu 与Rodriguez的5-3%,5.6%的报道[",】,与Jimenez 的14.8%的报道相当[】,但在官颈癌不同的临床分 期,病理分级中无显着性差异.Nishimura的研究则 认为MSI在肿瘤的发生过程中是个迟发性事件_l4】. 近年来的研究显示以二核苷酸组成的微卫星在宫颈 癌中MSI发生率相对较高.如Chung对100例宫颈 癌的研究中,有25%宫颈癌组织出现双核苷酸微卫 星改变,可能与所选择的微卫星位点的不同有很 大的关系,MSI所引起的错配修复系统异常与宫颈 癌发生的关系尚需进一步研究. 参考文献 l徐从高,张茂宏,杨兴季,等.癌,肿瘤学原理和实践.5版.山东: 山东科学技术出版社.2001:83—92 2LazoPA.Themoleculargeneticsofcervicalcarcinoma.BrJ Cancer,1999Aug.80(12):2008—18 3ThibodeauSN.BrenG.SchaidD.Microsatelliteinstabilitvin canceroftheproximalcolon.Science.1993.260(5lO9):8l6—9 4ZhuangZ,BertheauP.Emmert—BuckMR.eta1.AmicrodiSSecti0n ? 34?中国现代医药杂志2005年8月第7卷第4期MMJC,Aug2005,Vol7,No.4 techniqueforarchivalDNAanalysisofspecificcellpopulationsin lesi0ns<lmminsize.AmJPathol.1995,146(3):620—5 5Mu110kand0,rMR,Kholodilo~NG,TkinNB.eta1.Genomic aherationsincelticalcarcinoma:lossesofchromosomeheterozy gosit)andhumanpapillomavirnstumorstatus.CancerRes, 1996.56(1):197—205 6ChungTk,CeungTH,LOWK.eta1.Lossofheterozygosit)atthe shortarmofchromosome3inmicrodissectedcervical intraepitheli—alneoplasia.CancerLett,2000,30:189—94 7ChuTY.ShenCY.ChiouYS,eta1.HPV—associatedcervical caucersshowfrequentalleliclossat3p14butnoapparent abrrationofFHITMrna.1htJCancer,1998,75(2):199—204 8CheungTH.ChungTK,PoonCS,eta1.A1leliclosson chronmsome1isassociatedwithtumorprogressionofcervical carcinoma.Cancer.1999.86(7):1294—8 9WongYF,ChungTK,CheungTH.Frequentlossofheterozygosityof chromosome3sh0narnldetectedbyPCR-basedmicrosatellite polymorphismsincervicalsquamouscellcarcinoma.CancerLett, l997.1l5(2):l61—4 10LarsonAA.LiaoSY.StanbridgeEJ.Geneticalterationsaccumulate duringcervicaltumorigenesisandindicateacommonoriginfor multifocallesions.CancerRes.1997,57(19):4171-6 llChuTY.ShenCY.LeeHS.Monoclonalityandsurfacelesion— specificmicrosatellitealterationsinpremalignantandmalignant neoplasiaofuterinecervix:alocalfieldeffectofgenomic instabilityandclonalevolution.GenesChromosomesCancer, 1999.24(2):l27—34 12RodriguezIA,BarrosF,CarracedoA.Lowincidenceof microsatelliteinstabilityinpatientswithcervicalcarcinomas. 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