葡萄籽原花青素对大鼠烟雾吸入性肺损伤的保护作用论文

葡萄籽原花青素对大鼠烟雾吸入性肺损伤的保护作用论文 独 创性 声明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个 人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特 别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究 成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名: 日期: 保 护知 识 产 权 声明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在校 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校 后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可 以公布论文的全部或部分内容(含电子版，保密内容除外)，可以采用影印， 缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园 网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中国优秀博硕 士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》，同意按《中国优秀 博硕士学位论文全文数据库出版》规定享受相关权益。 论文作者签名: 导师签名: 日期: 葡萄籽原花青素对大鼠烟雾吸入性 肺损伤的保护作用 研 究 生:瞿少伊 学科专业:内科学(呼吸病学) 所在单位:第四军医大学唐都医院呼吸内科 导 师:金发光教授(主任医师) 资助基金项目:军队―十一五‖攻关项目(08G-102) 关键词:葡萄籽原花青素;烟雾吸入;肺损伤 中国人民解放军第四军医大学 2010 年 04 月 第四军医大学硕士学位论文 目 录 缩略语表 .............................................................................................................. 1 中文摘要 .............................................................................................................. 4 英文摘要 .............................................................................................................. 8 前 言 ............................................................................................................ 13 文献回顾 ............................................................................................................ 15 正 文 ............................................................................................................ 24 实验材料 ............................................................................................................ 24 实验一 建立烟雾吸入性肺损伤大鼠模型 .................................................... 26 1 方法 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 26 2 结果 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 27 3 讨论 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 27 实验二 烟雾吸入性肺损伤大鼠的活体观察 ................................................ 29 1.实验方法 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 29 2 结果 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 30 3 讨论 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 31 实验三 GSPE 对烟雾吸入性肺损伤大鼠肺脏生化环境的影响 ................. 33 1 实验方法 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 33 2 实验结果 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 36 3 讨论 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 37 小 结 ............................................................................................................ 39 参考文献 ............................................................................................................ 40 附 图 ............................................................................................................ 49 个人简历和研究成果 ........................................................................................ 51 致 谢 ............................................................................................................ 52 第四军医大学硕士学位论文 缩略语表 缩略词 英文全称 中文全称 急性肺损伤 ALI acute lung injury 肺泡巨噬细胞 AM alveolar macrophage 急性呼吸窘迫综合症 ARDS acute respiratory distress syndrome 支气管肺泡灌洗液 BALF Bronchoalveolar lavage fluid 过氧化氢酶 CAT catalase 颈总动脉 Common carotid arteries CCA 持续气道正压 CPAP continuous positive airway pressure 谷胱甘肽 GSH glutathione 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-PX glutathion peroxidase 葡萄籽原花青素 GSPE Grape seed Proanthocyanidin Extract ICAM-1 intercellular cell adhesion molecule-1 胞间黏附分子1 IFN-γ Interferon-γ 干扰素γ IL-6 interleukin-6 白细胞介素6 IL-8 interleukin-8 白细胞介素8 肺血管内巨噬细胞 IM pulmonary intravascular macrophage INF-α interferon-α 干扰素α L-Arg L-arginine 左旋-精氨酸 1 第四军医大学硕士学位论文 缩略词 中文全称 英文全称 脂多糖 LPS lipopolysaccharide MCP-1 单核细胞趋化蛋白1monocyte chemotactic protein-1 丙二醛 MDA malonaldehyde 髓过氧化物酶 MPO myeloperoxidase NAC N乙酰半胱氨酸 n-acetyl-l-cysteine 中性细胞弹性蛋白酶 NE neutrophil elastase 一氧化氮 NO nitric oxide 一氧化氮合酶 Nitric-Oxide Synthase NOS 内皮型一氧化氮合酶 eNOS Endothelial nitric oxide synthase 诱导型一氧化氮合酶 iNOS inducible nitric oxide synthase 神经型一氧化氮合酶 nNOS neuronal nitric oxide synthase 动脉血氧分压 Partial pressure of oxygen in artery PaO2 原花青素 PC Proanthocyanidins 呼吸末正压 PEEP end-expiratory positive pressure PGE2 prostaglandin E2 前列腺素E2 中性粒细胞 PMN neutrophilic granulocyte 活性氧 ROS Reactive Oxygen Species 超氧化物岐化酶 SOD superoxide dismutase 肺表面活性物质相关 SP pulmonary surfactant proteinum 蛋白 2 第四军医大学硕士学位论文 缩略词 英文全称 中文全称 硫代巴比妥酸 TBA Thibabituric Acid TNF-α tumor necrosis factor-a 肿瘤坏死因子α 3 第四军医大学硕士学位论文 葡萄籽原花青素对大鼠烟雾吸入性 肺损伤的保护作用 硕 士 研 究 生:瞿少伊 导 师:金发光 教授 第四军医大学唐都医院呼吸内科，西安 710038 中文摘要 目的: 建立适用于烟雾吸入性肺损伤研究的动物模型，并使其具有稳定性、 可重复性。观察烟雾吸入性肺损伤大鼠在不同时期的表现、肺组织生化环 境变化、肺组织病理形态改变等，评价此动物模型的可靠性并分析烟雾吸 入性肺损伤的发生、发展过程。观察腹腔注射葡萄籽原花青素(GSPE)的 安全性，探讨 GSPE 对烟雾吸入性肺损伤大鼠的保护作用。 方法: 1(建立烟雾吸入性肺损伤大鼠模型 选用 2 月龄雄性 SD 大鼠 48 只，体重为 220,250g。实验室适应性喂 养一周后，完全随机选用 8 只大鼠为正常组(A 组)，其余大鼠参照第三军 医大学西南医院烧伤病研究所的方法建立烟雾吸入性肺损伤动物模型，吸 烟 10 分钟后间隔 5 分钟，重复 3 次。制模完毕立即测量大鼠呼吸频率，呼 吸频率大于 30 次/分的纳入下一步实验。 2(实验分组 将制模成功的大鼠完全随机分为2组:B组，模型组(致伤未治疗组)， 4 第四军医大学硕士学位论文 给予腹腔注射3ml双蒸水;C组，GSPE治疗组，给予腹腔注射GSPE双蒸水 溶液3ml(500 mg/kg)。 3(标本留取 于致伤后各时间点(2h、4h、12h、24h)分批腹腔注射 1%戊巴比妥钠 生理盐水溶液(30mg/kg)行麻醉。行大鼠颈总动脉插管，留取颈动脉血 1ml 进行血气分析。而后颈动脉插管放血至大鼠血流尽，暴露胸腔，取出肺组 织。取 1cm×1 cm 右上肺用 10,甲醛溶液固定留作 HE 染色，取部分右下肺 留作湿,干重(W,D)测量，剩余肺组织做好标记，放入-70?冰箱冻存，留 用制备组织匀浆。 4(监测指标 分别取各组大鼠肺组织进行肺组织湿/干重测定。左肺称重后手工匀浆， 制成10%匀浆液，离心后取上清液，分别测定测量超氧化物歧化酶(SOD)、 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、一氧化氮合酶(NOS)的活性和丙二醛 (MDA)、一氧化氮(NO)的含量。取固定好的肺组织，制作病理切片， 行HE染色，观察病程中各个阶段的病理变化。 结果: 1(大鼠的一般情况 致伤后 B、C 组大鼠呼吸频率均大于 30 次/分，先为呼吸浅快，继而出 现呼吸频率逐渐减慢，张口呼吸，哮鸣音、精神萎靡、行动迟缓等症状。 GSPE 治疗组大鼠较模型组大鼠呼吸频率减慢，精神尚可。 2(大鼠造模评价 模型组大鼠的肺组织湿/干重均显著高于正常对照组(P<0.05)，动脉血 氧分压明显低于正常对照组(P<0.05)。肉眼观正常组大鼠肺组织表面光滑， 无出血点，而致伤组大鼠肺组织表面湿润，有散在出血点，切面可见泡沫 5 第四军医大学硕士学位论文 样液体渗出。光镜下，正常对照组大鼠肺组织结构清晰，肺间质无增生。 致伤组大鼠可见肺泡壁破裂，肺内小血管充血，肺泡和肺间质中有大量中 性粒细胞浸润。 3(GSPE 对大鼠的影响 GSPE 对大鼠动脉血气的影响:正常组大鼠动脉血氧分压(PaO2)均维持 在较高水平(>94mmHg)。以正常组大鼠 PaO2 为，模型组大鼠致伤后 PaO2 开始下降，伤后 4h 降至最低，较正常组下降 29.3,(27.6mmHg)，它 们之间的差别具有统计学意义(p<0.05)。而 GSPE 抑制了这种烟雾吸入伤 后 PaO2 的下降趋势，GSPE 治疗组在致伤后 4h 时大鼠 PaO2 较模型未治疗 组升高 31.4,(21mmHg)。在致伤后 24h 时 GSPE 治疗组大鼠动脉血氧分 压上升至正常水平，GSPE 治疗组与未治疗组之间的差别具有统计学意义 (p<0.05)。 GSPE 对大鼠肺组织含水量的影响:以正常组大鼠肺组织含水量为标 准，致伤后模型组肺组织含水量明显升高，差异有显著性(P<0.05)，GSPE 治疗组肺组织含水量较模型组明显降低(P<0.05)，与正常对照组比较仍有所 升高，但差异无显著性(P>0.05)。 GSPE对大鼠肺组织生化环境的影响:与正常对照组相比，模型组SOD、 GSH-PX活性均明显降低(P<0.05)，GSPE治疗组SOD、 GSH-PX活性相较 模型组均明显升高(P<0.05)，且较正常对照组均无明显差异(P>0.05)。而 与正常对照组相比，模型组MDA活性明显升高(P<0.05)，GSPE治疗组MDA 活性较模型组降低(P<0.05)，但较正常对照组无明显差异(P>0.05)。模型 组TNOS活性和NO含量均较正常对照组有明显升高(P<0.05)。GSPE治疗 组较模型组TNOS活性和NO含量均明显降低，差异有显著性(P<0.05)，但 GSPE治疗组 TNOS活性及 NO含量较正常对照组仍升高，差异有显著性 (P<0.05)。 GSPE 对大鼠肺组织病理改变的影响:HE 染色显示，正常对照组大鼠 6 第四军医大学硕士学位论文 肺组织结构清晰，肺泡壁完整，肺间质无增生。模型组大鼠可见肺泡壁破 裂，肺内小血管充血，肺泡和肺间质中有大量中性粒细胞浸润，而 GSPE 治疗组大鼠肺组织结构大致清晰，炎性细胞浸润也较模型组明显减少。 结论: 反复多次烟雾吸入可诱导成年大鼠出现张口呼吸、精神萎靡、低氧血 症等肺损伤表现，并发生急性肺损伤的病理学改变。 烟雾吸入后，大鼠表现出一系列肺损伤表现，通过GSPE能有效的抑制 由此引起的低氧血症，提高肺组织抗氧化能力，抑制过度的炎性反应，减 轻肺水肿，这可能是与GPSE强抗氧化能力和抗炎作用相关。GSPE作为一 种天然抗氧化剂，对烟雾吸入性肺损伤起到了积极的保护作用。 关键词:葡萄籽原花青素;烟雾吸入;急性肺损伤 7 第四军医大学硕士学位论文 Effect of Grape seed Proanthocyanidin Extract in Rats of Smoke Inhalation Pulmonary Injury Candidate for master: QU Shao-yi Supervisor: Prof. JIN Fa-guang Department of Respiratory, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University. Xi' an 710038, China Abstract Objective: To set up an animal model apply to investigate smoke inhalation lung injury, which was of stability and repeatability. To observe the changes of rats’ manifestation, the pathomorphism and the biochemistry in lung in use of assessing the reliability of the smoke inhalation models and analysising the development of smoke inhalation lung injury. To observe the safety of intraperitoneal injection of GSPE and thus to investigate the effects and mechanism of GSPE on smoke inhalation injury rats. Methods: 1(Set up the model of smoke inhalation lung injury in rats Forty-eight male Sprague-Dawley rats weighing 220 , 250g were in experiment. After adaptive feeding for one week, 8 rats were taken out randomly as control group(A group). The rest models were established according by the methods of reported by Erfan Xie etc. in Burn Institute of the Third Military Medical University. They were exposed to dense smoke for 10minutes and then 8 第四军医大学硕士学位论文 removed from the holder for 5 minutes. This process was repeated for three times. According to the standard of breathing rate greater than 30/min, the qualified rats were brought into the next experiment. 2(Groups The qualified rats were randomly divided into two groups: B group, model group which were without treatment, received 3ml distilled water of intraperitoneal injection; C group: GSPE group, received 3ml solution of GSPE in distilled water (500 mg/kg) of intraperitoneal injection. 3(Specimen selection The rats were anesthetized by 1% napental (30mg/kg)of intraperitoneal injection at 2h, 4h, 12h, 24h,respectively. Common carotid arteries (CCA) of rats were dropped tubes. 1ml blood from CCA was collected for blood gas analysis. After died for blood loss from CCA, the thoracic cavities of rats were opened and their lungs were taken out. Part of (1cm×1 cm)right upper lungs(RUL) was fixed by 10% formaldehyde for HE staining, the other part of RUL was weighed (W,D), and rest was stored in -70? refrigerator for preparing tissue bomogenate. 4(Index mensuration Measure each group rats’ W/D of lung. Homogenate all the left lungs after weighing to be 10% homogenate, and then get out the supernate atter centrifugating to measure the activity of SOD, GSH-PX, NOS as well as the content of MDA, NO of rats’ lung in batch. Make pathological section to observe the pathological change in each stage. Result 1(The rat’general state of health 9 第四军医大学硕士学位论文 The breathing rate of B、C group were all quicker than 30/min after smoke inhalation injury. All of them manifested a series of symptoms including light and fast breathing, step down whereafter, and oral respiration, wheezing rale soon later, accompany depression and sluggish action. However the rats after interfere in GSPE manifested improved symptoms compare with model group. 2(Assess the pattern of smoke inhalation of rats The rats’ wet-to-dry weight ratio of lung tissue in model group was all higher than that in normal group significantly (P<0.05), however the arterial blood pressure of model group rats was lower than normal group obviously (P<0.05). The gross appearance of normal group rats’ lung tissue was smooth and glossy, without bleeding point, which was different from the model group rats. There are obvious differences between the nomal rats and the smoke inhalation injury rats under the light microscope, the nomal group’s tissue displayed complete structures and without hyperplasia in lung mesenchymal, but the injury rats’ tissue manifested broken alveolar wall, hyperaemia of small vessels in lung, mass of nertrophilic granulocyte infiltrated in both pulmonary alveoli and lung mesenchymal. 3(The effect of GSPE on pulmonary injury rats Effects of GSPE on arterial blood gas of rats: All of the control group rats’ arterial blood gas higher than 94mmHg, the model rats’ PaO2 began to descend after smoke inhalation injury, it became the lowest when after they were injured: it was 27.6mmHg lower than the nomal group’. There was significant difference between the two groups. However the data of GSPE group showed the obviously effect to smoke inhalation injury rats: the PaO2 was heighten 21mmHg than the model group rats’, and even the GSPE group rats’ PaO2 recovered to normal at 24h after injury. There was significant difference 10 第四军医大学硕士学位论文 between the GSPE groups and model group. Effects of GSPE on pulmonary moisture of rats: the water content in the lung of model group was more than that in the control group rats’ lung, and there was significant difference between two groups (P<0.05). However, the water content in the lung of treated group was markedly little than that in model group’ lung (P<0.05), and it was not significant more than that normal group (P>0.05). Effects of GSPE on biochemistry of smoke inhalation lung injury: Compared with the normal group, in the model group, the activity of SOD, GSH-PX decreased significantly (P<0.05), but compared with model group, in GSPE group, the activity of SOD, GSH-PX increased significantly(P<0.05). In model group, MDA activity was notably higher than that in control group (P<0.05), but in GSPE group, its activity was significantly lower than that in model group (P<0.05). TNOS activity and NO content increased markedly in model group compared normal group(P<0.05), but they decreased significantly in GSPE group compared model group(P<0.05)while increased still compared normal group(P<0.05). Effects of GSPE on pathological change of smoke inhalation lung injury: The HE stain showed that normal group rats’ lung tissue was smooth and glossy without hyperplasia mesenchymal, but in model group the tissue manifested broken alveolar wall, hyperaemia of small vessels in lung, mass of nertrophilic granulocyte infiltrated in both pulmonary alveoli and lung mesenchymal. In the GSPE group the lung tissue was smooth and glossy with little inflammation cells compared the model group. Conclusion The rats emerge typical symptoms of lung injury induced by smoke inhalation repeatedly, such as oral respiration, depression, long time hypoxemia 11 第四军医大学硕士学位论文 and pathology change of lung injury. GSPE restrains hypoxemia effectively, enhance the activity of anti-oxidant, lighten pulmonary edema and inflammation. GSPE has significant effect on smoke inhalation pulmonary injury may be related to it’s prominent ability of antioxidation. Key words: Grape seed Proanthocyanidin Extract; smoke inhalation; acute lung injury. 12 第四军医大学硕士学位论文 前 言 烟雾吸入常见于火灾、战争等环境中，主要通过吸入的热气和毒气颗 粒引发化学及物理性肺损伤，并成为致病、致死的重要原因[1-2]。烟雾吸入 性肺损伤起病急、发展快，临床无特效治疗方法，病死率高。最终死亡的 主要原因是其发展成急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)， 为临床常见的呼吸系统急危重症[2]。 目前烟雾吸入引起呼吸系统损伤的发病机制尚未明确，研究主要集中 烟雾吸入伴随大量毒性气体、缺氧、 在以下几点:(1)组织氧化性损伤 肺泡巨噬细胞激活和大量的活性氧自由基的产生，导致体内氧化和抗氧化 [3] 系统的平衡失调 烟雾吸入造成的 ALI 中，伤后机 。(2)过度炎症反应 体局部过度的炎症反应引起间接性肺损伤[4-5]。(3)细胞因子的变化 细胞 因子可能介导多器官功能损害[6]。(4)一氧化氮(NO)的作用 吸入 NO 能保护肺泡-毛细血管膜的完整性，但其具有自由基活性，一旦 NO 水平极 高将会发生组织氧化损伤[7]。大量研究表明氧化性损伤为烟雾吸入性肺损伤 的一种重要机制，研究发现肺内细外基质和肺泡腔中主要的内源性抗氧化 酶是 SOD，它与其它内源性抗氧化酶和非酶抗氧化物共同组成抗氧化体系， 维持正常的氧化与抗氧化动态平衡，而细胞外抗氧化物是调节肺部炎症反 应的关键[8]。研究发现烟雾吸入伤后肺组织 CAT 活性先增加后降低，在伤 后活性增加，说明烟雾去除后肺内氧应激和活性氧自由基的产生持续存在， 随着病情的进展酶活性逐渐降低，这与 SOD 活性持续降低是一致的，同时 也说明抗氧化剂治疗烟雾吸入伤的合理性[3]。 GSPE 是目前研究发现的最强效自基清除剂和脂质过氧化抑制剂之一， [9] 应用广泛，在保护心血管、抗炎、抗肿瘤等方面均有相关报导 。而 GSPE 是否能在烟雾吸入性肺损伤中提供新的治疗途径，目前相关研究甚少。本 13 第四军医大学硕士学位论文 实验旨在探讨 GSPE 干预烟雾吸入性肺损伤后所致的各种抗氧化酶变化以 及病程中不同时期的组织病理学变化，进一步研究 GSPE 作为抗氧化剂对 烟雾吸入性肺损伤大鼠的保护作用及其作用机制。 14 第四军医大学硕士学位论文 文献回顾 急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是指由心源性以外的各种肺内、 外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。ALI 主要的病理特征为由于肺 微血管通透性增高而导致的肺泡渗出液中富含蛋白质的肺水肿及透明膜形 成，可伴有肺间质纤维化。临床表现为呼吸频数和呼吸窘迫、顽固性低氧 血症[10-11]。急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS) [12] 是在二战伤员中被首次认识的，当时被称为―创伤性湿肺‖ 。ARDS 的发 病是一个动态过程，是严重的 ALI。两者是同一疾病过程的两个阶段，代 表着这一疾病的分期和病情进展。引起 ALI/ARDS 的高危因素很多，包括 肺内因素(直接因素)和肺外因素(间接因素)，其中由于吸入烟雾而导致 的肺损伤称为烟雾吸入性肺损伤[13]，为肺内因素所致 ALI/ARDS。 烟雾吸入性肺损伤常见于战场、火灾等环境，具有起病急、发展快、病 情重、病死率高等特点，临床上尚无特效治疗方法。烟雾吸入通过吸入的 热气和毒性物质引发物理性和化学性肺损伤，除致病因素对肺泡膜的直接 损伤外，更重要的是多种炎症细胞及其释放的炎性介质和细胞因子间接介 导的肺炎症反应，最终引起肺泡膜损伤，通透性增加和微血栓形成;并可 造成肺泡上皮损伤，表面活性物质减少或消失，加重肺水肿和肺不张，从 而引起肺的氧合功能障碍，导致顽固性低氧血症[12]。 目前烟雾吸入性肺损伤的发病机制尚未明确，国内外学者研究主要集中 在以下几点: 1(组织氧化性损伤 目前已知烟雾的成分多达 200 余种[14]，其中含有大量有毒物质，而氧 化物和氧自由基作为烟雾的主要成分，在烟雾气相和颗粒相中大量存在， 它们进入呼吸道后所引起的组织氧化性损伤可持续高达数天[15-16]。烟雾吸 15 第四军医大学硕士学位论文 入伴随大量毒性气体、缺氧、肺泡巨噬细胞激活和大量的活性氧自由基的 产生，导致体内氧化和抗氧化系统的平衡失调，是烟雾吸入性肺损伤的发 [17-18] 生、发展的一个重要过程 。 研究者通过观察羊烟雾吸入性肺损伤模型，发现烟雾吸入首先引起氧化 应激反应，致氧化产物增加，其中髓过氧化物酶(MPO)活性显著增强， 随着病程发展肺泡及各级支气管均出现中性粒细胞聚集，最终肺组织出现 不同程度的损伤[19]。同时，抗氧化酶的研究也在深入，杨天德[3]等发现烟 雾吸入伤后，肺组织中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX) 活性先增加后降低，而超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽(GSH) 含量持续降低。SOD 是肺内细胞外基质和肺泡腔中主要的内源性抗氧化酶， 它与其它内源性抗氧化酶和非酶抗氧化物共同组成抗氧化体系，维持正常 [8] 的氧化与抗氧化动态平衡 。而 CAT和 GSH-PX在伤后活性增加，说明烟 雾去除后肺内氧化应激仍存在，活性氧自由基的也仍持续产生，反应了伤 后肺组织的抗氧化能力即使无烟雾因素干预也在逐步下降。这同时也说明 氧化性损伤参与了烟雾吸入性肺损伤的发病过程，而相应的抗氧化治疗存 在其合理性。 2(过度炎症反应 烟雾吸入性肺损伤中，中性粒细胞在肺内聚集、激活，释放氧自由基、 蛋白酶和炎性介质，巨噬细胞、肺毛细血管内皮细胞的参与是 ALI/ARDS 发病的重要细胞学机制[12]。多种炎性介质及效应细胞共同参与并呈级联放 大的瀑布样炎症继发性损伤与继发性弥漫性肺实质损伤[20]。而中性粒细胞 (PMN)是造成过度炎性反应的主要因素，随着病程发展 PMN 先从肺毛细 血管内转移至肺泡腔[21]，而清除炎症反应灶内 PMN 的主要途径是细胞凋 亡，Sookhai[22]等研究发现，增加 PMN 的凋亡可 ALI 组织损伤。然而，实 验表明在 ARDS 早期，肺泡灌洗液及血浆中有抑制 PMN 凋亡的物质，导致 了因为炎症反应时间延长而使 ALI 进行性加重[23-24]。而过度的炎症反应如 16 第四军医大学硕士学位论文 何得到限制，恢复稳态平衡的机制很有研究价值，目前有动物实验表明支 气管肺泡灌洗液中炎细胞凋亡增加，PMN 凋亡及肺泡巨噬细胞吞噬凋亡细 胞参与了烟雾吸入伤大鼠恢复期肺内炎症消散的过程[25]。 同时，肺巨噬细胞的参与 ALI 的机制也引起了国内外研究者的重视。 比如大量分布在肺泡腔内，占据肺泡常驻细胞数量 80%的肺巨噬细胞中的 肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)，AM 能分泌 100 多种炎性介质， 参与组织的损伤修复[26]，作为体内唯一能于空气接触的细胞群，AM 起到 了重要的 ―防火墙 ‖作用。而肺血管内巨噬细胞( pulmonary intravascular macrophage，IM)则被认为在引发 ALI 的过程中发挥特定作用，研究人员 先后在犬、猪、羊以及人类肺毛细血管中发现 PIM 可产生一些炎症介质， 如前列腺素、白三烯等[27-28]。 目前有学者认为中性细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)在急性 肺损伤的发病过程中起到重要作用。NE 属于丝氨酸蛋白酶家族，是一种单 个二硫键[29-30]。研究发现预先应用 链糖蛋白，含有 218 个氨基酸残基和 4 NE 抑制剂处理实验动物可使急性肺损伤动物造模成功率降低，并且 NE 抑 制剂可减轻急性肺损伤的实验动物以及患者的伤后症状[31-33]，而体外应用 NE 可诱发典型的 ALI 症状;并且有实验也在 ALI/ARDS 的患者及模型动物 的 BALF 和血清中发现 NE 的水平增加[34]。 近几年还有动物实验发现在吸入性肺炎所致的 ALI 中模型中，单核细 胞趋化蛋白-1(MCP-1)可抑制肺内炎症反应[35]。而 MCP-1 本身可趋化单 核细胞、T 淋巴细胞等，并可诱导单核细胞表达黏附分子，使各种炎性细胞 向病变部位聚集。 3(细胞因子的变化 细胞因子在烟雾吸入伤中也发挥了重要作用。肿瘤坏死因子 α(TNF-α) 是诱导过度炎症反应的关键促炎因子，而活性氧(ROS)通过脂质过氧化而产 生细胞毒作用，是炎症损伤的重要介质[36] 。IL-1、IL-2、IFN-4、IFN-γ 与 17 第四军医大学硕士学位论文 TNF-α 均可使内皮细胞活化，同时细胞间粘附分子 1(ICAM-1)表达增加;当 [37] 。实验发现 IFN 与 TNF 的共同刺激内皮细胞后，ICAM-1 增加更为显著 烟雾吸入性损伤时肺匀浆中 IL-1β、IL-6、IL-8 及 TNF-α 有不同程度的升高， 其升高的水平可反映损伤的严重程度[38]。Marc[39]等发现预先给予 IL-8 抗体 后可达到保护烟雾吸入伤的作用。 4(一氧化氮的作用 Chollet-Martin[40]等对吸入一氧化氮的 ARDS 患者肺泡灌洗液中 PMN 研究发现，吸入一氧化氮组比对照组 H2O2 的释放量减少，IL-6、IL-8 均降 低，这说明吸入一氧化氮可能减轻 ARDS 损伤反应。另有实验表明，外源 性一氧化氮能够降低人 PMN 的培养上清液中 IL-8 水平，这将有助于应用 吸入一氧化氮来治疗 ALI。吸入 NO 能保护肺泡-毛细血管膜的完整性，其 可能的机制为:1、抑制激活的、紧密粘附的 PMN 跨 EC 的迁徙;2、可能 减轻 PMN 的呼吸爆发[41]。既往认为，NO 具有扩张血管和增加毛细血管通 透性及与超氧阴离子反应生成过氧亚硝酸(ONOOH)而参与炎症反应和炎症 损伤[42]。近年广泛研究认为，NO 吸入可选择性降低 ARDS 时的肺动脉压， 同时 NO 与氧自由基反应生成硝酸和亚硝酸盐，对 ROS 起消除作用，且 NO 对 ROS 清除作用远大于 ONOOH 的生成[43]。另外，吸入 NO 对 ALI 时肺组 织的保护作用，与吸入 NO 可选择性扩张具有良好通气功能肺泡区微血管, 改善了 ALI 时通气/血流比例的失调和氧合障碍有关[44]。吸入 NO 能保护肺 泡-毛细血管膜的完整性，但其具有自由基活性，一旦 NO 水平极高将会发 生组织氧化损伤[7]，因此 NO 应用的最佳浓度选择的研究显得非常重要，而 同时炎性细胞因子表达的抑制是否会增加感染性疾病的发生机会也是值得 深思的。 烟雾吸入性肺损伤目前在临床上并无特效疗法，主要根据患者临床表 现以及病理生理改变，针对治疗。目前临床主要治疗方法主要有: 1(机械通气治疗 18 第四军医大学硕士学位论文 机械通气本身并不能防治 ALI/ARDS，它主要是使患者存活时间延长。 ALI/ARDS 患者都存在不同程度的缺氧症状，而机械通气疗法是纠正缺氧的 有效手段。迄今为止，对 ARDS 患者机械通气时如何选择通气模式尚无统 一的标准。目前国内临床上广泛采用的通气模式为呼气末正压(PEEP)、持 续气道压力(CAPA)等，其中以 PEEP 主要使呼气末肺容量增加，外力使 闭陷小气道和肺泡开放，增加残气量和顺应性，改善肺内氧和功能，有效 提高动脉血氧分压。目前治疗 ARDS 的呼吸模式几乎都于 PEEP 联用[45]。 高频冲击机械通气治疗法自 Paulsen[46]等应用于烟雾吸入性 ARDS 患者 取得较好疗效后引起了广大学者的注意。Reper[47]等在 8 名烟雾吸入导致 ARDS 患者中应用高频冲击机械通气治疗，冲击频率在 400,800 次/min， 吸气峰压降低，平均气道压不变，结果显示伤后患者动脉血氧分压明显提 高，二氧化碳分压降低，治疗过程中未见明显副作用。 然而机械通气不当也易致肺损伤。烟雾吸入性肺损伤时出现气道梗阻 是一个很严重的问题，而梗阻物往往成固态，难以去除。烟雾吸入伤后气 道压力明显上升，患者机械通气给予高浓度氧时，肺阻塞部分易形成膨胀 不全且血流不被氧合，将会使肺通气/血流失调更加严重。目前认为小潮气 量机械通气可治疗 ARDS，以防止机械通气诱导产生肺部膨胀不均[48]。 新的通气模式还在不断探索，有学者提出联合应用肺泡复张手法间断 地给予高于常规平均气道压的压力，并维持一定时间，这种方式可使更多 闭陷肺泡复张，防止肺不张，以及改善氧合状况[49]。 2(肺泡灌洗 烟雾中含有大量有毒颗粒，这些异物被带入人体，成为呼吸系统组织 损伤的一个重要诱因。如何去除烟雾吸入伤的高危因素，国内研究人员在 实验中以大剂量生理盐水对烟雾吸入性肺损伤犬进行早期单侧肺灌洗，结 果显示虽然灌洗组换气功能降低，但肺组织 MDA、TNF-α 含量升高幅度明 显下降，说明生理盐水灌洗减轻了烟雾吸入造成的组织损伤。该实验中伤 19 第四军医大学硕士学位论文 后 24h 灌洗组与未灌洗组比较，肺组织含水量、肺心指数显著增高，心脏 及肾脏含水量降低，也反应了生理盐水灌洗对抑制全身炎症反应的积极作 用[50]。而氟碳溶液(PFC，对氧和二氧化碳有较强溶解力)在同期实验中 较之生理盐水又显示出更好的近期疗效。但 PFC 成本较高，临床上尚未广 泛应用。 3(药物治疗 糖皮质激素是临床常见药，在各种病因所致的 ARDS 中也有广泛应用， 然其在 ARDS 中确切作用尚无定论。烟雾吸入致 ARDS 后，过度炎性反应 以及早期出现肺水肿是其特征性表现，有研究表明，伤后立即给予地塞米 松可明显减少烟雾吸入伤大鼠肺肺组织含水量，改善微血管通透性，同时 抑制 NF-κB 活化，部分阻断细胞因子及粘附分子产生，减轻烟雾吸入 ARDS 中过度的炎性反应造成的损伤，但地塞米松对烟雾吸入伤后 12 h 水肿并无 明显作用[51]。更有研究发现，在 ARDS 早期大剂量短程使用糖皮质激素甚 至会引起死亡率的上升[52]。 一氧化氮是血管舒张剂，可调控微循环，目前普遍认为吸入 NO 可以 降低 ARDS 时的肺动脉压力。而 NO 对烟雾吸入性肺损伤的作用受到国内 外学者的注意，国内有实验发现吸入浓度为 20ppm 的 NO 能抑制烟雾吸入 性肺损伤大鼠的 PMN 产生活性氧(ROS)。该实验还发现在烟雾吸入致伤 后 12h 和 24h，吸入 NO 组大鼠肺组织匀浆中 TNF-a 较单一吸氧组明显减少， 而 24h 吸入 NO 组 ROS 较单一吸氧组出现明显减少，反应吸入 NO 能抑制 PMN―呼吸爆发‖，且有一定滞后性，提示两者可能存在相关性[53]。然而吸 入 NO 的浓度对 ARDS 治疗作用有极大影响，大量 NO 使血管通透性增加 并使组织水肿[54]。在一般情况下，NO 会被亚铁血红蛋白快速清除，但在炎 症发生的情况下，炎性细胞阻碍了血红蛋白的通过，此时过亚硝酸盐 (ONOO-，一种强氧化剂，为 NO 与过氧化物形成)就极易产生，使得肺 水肿加重，弥散功能减低。如何使 NO 更好的应用于临床，目前还有待更 20 第四军医大学硕士学位论文 深入的研究。 表面活性物质替代治疗也被认为在 ALI/ARDS 呃治疗中有一定价值。 有实验表明用 LPS 诱导猪急性肺损伤后，用表面活性物质治疗能显著增加 动脉血氧分压，但作用持续时间较短。 4(抗氧化治疗 在目前研究发现的烟雾吸入致 ALI/ARDS 的发病机制中，氧化应激是 重要的一环，而烟雾中含有大量的氧化物及自由基，因此补充抗氧化剂来 干预机体内氧化于抗氧化平衡在理论上可以起到治疗烟雾吸入性 ALI/ARDS。 N-乙酰半胱氨酸(NAC)在治疗烟雾吸入性肺损伤大鼠中，通过抑制白细 胞在肺组织中的浸润，减轻肺部氧化应激，从而增强肺组织抗氧化能力[55]。 此外，研究发现安溴索、硒元素等也在肺损伤中起到一定的保护作用[56]。 原花青素(proanthocyaniddin，PC)是一大类多酚化合物的总称，是 一种生物类黄酮，在植物体内广泛存在。PC 具有特殊的分子结构，被公认 为是目前最有效的天然抗氧化剂之一。葡萄籽原花青素(GSPE)是研究的最 深入的一种 PC，被广泛的开发和应用，主要是在美容、保健等方面。国内 外大量研究证实 GSPE 具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及保护心血管等作用 [57-59] ，但大部分都与其强抗氧化性有关。 GSPE 成分比较复杂，包括多酚、原花色素、低聚原花色素、单体等， 各成分间协同作用达到抗氧化，分子结构上有多电子的羟基与双键共轭， 因此电子在分子中非常稳定。大量研究表明 GSPE 具有很强的体内活性， 在抗氧化方面优于其他抗氧化剂。在研究 GSPE 对小鼠脑缺血-再灌注损伤 及常压缺氧的影响中发现 GSPE 可以延长常压缺氧及脑缺血小鼠的存活时 间，并呈剂量依赖性，通过降低耗氧量，提高缺血-再灌注小鼠脑组织中 SOD、CAT 活性，同时降低 NOS 活性及 MDA 含量[60]。国内有实验将大鼠 用百草枯染毒后制成 ARDS 的模型，并发现染毒组和对照组血浆和 BALF 21 第四军医大学硕士学位论文 中 SOD 和 GSH-PX 的活性明显下降，而 MDA 升高，表明 PC 对 ARDS 模 型大鼠有治疗意义[61]。有文献表明 GSPE 对因自由基引起的大分子 DNA 氧 化性损伤也具有有效的保护作用，比如 GSPE 对由衰老引起的髓核和多脑 区的 NDA 氧化损伤具有明显的抑制作用[62]。 GSPE 在保护心血管方面也被国内外学者们广泛的研究。Bagchi 等[63] 进行了许多实验研究，并且发现 GSPE 对实验动物及人类具有作用非常明 显的心血管保护功能。研究表明:GSPE 能够明显提高心脏缺血再灌注后左 心室的功能，减小心肌梗塞面积和室颤发生率，同时冠脉流出液中活性氧 和丙二醛的含量也明显下降。研究更一进步发现 GSPE 能够减弱心肌细胞 中 JNK-1 和 c-fos 蛋白介导的早期凋亡信号。 GSPE 具有良好的抗炎作用，有文献发现 GSPE 既能抑制肿瘤坏死因子 的产生，也能减少 PGE2 的形成[64-65]。实验发现 10 mg 的 GSPE 能减少大鼠 致炎足 MDA 生成，抑制炎症渗出液中 NOS 的 N-乙醯胺基葡萄糖苷酶 (β-NAG)活性，降低 IL-1β、TNF、PGE2 的含量，具有明显的抗炎作用[66]。 近来有研究报道 GSPE 具有降低动脉粥样硬化兔内皮炎症因子水平的作用 [67] ，目前研究认为原花青素的抗炎作用跟其抗氧化及清除自由基的能力密 切相关[68]。 近年来，原花青素的抗肿瘤作用也被深入的研究。Huynh[69]等发现从松 树皮中提取的 PC 能诱导人类乳腺癌细胞凋亡，并且具有选择性，其对正常 乳腺细胞无作用。可可原花青素对结肠癌细胞的生长具有明显抑制作用[70]， 有实验发现它可抑制 PhIP 诱导胰腺癌，但对于 PhIP 诱导乳腺癌却并无作 用[71]，Megumi[72]等还发现可可原花能明显抑制雄鼠 F334 肺癌(腺癌)的发 生，并且对甲状腺有一定的保护作用。国内有实验发现 60%乙醇葡萄籽浸 提液在模拟胃液条件下能阻止亚硝胺的合成，清除亚硝酸钠，对于亚硝胺 的致癌具有拮抗作用[73]。国内研究还发现原花青素 0.1 mmol/L 可抑制抗脱 落凋亡的胃癌细胞聚集，0.5mmol/L 可抑制在不同细胞周期的不同的胃癌细 22 第四军医大学硕士学位论文 胞并诱导胃癌细胞发生脱落凋亡[74]。Barbara[75]等研究发现蓝莓原花青素能 明显抑制男性荷尔蒙敏感性癌细胞( LNCaP)的生长。另外还有文献报道原 花 青 素 可 能 是 通 过 激 活 半 胱 天 冬 酶 类 ( caspases )， 使 细 胞 角 蛋 白 (cy-tokeratin18)降解而促进人口腔鳞癌细胞 HSC-2 及涎腺癌细胞 HSG 的凋 亡，同时 PC 对正常龈成纤维细胞 HGF 具有保护作用[76]。 GSPE 的生物活性非常广泛，目前其在胰岛素抵抗、高血压、肥胖等代 谢综合征的相关作用也被相继报道，GSPE 的功用从抗氧化、抗炎、抗肿瘤 等主要方面逐渐延伸到预防代谢异常等更多的领域。然而 GSPE 结构复杂， 其很多作用机制尚未明确，药理功能的研究还停留在实验阶段，需要更多 更深入的探索。 23 第四军医大学硕士学位论文 正 文 实验材料 1 实验动物 动物种属 提供单位 第四军医大学实验动物中心 二级 SD 大鼠 饲养环境:光照时间 6AM~6 PM，光照强度 330 1ux，室温 21?。实验 动物及实验环境符合国家技术委员会的《实验动物管理条例》。 2 主要试剂 试剂名称 生产厂家(公司) 葡萄籽原花青素 天津市尖峰天然产物研究开发公司 超氧化物歧化酶试剂盒 南京建成化学试剂公司 谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒 南京建成化学试剂公司 一氧化氮合酶分型试剂盒 南京建成化学试剂公司 一氧化氮试剂盒 南京建成化学试剂公司 丙二醛试剂盒 南京建成化学试剂公司 3 主要仪器 仪器名称 生产厂家(公司) 湘仪离心机厂 微量高速离心机(H1650-W 型) 上海光谱仪器公司 紫外可见光分光光度计 Sp-756pc 全自动血气分析仪 丹麦 ABL555 型 上海精密科学仪器公司 HH.21CU.600 型电热恒温水箱 上海精密科学仪器公司 电子天平 YP102N 金坛市华峰仪器公司 78-1 型磁力加热搅拌器 石蜡融箱 重庆试验设备厂 24 第四军医大学硕士学位论文 上海仁科生物科技有限公司 LEICA RM 2135 型石蜡切片机 上海肯强仪器有限公司 OLYMPUS CX-21 型光学显微镜 匀浆器 西安化学玻璃仪器厂 西安化学玻璃仪器厂 1200W 电炉 电热鼓风干燥箱 西安化学玻璃仪器厂 西安化学玻璃仪器厂 小型鼓风机 西安化学玻璃仪器厂 秒表 温度计 西安化学玻璃仪器厂 25 第四军医大学硕士学位论文 实 验 部 分 实验一 建立烟雾吸入性肺损伤大鼠模型 1 方法 1.1 动物准备 2月龄二级雄性SD大鼠48只，体重220,250g。实验室适应 性喂养一周并对大鼠进行全身及呼吸系统检查。完全随机分出8只大鼠作为 正常组。动物模型建立方法参照谢尔凡等研究方法[77]。 发烟室由直径32cm 手提式高压消毒锅改装。在锅壁 1.2 制作烟雾发生器 开两个孔，一为电源线通过孔(距锅底2cm)，另一为由长1m，内径5cm 耐 热管与小型鼓风机连接孔(距锅口2cm)。锅盖上开一直径2cm 螺孔，安一 长为10cm 的铁管，并以长1m内径3cm耐热管连接发烟室与致伤室。锅底内 置1200W电炉，电炉上铺放石棉网。致伤室为特制无边抽屉式密封木箱， 内径60cm×30cm×30cm，箱顶装温度计，并开一16cm×14cm玻璃窗，用于观 察动物致伤时情况。箱内四角顶部装4只60W白炽灯，用于控制箱内温度和 照明。箱后壁开一直径2cm 孔，经耐热管连接烟雾发生器。 1.3 发烟材料 干燥松木屑150g加煤油30ml，用前在容器内混拌均匀。 1.4 致伤步骤 电压为稳定220V并接通烟雾发生器内电炉电源，加盖预热 10,20分钟。当烟雾发生器内温度达85?左右时，放入发烟材料，盖紧锅 盖发烟5分钟，之后连接致伤室，启动小型鼓风机向烟雾发生器内匀速吹入 空气并将烟雾驱入致伤室。约5分钟后烟雾充满致伤室，此时快速拉开致伤 室抽屉将大鼠放入致伤10分钟，而后取出大鼠于致伤室外呼吸5分钟后再放 入致伤室内致伤10分钟。同法致伤三次，间隙二次，致伤方式为10—5, 26 第四军医大学硕士学位论文 10—5—10(分钟)。大鼠总吸烟时间30分钟。整个致伤过程中烟雾发生器电 炉及鼓风机均持续工作。致伤室内温度控制在34~39?。 致伤完毕后立即测量大鼠呼吸频率，出现张口呼吸，呼 1.5 呼吸频率测定 吸浅快，呼吸频率大于30次/分，并表现为精神萎靡，行动迟缓的大鼠认为 制模成功。 1.6 统计学分析 采用 SPSS13.0 统计软件分析，测量数据以平均数?标准差 — (χ?s)表示，统计方法为重复测量资料的方差分析。P<0.05为差异有统计 学意义。 2 结果 2.1 测量呼吸频率 40 只大鼠出现呼吸浅快，张口呼吸，精神萎靡。呼吸 频率大于 30 次/分，认为造模成功，均纳入实验。 2.2 动物分组均衡性分析 40 只大鼠按随机号大小顺序分为两组:B 组， 致伤未治疗组;C 组，GSPE 治疗组。分别进行编号，两组均为 20 只。分 析动物分组均衡性(表 1)。 动物分组均衡性分析 表 1 实验分组 A 组 B 组 C 组 体重(g) 233.0?18.2 235.4?16.3 231.9?17.6 P>0.05，各组体重总体均数无差异。分组具有均衡性。 3 讨论 烟雾成分非常复杂，目前已知的成分多达 200 余种，主要有醛类、光 气、氮氧化物、氯化氢及其它卤化氢、二氧化硫、氨等[14]。烟雾的成分会 因为不同物质燃烧而不尽相同，即使是同一物质在也会因燃烧条件不同而 致所产生的烟雾成分各异，难以达到伤情一致。此研究所建立的模型在国 27 第四军医大学硕士学位论文 内外经验上加以改进被认为尚属稳定。 醛类是木柴燃烧后烟雾中起到致伤作用的主要成分，其中的丙烯醛致 伤力较强，它能致气道粘膜蛋白变性，损伤纤毛，同时诱发炎症反应，并 且丙烯醛能引起肺泡毛细血管膜损伤，导致其通透性增加引发肺水肿。实 验中煤油主要用于助燃，煤油烟雾中的一氧化碳、总醛和丙烯醛的浓度分 别为木材烟雾的 8%、5%、2%[78]。一氧化碳主要引起组织缺氧，它与血红 蛋白(Hb)的亲和力较氧和 Hb 的亲和力大 240 倍，而烟雾吸入伤现场死 亡的主要原因是一氧化碳中毒和缺氧窒息[79]。因此，木柴和煤油的混合烟 雾在达到致伤目的的同时通过降低烟雾中一氧化碳的含量而使大鼠死亡率 降低。 在发烟过程中，尽管对发烟材料和发烟温度等进行了定量，但每批木 屑的成分并不可能完全一致，燃烧速度也不尽相同，因此烟雾成分和浓度 无法恒定。此外，动物的吸烟量会因为烟箱内烟雾分布不均而略有差别。 必须指出的是，造模中动物在清醒状态自动吸烟，尽管比较符合实际情况， 但个体差异不可避免，多种因素导致伤情存在差异。因此本研究中动物模 型只是一般意义上的恒定，尚需改进。 28 第四军医大学硕士学位论文 实验二 烟雾吸入性肺损伤大鼠的活体观察 1.实验方法 48 只 SD 雄性大鼠完全随机分为 3 组:正常组(A 组，8 只)、 1.1 动物分组 模型组(B 组，20 只)、GSPE 治疗组(C 组，20 只)。致伤后立即给予 B 组大 鼠腹腔注射 3ml 双蒸水，给予 C 组大鼠腹腔注射 GSPE 双蒸水溶液 3ml(GSPE 注射量:500 mg,kg) 1.2 常规生理指标监测 监测大鼠呼吸频率，同时观察大鼠精神状况。 分别于致伤后 2、4、12、24 小时四个时间点，随机选 1.3 动脉血气分析 取 12 只大鼠，其中 A 组 2 只、B 组 5 只、C 组 5 只，给予腹腔注射 1%戊 巴比妥钠生理盐水溶液(30mg/kg)麻醉大鼠。将大鼠仰卧固定在手术架上， 沿右侧颈部皮肤剪开，逐层分离出颈总动脉，近心端用动脉夹夹闭血管， 结扎远心端，用眼科剪沿颈总动脉剪一―V‖型口，用肝素钠冲洗 2ml 注射器 及颈动脉插管，将插管朝向近心段，插管成功后，用缝合线固定，于插管 末端连接注射器，放开动脉夹，注射器抽出约 0.5ml 动脉血后，取下注射器， 连接肝素化注射器，抽取约 1.0ml 动脉血，立即封闭针头，严格防止进入空 气。使用全自动血气分析仪进行血气分析。 采血完毕并颈动脉插管令大鼠放血至尽后，即刻沿 1.4 肺组织病理学观察 胸骨剪开胸壁，暴露胸腔，分离肺门部结缔组织，止血钳钳夹肺门部及肺 动脉血管，剪开肺门部并取出完整肺组织。肉眼观查两侧胸腔内是否有炎 性渗出物、积血等，并检查肺组织与胸膜有无粘连。取下肺组织置于无菌 纱布上，观察肺大体病理改变，拍照后称重标记。取 1cm×1cm 右上肺 用 10,甲醛溶液固定留作 HE 染色，取部分右下肺留作湿,干重(W,D)测 量，剩余肺组织做好标记，放入-70?冰箱冻存，留用制备组织匀浆。 29 第四军医大学硕士学位论文 1.5 肺组织含水量测定 于 4?等渗盐水中漂洗右肺下叶肺组织，去除表面 血污并以滤纸小心吸干表面水分，立即称肺组织湿重(使用 YP102N 型电 子天平)。称量后，将肺组织置于 75?电热鼓风干燥箱内烘烤 72h，再次称 量肺组织干重，计算肺组织湿/干值。 采用 SPSS13.0 统计软件分析所得数据，完全随机设计资 1.4 统计学分析 料的单因素方差分析及 SNK-q 检验分析，显著性水平为 α,0.05。P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 大鼠的血氧饱和度 整个实验过程中，正常组大鼠动脉血氧分压(PaO2) 一直维持在较高水平(>94mmHg)。以正常组为标准，烟雾吸入性肺损伤大 鼠动脉血氧分压一直维持在较低的水平(<72 mmHg)，在致伤后 4h 时降至 最低，较正常组下降 29.3,(27.6mmHg)，它们之间的差别具有统计学意 义(p<0.05)。而 GSPE 治疗组在致伤后 4h 时大鼠动脉血氧分压较模型未治 疗组升高 31.4,(21mmHg)，整个实验过程中 GSPE 治疗组大鼠动脉血氧 分压一直维持在较高水平(>83mmHg)，在致伤后 24h 时 GSPE 治疗组大鼠 动脉血氧分压上升至正常水平，GSPE 治疗组与未治疗组之间的差别具有统 计学意义(p<0.05)。(表 2) 以正常组大鼠为标准，致伤后模型 2.2 GSPE对肺组织含水量变化的影响 组肺组织含水量较对照组明显升高(P<0.05)。GSPE治疗组肺组织含水量较 模型组明显降低(p<0.05)，与对照组比较仍有所升高，但差异无显著性 (P>0.05)。(表2) 30 第四军医大学硕士学位论文 — 表2 各组PaO2、肺组织含水量比较(χ?s) 组别 动物数(只) 动脉血氧分压(mm Hg) 肺组织含水量(ml/g) 正常对照组 8 94.38?2.07 2.67?0.87 * ? 模型组 20 5.77?0.81 68.90?2.13 ?? ** GSPE 治疗组 20 3.31?0.56 89.45?1.79 注:与正常对照组比较:?P<0(01，*P<0(05;与模型组比较:??P<0(01，**P<0(05 2.3 GSPE 对大鼠病理变化的影响 肉眼观察正常组大鼠肺组织表面光 滑，红润，无出血点，而未治疗组肺组织表面苍白，不平整，可见散在出 血点，切面处可见泡沫状液体渗出。HE 染色显示，正常对照组大鼠肺组织 结构清晰，肺泡壁完整，肺间质无增生。模型组大鼠肺泡壁破裂，肺内小 血管充血，肺泡塌陷实变，肺泡和肺间质中有大量中性粒细胞浸润。而 GSPE 治疗组大鼠肺组织结构大致清晰，炎性细胞浸润也较模型组明显减少。(附 图) 3 讨论 低氧血症和肺水肿是急性肺损伤的重要诊断依据。造模后，与正常对照 组大鼠相比，模型组出现了动脉血氧分压显著降低，肺组织含水量明显增 加，光镜下观察大鼠致伤后病理改变均符合急性肺损伤的病理特点，提示 肺损伤模型建立成功。 烟雾吸入后，肺泡膜损伤，表面活性物质减少，血管通透性增加，引发 肺水肿，肺氧合功能障碍，导致顽固性低氧血症。而这一系列变化的发生 可能是因为(1)烟雾中的直接致病因素造成的损伤; 2)烟雾吸入致伤后， ( 机体内发生了过度的炎症反应，进一步加重损伤。烟雾中含有大量氧化物 和自由基，它们被吸入后对肺泡膜造成直接损伤。GSPE 治疗组大鼠致伤后 动脉血氧分压较致伤未治疗组明显升高，肺组织含水量明显下降，这可能 31 第四军医大学硕士学位论文 是 GSPE 作为一种强效的外源性抗氧化剂，具有很强的体内活性，有效的 抑制了烟雾中氧化成分对机体的损害，而 GSPE 的这种能力与其独特的分 子结构密切相关[80]。 实验中 B 组大鼠致伤后，肺组织病理表现较正常对照组改变非常明显， 肺组织结构不完整，肺泡壁破裂、塌陷，毛细血管充血，肺间质见可见大 量中性粒细胞聚集。这表明了烟雾吸入致伤后机体内发生了明显的炎症反 应，多种炎性介质和细胞因子参与到其中，并且以以中性粒细胞为主。而 GSPE 治疗组大鼠的肺组织与正常组大鼠相比，仍表现出了一定程度的组织 损伤，但与同一时间点的模型组大鼠相比，GSPE 组大鼠肺组织结构大致清 晰，炎性细胞浸润明显减少，肺内小血管充血现象较为少见。这些差异说 明了 GSPE 能抑制了过度的炎症反应，减少了机体的炎性损伤。有文献报 道 GSPE 对大鼠乙酸性结肠炎有效并呈剂量依赖性，另有文献也发现原花 青素能减少 AA 大鼠炎症组织中一氧化氮和炎症介质前列腺素 E2 的含量并 呈剂量依赖性[81-82]。 32 第四军医大学硕士学位论文 实验三 GSPE对烟雾吸入性肺损伤大鼠肺脏 生化环境的影响 1 实验方法 匀浆待用大鼠肺脏组织，称重标记，按 A、B、C 三 1.1 称重留取组织块 组分类保存于-70?冰箱等待下一步处理。取出的大鼠肺脏组织共 48 个，其 中正常组 8 个;未治疗组 20 个;GSPE 治疗组 20 个。 1.2 大鼠肺脏组织的处理 将大鼠肺脏组织放置于 0?生理盐水中，用移液 管量取预冷的 0.86%生理盐水(生理盐水总量为组织块重量的 9 倍)，用移 液管取总量 2/3 的生理盐水于烧杯中，用眼科剪快速剪碎，然后将剪碎的组 织倒入玻璃匀浆管中，剩余 1/3 冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块， 一起倒入匀浆管中进行匀浆，充分研磨，使组织匀浆化。以上操作于冰水 环境中以以 3000r/min 转速，离心 浴中进行。制备好匀浆后，离心机在 4? 20min(H1650-W 型微量高速离心机)，分离上清液并分装后放入-70?冰箱 备用。 1.3 大鼠肺脏组织抗氧化酶测定 1.3.1 SOD 活性测定:(1)原理:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生 超氧阴离子自由基(O2-.)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下 呈红紫色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含 SOD 时，则 对超氧阴离子自由基有专一性抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时 ( 测定管的吸光度值低于对照管吸光度，通过公式计算被测样品 SOD 值。 2) 方法:按要求准备好试剂 1-6，配制显色剂(试剂 5:试剂 6:冰乙酸=3:3: 2)，测定管(酶管)和对照管(非酶管)分别加入试剂 1(1ml);测定管加 入样品，对照管加入蒸馏水;所有管中分别加入试剂 2-4(均为 0.1ml);所 有试管置于漩涡混匀器充分混匀，置 37?恒温水浴 40 分钟;分别加入显色 33 第四军医大学硕士学位论文 剂(2ml)，混匀，室温放置 10 分钟，于波长 550nm 处，1cm 光径比色杯， 蒸馏水调零，比色，记录 OD 值。(3)计算:每毫克组织蛋白在 1ml 反应 液中 SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 量为一个活力单位。 SOD (U/mgprot)={[OD560(对照管)/OD560(测定管)-1]/50%×稀释倍数}/组织 中蛋白含量 mgprot/ml](南京建成化学试剂公司试剂盒)。 1.3.2 GSH-PX 活性测定 (1)原理:GSH-PX 可促进 H2O2 与还原型谷胱 甘肽(GSH)反应生成 H2O 及氧化性谷胱甘肽(GSSG)，GSH-PX 的活力 可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中 GSH 的消耗，可计算出 酶的活力。GSH-PX 的活力以催化 GSH 的反应速度来表示，由于这两个底 物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应(非酶促反应)，因此最后计 算此酶活力时必须扣除非酶促反应所引起的 GSH 减少的部分。(2)方法: 准备好试剂 1-7;配置储备液(即加蒸馏水 100 倍稀释成应用液);配置标 准品溶剂应用液(储备液:双蒸水=1:9);对照管和测定管分别加入 1mmol/L GSH(0.2ml);测定管加入(0.2ml);37?水浴 5 分钟;所有试管中加 入试剂 1(已预热至 37?，0.1ml)后 37?水浴准确反应 5 分钟;所有试管 中加入试剂 2(2ml);对照管加入样品(0.2ml)，混匀，3500 转/分，离心 10 分钟，取上清作显色反应，于波长 412nm 处比色，1cm 光径比色杯，蒸 馏水调零，比色，记录 OD 值。(3)计算:组织 GSH-PX 活力=(对照管 OD-测定管 OD)/(标准管 OD-空白管 OD)×标准管浓度×稀释倍数/反应 时间/(蛋白含量×取样量)。(南京建成化学试剂公司试剂盒)。 1.3.3 MDA 含量测定 (1)原理:过氧化脂质降解产物中的 MDA 可与硫 代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在 532nm 处有最大吸收峰。(2) 方法:准备好试剂 1-3;仅在标准管加入 10nmol/ml 标准品(0.1ml);仅在 标准空白管加入无水乙醇(0.1ml);分别在测定管和测定空白管加入测试样 品(0.1ml)，混匀;所有试管中加入试剂 2(1.5ml);除空白测定管外所有 试管加入试剂 3(1.5ml);空白管加入 50%冰醋酸(1.5ml)。混匀，试管口 34 第四军医大学硕士学位论文 用保鲜膜扎紧，用针刺一小孔，95?水浴 40 分钟，流水冷却，离心机 3500 转/分离心 10 分钟，去上清，532nm 处，1cm 光径比色杯，蒸馏水调零，比 色，记录 OD 值。(3)计算:组织中 MDA 含量(nmol/mgprot)=(测定管 OD-测定空白管 OD)/(标准管 OD-标空 OD)×标准品浓度(10nmol/ml) /蛋白含量(南京建成化学试剂公司试剂盒)。 1.4 大鼠肺组织 NO 含量和 NOS 活性的测定 1.4.1 NO 含量测定:(1)原理:NO 的化学性质比较活泼，在体内代谢很快 转化为硝酸盐(NO2-)和亚硝酸盐(NO3-)，而 NO2-又进一步转化为 NO3-， 利用硝酸还原酶特异性将 NO3-还原为 NO2-，通过显色深浅测定其浓度。 2) ( 方法:准备好试剂 1-7;混合试剂由试剂 1 和试剂 2 按照 1:1 比例配置; 显色剂按照试剂 5:试剂 6:试剂 7 =2.5:1:1 配置;空白管加入双蒸水 (0.5ml)，标准管加入双蒸水(0.4ml);标准管加入 100μmol/L 标准应用液 ( 0.1ml);测定管加入样本( 0.5ml);分别在所有试管内加入混合试剂 (0.4ml);混匀后在 37?水浴中准确反应 60 分钟;分别在所有试管中加入 试剂 3(0.2ml)，试剂 4(0.1ml);充分漩涡混匀 30s，室温静置 40min，以 3500 转/min，离心 10min 后，各管均取上清液 0.8ml，加入 0.6ml 显色剂显 色;混匀，室温静置 10min，蒸馏水调零，在 550nm 波长处，0.5cm 光径比 色杯，蒸馏水调零，比色，记录 OD 值。(3)计算:NO 含量(μmol/gprot) ,(测定管 OD,空白管 OD)/(标准管 OD,空白管 OD)×标准品浓度 (20μmol/L)/组织蛋白浓度(gprot/L)。(南京建成化学试剂公司试剂盒)。 1.4.2 NOS 活性的测定:(1)原理:NOS 催化左旋-精氨酸(L,Arg)和分 子氧反应生成 NO，NO 与亲核性物质生成有色化合物，在 530nm 波长下测 定吸光度，根据吸光度的大小计算出 NOS 活力。NOS 主要分为结构型 (cNOS)和诱导型(iNOS)。(2)方法:准备好试剂 1-3;在 TNOS 空白 管加入双蒸水(150μl)，TNOS 测定管加入双蒸水(100μl)，iNOS 空白管 加入(50μl);在 TNOS 测定管和 iNOS 测定管中加入样本(50μl);在 iNOS 35 第四军医大学硕士学位论文 空白管和测定管均加入抑制剂(100μl)，混匀;在所有试管内加入底物缓冲 液(200μl)、促进剂(10μl)、显色剂(100μl);混匀后于 37?水浴准确反 应 15min，于所有试管内加入透明剂(100μl)、终止液(2000μl)，混匀， 于 530nm 处，1cm 光径比色杯，蒸馏水调零，比色，记录 OD 值。(3)计 算:TNOS 活力(U/mgprot)=(TNOS 测定管 OD,TNOS 空白管 OD)/呈色物 纳摩尔消光系数×(反应液总体积/取样量)/(比色光径×反应时间)/蛋白 含量;iNOS 活力(U/mgprot)=(iNOS 测定管 OD,iNOS 空白管 OD) /呈色物 纳摩尔消光系数×(反应液总体积/取样量)/(比色光径×反应时间)/蛋白 含量。(南京建成化学试剂公司试剂盒)。 2 实验结果 2.1 GSPE 对肺组织 SOD、GSH-PX 活性及对 MDA 含量的影响 正常组大鼠 SOD、GSH-PX 的活性及 MDA 含量一直维持在正常水平， 致伤后 2h，烟雾吸入性肺损伤大鼠 SOD、GSH-PX 活性下降，MDA 含量 上升，4h 时 SOD、GSH-PX 活力均降至最低，MDA 含量升至最高，伤后 12h，SOD、GSH-PX 的活性略上升。而 GSPE 治疗组 SOD、 GSH-Px 活性 相较模型组均明显升高(p<0.05)，致伤后 2h，GSPE 治疗组 SOD、GSH-PX 活性低于正常水平，2h 后 GSPE 治疗组 SOD、GSH-PX 的活性逐渐上升， 到致伤后 24h，GSPE 治疗组 SOD 及 GSH-PX 活性略低于正常大鼠，且较 正常对照组均无明显差异(p>0.05)。(表 3)。 — 表 3 各组肺组织 SOD、GSH-PX 活性及 MDA 含量比较(χ?s) 组别 动物数(只) SOD(U/mgprot) GSH-PX(U/g) MDA(nmol/mgprot) 正常对照组 8 29.66?2.11 62.76?9.34 2.33?0.21 * * ? 模型组 20 42.28?13.96 3.17?0.93 26.46?1.79 ** ** ?? GSPE 治疗组 20 2.59?0.39 28.71?0.97 51.53?11.05 注:与正常对照组比较:?P<0(01，*P<0(05;与模型组比较:??P<0(01，**P<0(05 36 第四军医大学硕士学位论文 2.2 NOS活性及NO含量 模型组TNOS活性和NO含量均较对照组有明显升高(P<0.05)。治疗组 较模型组TNOS活性和NO含量均明显降低(P<0.05)，但GSPE治疗组TNOS 活性及NO含量较对照组仍升高，差异有显著性(P<0.05)。(表4) — 表4 各组肺组织NO含量、NOS活性比较(χ?s) 组别 动物数(只) TNOS(U/mgprot) NO(μmol/gprot) 正常对照组 8 1.28?0.26 5.01?0.54 * * 模型组 20 1.67?0.19 6.50?0.71 *** *** GSPE 治疗组 20 1.59?0.25 5.74?0.69 注:与正常对照组比较:?P<0(01，*P<0(05;与模型组比较:??P<0(01，**P<0(05 3 讨论 烟雾吸入性肺损伤与组织细胞氧化性损伤密切相关。氧化物和氧自由 基作为烟雾的主要成分，它们被吸入呼吸道后所引起的组织细胞氧化性损 伤可持续数小时至数天[15]。大鼠吸入烟雾后脂质过氧化反应水平及氧化应 激水平均增高，同时中性粒细胞大量渗出，聚集[83]。本实验对烟雾吸入性 肺损伤大鼠肺组织部分指标进行检测，发现致伤大鼠较正常大鼠肺组织 NO、MDA含量增加，GSH-Px、SOD活性均明显降低。实验中模型组大鼠 肺组织NO含量较对照组明显升高，NO是血管舒张剂，调控微循环，而当 NO大量存在时，将会成为与炎症反应相关的自由基，引发组织氧化损伤。 而SOD、GSH-PX的活性降低则显示肺组织的抗氧化能力明显下降。 国内外大量研究证实GSPE具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保护心血管等 广泛的作用，但大部分作用机制都跟其强抗氧化能力相关。我们选择GSPE 干预烟雾吸入性肺损伤，发现治疗组较模型组大鼠MDA含量下降，GSH-Px、 SOD活性升高，据此推测可能是GSPE参与了抗氧化的作用结果。在研究 37 第四军医大学硕士学位论文 GSPE对小鼠脑缺血-再灌注损伤及常压缺氧的影响中发现GSPE能剂量依赖 性地延长常压缺氧及脑缺血小鼠的存活时间，降低耗氧量，并能提高缺血- 再灌注小鼠脑组织中SOD、CAT活性。提高机体总抗氧化能力，降低NOS 活性及MDA含量[84]。还有实验观察GSPE对实验性动脉粥样硬化兔基质金 属蛋白酶(MMP)和氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)的影响，认为其抗动脉粥 样硬化的可能机制是降低了氧化应激的水平[85]。 此外，GSPE具有明显的抗炎作用，在本实验中肺组织病理学观察发现， GSPE治疗组较模型组肺组织炎性细胞浸润减少，肺间质和肺泡腔内有液体 渗出减少，而治疗组较模型组大鼠的PaO2明显升高，可能是其减少了对肺 泡毛细血管弥散膜厚度的影响，导致对气体交换的影响也降低。相关研究 认为GSPE的抗炎作用跟其抗氧化及清除自由基的能力密切相关[86]。 综上所述，葡萄籽原花青素作为一种天然抗氧化剂，在烟雾吸入性肺 损伤大鼠中能有效增强组织抗氧化能力，抑制过度的炎性反应，减轻肺水 肿，为烟雾吸入性肺损伤的治疗药物提供新的参考。 38 第四军医大学硕士学位论文 小 结 1(本实验建立了稳定的烟雾吸入性肺损伤的动物模型，致伤后模型动物均 出现呼吸浅快，低氧血症，肺水肿，抗氧化酶活性降低以及肺组织病理 改变等烟雾吸入性肺损伤的特征性改变。为以后的研究提供了可靠的动 物模型。 2(GSPE 作为一种应用广泛的强氧化剂，干预烟雾吸入性肺损伤后可升高 动脉血氧分压，增强组织抗氧化能力，抑制过度的炎性反应，减轻肺水 肿。对烟雾吸入性肺损伤有较好的保护作用。 3(本实验为烟雾吸入性肺损伤的临床治疗提供新的参考。而GSPE 水溶液 腹腔注射为一种安全的给药途径，为进一步研究GSPE对烟雾吸入性肺 损伤的作用机制提供了可行的给药途径。 4(本实验的不足及深入研究设想: (1)应延伸一部分实验即GSPE作用于致伤前，探索GSPE对烟雾吸入 性肺损伤是否存在积极的预防作用。 (2)应进一步明确GSPE的作用方式，探索GSPE更合理有效的给药方 式、频率及剂量，为进一步的临床应用奠定基础。 (3)应进一步研究部分抗氧化指标与GSPE可能存在的直接因果关系， 为明确GSPE在烟雾吸入性肺损伤中的作用机制提供依据。 39 第四军医大学硕士学位论文 参考文献 1. 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Phytochemistry,2005,66(1):89-98 48 第四军医大学硕士学位论文 附 图 正常组 正常组 模型组 模型组 GSPE 组 GSPE 组 附图一 肺组织肉眼观 49 第四军医大学硕士学位论文 正常组 正常组 模型组(2h) 模型组(4h) GSPE 组(2h) GSPE 组(4h) 附图二 肺组织病理变化(HE 染色，×400) 50 第四军医大学硕士学位论文 个人简历和研究成果 个人简历 第四军医大学临床医学系学士学位 2002.8-2007.6 第四军医大学唐都医院呼吸内科硕士研究生 2007.8-2010.7 学习期间发表文章 瞿少伊，金发光，高维，孙丹丹.葡萄籽原花青素对大鼠烟雾吸入性肺 损伤的保护作用.现代生物医学进展，2010;10(2):221-223 51