D—葡萄糖脱氢酶活力测定方法的研究——短小芽孢杆菌在D—核糖生产中的应用
D—葡萄糖脱氢酶活力测定方法的研究——
短小芽孢杆菌在D—核糖生产中的应用
天津轻工业学院第3期f总第38期)2001年9月
()F_rIANJ1NUNIVERS1TY(jFI.IGH1'INI}USFRYNo3Sum38200l
D,葡萄糖脱氢酶活力测定方法的研究
——
短小芽孢杆菌在D一核糖生产中的应用
张锦芳,藉小涛,杜连撑
(天津轻工业学院食品
系.天津300222)
摘要:IJ植糖发酵瘦离心洗涤得菌体.采用超声波破辟(在40kW下工作4s.间歇4s,破
碎90次){【ic备无细胞抽提液.取无细胞抽提液80L厦100txmo[/I葡萄糖,4Fmo NADP,06mmo[/ITrisHCJ(pH一6.种,】0"mol,IMnSO溶液各1mf_,在3(下保温l0 mlf】,测定A…的值.对比NADPH
曲线,划定)一葡萄搪脱盏酶的酶含量艰据剥定的
时间及酶蛋白的音量.从而确定』)葡萄糖脱氢酶的酶活力的测定方法 关键词:短小芽孢杆菌;)一葡萄糖脱氢酶;测定方法
中国分类号:R9773文献标识码:A文章编号:100【_456X(2001)03003704 STEDY0NTHEMETH0D0FDETERMINAT10N0ND—GLUC0S
DEHYDR0GENASE
—
THESE()FBAC1ACnIASPUM1lUSINPRoD0CINGDRIB0S,
ZHANGJin—fang,JIXiaotao.DULian—xlang
(Deparln-ientofFoodEngineering,TianjinUniversityofLightIndustry.Tian
1】n300222,ChLna)
AbstractFhece儿swereharveted{tomcentrifugedrmented,brmhofDribose.themdi~re
—
putedbyuiLrasonicwThesuspendedsolutionwfecentrifugedandcell—freeex~raclJot] werepreparedI'hecellfreeextraction(80txLand100~mol/[glucose,4t~mo[/lNADP,
06mmol/ITrisHC[(pH68),l01wao[/[MnSO(respective1ml)mixedtogether.The
ndxedsolutionwastrearedaT37【forl0minuteTheabsorptionnumber(A)sde iecIedbyspecttophometer756
Keywords:Bacillaspumilus:D,glucosedeh}~rogenase;themethod.tle*errninatizm
棱糖即D畦喃棱糖.它是生物体内核糖核酸
及许多辅酶的棱苷酸衍生物的构成成分,具有十分重
要的生理作用.它是一种五碳糖,在生物合成途径中,
D,葡萄糖脱氢酶是限制性酶].在短小芽孢杆菌转酮
酶缺失突变株发酵生产D核糖中,D一核糖高产菌株特
性之一就是必须具有较高D葡萄糖脱氢酶的活力.
1972年.Sasajima一等人对D一核糖生产菌通过反复诱
变,在维持转酮酶缺失的情况下,筛选葡萄糖脱氢酶活
收稿日期:2090t9一j
++作者简舟:张锦芳(1977,).女,山东潍坊^,硼士研究生
力高的突变菌,选育出一株D一核糖积累量为70mg/
mI,的高产菌.
由于D一葡萄糖脱氢酶使得葡萄糖脱氢,辅酶?
NADP作为受体得氢被还原成NADPH,NADPH
在340nm的紫外光下有最大吸收.根据此反应原
理,来测定D一葡萄糖脱氢酶的活力.本文详细地研究
了D葡萄糖脱氢酶的测定方法及条件
?38?
1材料与方法
1.1菌种
短小芽孢杆菌(dcf缸spl,f{|1:jF0ljF02
JF03JF041501.天滓轻1二业学院应用微生物研究 室保藏
1.2主要培养基及溶液
种子培养基幢?mI':玉米浆2.2.山梨醇2, K2HPO0.3,KHPO0.1,pH6.8,7.0.
发酵培养基g?mL:玉米浆2.6,葡萄精l8,山 梨醇2,(NH):SO055,(NH)!HPO.0.2.CaCO.2,
Mn0055,pH70,7.:,
溶液:100m0】/I葡萄糖,4,rmlol,,"INADP',
0.6mmol/I.rris—HCI(不同pH),l0m0【IX.'lnS() 1.3主要设备
756型分光光度仪,上海第三分析仪器厂. 1.4D一葡萄糖脱氢酶酶活力的测定方法
】.4.1ADtH标准曲线的绘制
精确称取标准NADPHjmg于10mI容量瓶 巾,定容,摇匀;取5mI于5,3ml容量瓶中.定容,摇 匀分别吸取0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0mI,补 水到4..8ml,756分光光度仪340nm下测吸光度 值.绘制标准曲线
1.4.:无细胞抽提液的制备方法
本实验采用超声波细胞破碎法.取发酵液离心 (35'2'040C,0)r.,"rain.收集菌体,用1mrno]/IMgCl!
溶液20m【,磷酸盐缓冲液20mI洗涤,悬浮于1omI TrisHCI溶液中,于40kW下工作4S,间歇4s.破碎 90次.离心.
1.4.3D葡萄糖脱氢酶活力最适pH的确定 取无细胞抽提液80,及100ffmo]几葡萄糖,4 INA,.,ITr【sHC】【一6.,
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64682680bmlo]MnSOml. 摇匀,37C保温10nfin,用756型紫外分光光度仪340 nm下测吸光度值.根据NADPH标准曲线,确定其D 葡萄糖脱氢酶的酶含量.根据酶含量确定最佳pH 1.4.4,J葡萄糖脱氢酶活力反应温度的确定 取无细胞抽提液80I.及100umo]/I葡萄糖,4 1~mo1.."lNADP,0.6mmo]/'ITrisHCI(T】H一6.8),10
m0】/IMnSO各1mI,摇匀,不同保温10rain,用
756分光光度仪340llm下测吸光度值,根据NADPH
标准曲线,确定其D葡萄糖脱氢酶的酶含量根据酶
含量确定最佳反应温度 天津轻工业学院2'181年第3期 1乱jD葡萄糖脱氢酶活力反应时间的确定
取无细胞抽提液80I及】『1L)tmm]/I葡萄糖,4
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tzrno]/IlmI30020,.jn min.用756分光光度仪340nm下删吸光度值根据 NADIH标准曲线确定其NAI)P~I标准曲线.确定其 )一葡萄糖脱氢酶的酶含量.根据酶含芾确定最佳反戊 时间
2结果与讨论
2.1ADPH标准曲线的绘制
按1.4.】所示的方法测定NAI)P[I的.值
结果如图1
图1NADPH标准曲线
从图l可看出,NADPH的含最与吸光度值成 正比关系,对数据进行回归处理得到回归方程:Y一 0oog2X一0.0S8,相关系数R:一0.9965,检验回U1 显着.由回归方程可得:酶含量一416.67×A,9.75 2.2破壁条件的确定
本实验采用超声波细胞破碎法,制备无细胞抽提 液.其结果如表l.
从表1可以看出:在90次时.镜检视野内几乎无 菌体;同时.酶含量达最高值,故选90次为最佳破碎次 数
2.3反应最适pH
根据文献74]报道该酶的测定是在pH8.0,室温下 测定的,但因为,J核糖的发酵条件是37C.pH6.8, 7.0下进行的,文献的测定方法与现行的生产』)核糖 的工艺条件差别很大,故进行了反应pH的确定在不 同条件下,测定比酶的活力结果如图2
由图2可以看出,D葡萄糖脱氰酶在【jH6.8, 7.2酶活力撮高,偏酸或偏碱都会降低酶活力因此, 确定了酶的最适pH为6.8,7.2
垦鳖三些兰堕坦张塑竺:::望塑墨皇莹里!苎堕:竺!中的盹?39?
表l破壁条件的确定
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及经验.般酶活的测定所采用的时间是(1O,15) rain根据本实验所测的实际情况.选择反应时间为10 [Tlin.在酶反应l0min时.立即沸水浴瞬时使酶失活, 10.000r/min离心击蛋白.340nm下删吸光度值 6r)646872768084
图2最适pH的确定
2.日最适温度的确定
在酶的最适pH下,不同反应温度测定酶活.结 果如图3
日,?
图3反应温度的确定
从图3可看出,此酶在pH6.8下,最适反应温 度为(30,40)[,j棱糖的发酵温度是37C.pH6.8 ,
7.0,都在酶的最适温度最适pH测定范围之内.由 此确定了该酶测定的最达温度为37C.最适pH为 6.8
2.5反应时间的确定
在最适pH7.0及最适温度3(下,取不同的反 应时间测定酶活力,结果如图4.
由于酶反应速度只是在最初的一段时间内保持恒 定.随着反应时间的延长,酶反应速度逐渐下降,从 图4可看出,随着反应时间的延长,虽然产物的含量
(用吸光度值表示)不断增大,但只是在最初的l0min 内产物的增加与时间保持正比关系,叉根据大量文献 株J凸徘Jj
图4反应时间的确定
2.6不同菌株的D一葡萄糖脱氢酶活力
分别发酵培养72h后,制备无细胞抽捉液.取80 l反应在37C下,保温l0min,涮r)葡萄糖脱氢酶 活力结果如表2.
表2不同菌株的D一葡萄糖脱氢酶活力
3结论
通过实验获得可行的,J葡萄糖脱氢酶活力的测 定方法,测定的条件为:
(1)采用超声波破碎法,在功率为40kW下,工 作4S,间歇4s,破碎90次;
(2反应温度为37下.pH6.8.反应时间为l0 fill13;
.测定 (3采用756分光光度仪在34oI]ITI下
NADPH的吸光度值
浚方法比文献报道的酶活力的测定方法更为优 越,原因在于该方的测定pH及反应温度与D核精
?
40?
生产菌的发酵条件基本一致.从而更为确切的反应出 了D一核糖发酵过程中,]葡萄糖脱氢酶的活力通过 测定,]葡萄糖脱氢酶的活力,可能以该酶活力为指标 来筛选D核糖的高产菌株及粗略的汁算D核糖的 产量.
参考文献:
[1]张克旭,陈宁等代谢控制发酵[M]北京:中国轻工
业出版社.1998.224
r2]sasaI?Kenichi.Doi.Mh圳andn】kll}1arrr(1
天津轻工业学院201年第3期
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明其载体类型.率规范建义采用双字母表示电子文献载体类型:磁带(magnetictape)
——
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如:.0l/()L】——联机网上数据库(da【abaonline)
[DB/M'I]——磁带数据厍(databaseonmagnetictyne)
[M/CD]一一光盘图书(monographonCD—ROM)
f"DKj——磁盘软件(computerprogram.ndisk) j/OL]——网上期刊(serialonline)
B/oL]——网上电子公告(electronicbul1etinboardonline) 以纸张为载体的传统文献在引做参考文献时不必往明其载体类型. 一一黼一一一养?,一_至的:至一l二一咄枇‰