【doc】新城疫病毒人工感染鸡诱导胸腺和法氏囊细胞凋亡的初步研究

【doc】新城疫病毒人工感染鸡诱导胸腺和法氏囊细胞凋亡的初步研究 新城疫病毒人工感染鸡诱导胸腺和法氏囊 细胞凋亡的初步研究 广西畜牧兽医2005年Vo1.21(2)51 新城疫病毒人工感染鸡诱导胸腺和法氏囊 细胞凋亡的初步研究 李翔,房慧伶,曾芸,兰宗宝 (广西大学动物科学技术学院,南宁530005) 中图分类~一--$858.315.3文献标识码:A文章编 号:1002—5235{2005}02—0051—03 摘要:本研究用新城疫病毒(NDV)参考强毒株 F48E8感染鸡,通过光镜和电镜观察鸡的胸腺和 法氏囊淋巴绌胞凋亡的形态学特征,并进行统计 学分析.NDV感染鸡后,其胸腺和法氏囊淋巴细 胞凋亡数量显着增加(P<0.01).实验结果说明 NDV参考强毒株F48E8人工感染鸡后可以诱导 胸腺和法氏囊淋巴细胞凋亡. 关键词:新城疫病毒;胸腺;法氏囊;细胞凋亡 新城疫(NewcastleDisease,ND)是由副粘 病毒科新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus, NDV)引起的烈性传染性疾病.NDV能够引 起鸡胸腺和法氏囊淋巴细胞大量坏死.对 NDV引起的病理学人们已经进行了较详 细的研究,但对NDV引起胸腺和法氏囊淋巴 细胞凋亡的研究较少.最近研究表明,NDV可 以在体外诱导淋巴细胞凋亡,但NDV在体内 诱导淋巴细胞凋亡尚未见报道.本试验对人工 感染NDV的鸡胸腺和法氏囊淋巴细胞进行光 镜和电镜观察,发现NDV在体内不但引起鸡 胸腺和法氏囊淋巴细胞坏死,而且引起淋巴细 胞凋亡,导致严重的免疫抑制. l材料和方法 1.1材料 1.1.1鸡 北海风翔畜禽有限公司提供中麻鸡30羽. 1.1.2NDV毒株 作者简介:李翔,1978生,男,汉族,河南人,基础兽医 学硕士研究生. 收稿日期:2004—05—26 F48E8株,广西大学动科院禽病室提供. 1.2方法 1.2.1检测试验鸡的母源抗体 血清学试验,呈阴性. 1.2.2实验鸡分组,攻毒,饲养 实验鸡随机分为感染组和对照组,每组l5 羽,隔离饲养.25日龄攻毒:将新城疫参考强 毒株F48E8进行l:l0稀释,每羽肌注0.5ml. 1.2.3取材 攻毒后每天剖杀对照组和感染组各3羽, 连续取材5天.取鸡的胸腺和法氏囊分别用 l0%的福尔马林溶液和3%的戊二醛固定. 1.24新城疫病毒的检测 选取攻毒后3天的鸡(对照组和感染组各 2羽)的肝脏,脾脏,胰脏的组织,混合后按韦天 超等的方法[]进行RT—PCR检测. 1.2.5光镜制样,观察 石蜡切片,H—E染色,光镜观察拍照. 1.2.6电镜制样,观察 l%锇酸固定,超薄切片,醋酸双氧铀和柠 檬酸铅染色,透射电镜观察,拍照. 1.2.7凋亡指数(%)的计算 光学显微镜下随机选择l0个视野,计数凋 亡细胞,并计算凋亡指数. 凋亡指数(%)=该范围内凋亡细胞数范围 细胞总数×100% 2结果 2.1感染鸡病毒的检测结果 按文献[]所述方法对所取材料进行RT— PCR检测.对照组结果均为阴性(0/2);感染 52广西畜牧兽医2005年Vo1.21(2) 组结果均为阳性(2/2),证实试验鸡已被NDV 强毒感染. 2.2胸腺,法氏囊淋巴细胞凋亡的检测结果 2.2.1形态学观察 ?光镜观察:正常细胞排列紧密,体积大小 适中,染色质分布均匀.凋亡早期的淋巴细胞 体积缩小,胞浆浓缩,并与周围淋巴细胞脱离. 随后细胞核染色质凝集,边集,裂解成致密的球 形染色质团块——凋亡小体,最后被巨噬细胞 吞噬.感染后期,在胸腺和法氏囊组织中发现 有细胞变性,坏死.对照组胸腺和法氏囊淋巴 细胞凋亡数量较少;感染组胸腺和法氏囊淋巴 细胞出现了明显的细胞凋亡.无论是对照组还 是感染组,凋亡细胞的数量在皮质多于髓质,而 且在皮质与髓质交界处最多. ?电镜观察:在电镜下正常细胞呈圆形或 椭圆形,细胞器完整,染色质分布均匀,电子密 集,电子密度增强,核膜和胞膜完整;中期,细胞 变形,细胞膜仍完整,凋亡细胞的细胞核出现各 种形态:半月形,”C”形,圆环状等;后期,在细 胞质内可见多个电子密度增强的核碎片,随后 细胞膜出泡;芽生形成有膜包裹的内有较完整 的细胞器和细胞核碎片,电子密度较高的凋亡 小体.最后凋亡细胞和凋亡小体被巨噬细胞吞 噬,清除.个别凋亡细胞的细胞器和胞质内出 现空泡,还有些凋亡细胞发生继发性坏死. 2.2.2统计分析 对凋亡的淋巴细胞进行统计分析. 从表1,表2可以看出:胸腺和法氏囊淋巴 细胞的凋亡率变化规律是一样的.胸腺和法氏 囊淋巴细胞的凋亡率感染组与对照组呈极显着 差异(p<0.01).(1)感染组的凋亡率显着高于 对照组;(2)对照组凋亡率随着天数的增加而增 大;(3)感染组的凋亡率随着天数的增加而增 度均匀,适中.细胞凋亡早期,染色质浓缩,边大,并于第三天达到最大, 以后逐渐回落. 表l胸腺淋巴细胞平均凋亡率(%) 注:同一列小写字母不同者表示差异极显着(p<0.01).下同. 表2法氏囊淋巴细胞平均凋亡率(%) 3讨论 3.1在光镜和电镜下都可以观察到凋亡细胞 及凋亡小体,从不同角度显示了细胞凋亡的形 态变化过程.表明NDV能在体内同时引起鸡 淋巴细胞坏死和凋亡.这与LamKM报道的 NDV感染在导致细胞凋亡的同时又伴随着细 胞坏死的结果是一致的[.凋亡细胞的数量, 在皮质多于髓质,而且在皮髓交界处最多.这 是由于皮质和皮髓交界处为淋巴细胞进行阳性 选择和阴性选择的部位,淋巴细胞的阳性选择, 导致了CD4或CD8细胞的出现和正常发育, 而阴性选择导致了凋亡-3J.所以在皮质或皮 髓交界处出现细胞凋亡的机率就大一些. 3.2感染组淋巴细胞的凋亡率显着高于对照 组(p<0.01).由于凋亡细胞和凋亡小体被巨 噬细胞吞噬,清除十分迅速,因此对照组虽然有 一 定量的细胞凋亡,但是在组织片中凋亡细胞 和凋亡小体并不多见J.对照组的凋亡率有 逐渐升高的趋势,但是变化范围不大,这可能与 细胞凋亡能控制细胞数量有关.鸡胸腺,法氏 囊每天新产生的淋巴细胞有95%通过细胞凋 亡而消失. 感染组在第三天细胞凋亡率达到最大值, 以后逐渐回落,这可能与NDV诱导的时间有 关.刘胜旺等,在新城疫F48E9病毒体外诱导 广西畜牧兽医2005年Vo1.21(2)53 鸡T细胞程序性死亡的试验中证实随着病毒 诱导时间的增加,凋亡细胞的数目也明显增 加j.细胞凋亡作为一种防御病毒感染的机 制,是通过细胞凋亡阻止病毒的扩散及病毒后 代的持续性感染【6j.鸡感染NDV后,机体对 病毒刺激的应答,淋巴细胞发生变化,原先功能 为识别抗原的细胞分化成功能性细胞.随着淋 巴细胞增加,凋亡细胞也相应增加,细胞凋亡率 也随之增大. 感染第三天后细胞凋亡率逐渐回落可能与 细胞坏死有关.有些细胞在病毒感染较严重时 以坏死形式发生死亡,在病毒感染的早期,坏死 细胞较少,但随着病程的延长,坏死的程度也随 之增加7j.陈志胜等,通过对鸭肝炎病毒诱导 雏鸭细胞凋亡的研究,发现DHV强毒株在接 种后24小时即可诱导免疫器官有明显的细胞 凋亡,而接种后72小时凋亡逐渐停止.胸腺, 法氏囊凋亡率在36小时达高峰,然后被坏死代 替,揭示了免疫细胞的凋亡先于病理性损伤发 生Isj.这与本试验结果相符合. NDV感染后,引起细胞凋亡,造成淋巴细 胞大量丢失,引起免疫抑制是NDV感染鸡发 病的重要原因之一.病毒诱导细胞凋亡的机制 是多方面的,病毒基因,癌基因,抑癌基因等也 参与细胞凋亡的过程,细胞凋亡的具体机制还 有待进一步研究. 参考文献 [1]韦天超,韦平,杨宗维等.应用新城疫病毒强弱毒株 RT—PCR鉴别诊断技术检测多种禽类副粘病毒 [J].中国兽医科技,2003,33(12):44--47. 12JLamKMetalVetInmuno1.Irnmunopathol,1994, 44(1):45--56 [3]彭黎明,王曾礼主编.细胞凋亡的基础与临床[M] 北京:人民卫生出版社,200021--24. [4jSurhCD,SprentJ.T—cellapoptosisdetectedinsitu duringpositiveandnegativeselectioninthethymus [J].Nature,1994,372(3):100,103. [5]刘胜旺,陈洪岩,孔宪刚等新城疫F48E9病毒体外 诱导的鸡T淋巴细胞程序性死亡[J].中国农业科 学,2000,33(1):82,86. [6]潘玲,吴信法病原微生物感染与细胞凋亡[J].中 国兽医,1998,18(5):518,520. [7]林祥梅,赵增连,陈万芳.鸭源流感病毒人工感染 鸡后诱导的细胞凋亡[J].北京农学院,2000, l5(2):28,30. [8]陈志胜,王丙云,潘忠雄等.鸭肝炎病毒诱导雏鸭 细胞凋亡的研究[J].中国兽医,2003,23(2): l36,l37. 仔猪水肿病大肠杆菌的分离鉴定 谢永平,杨威,黄红梅 (广西兽医研究所,南宁530001) 中图分类号:$858.285.12文献标识码:A文章编号:1002—5235 【2005)02,0053—03 摘要:从临床出现仔猪水肿病症状的死亡仔猪的 心血,淋巴结和水肿液中分离到三株细菌,分别 命名为GP7_.I,GP8一I,GP83.经细菌形态学观 察,鉴别培养,生化分析及血清型鉴定确诊为大 肠杆菌,其血清型分别是O101,0147和O139;三 株分离菌对小白鼠的致死率分别为20%,100%, 作者简介:谢永平,女,1967年生,研究生,高级兽医师, 主要从事畜禽传染病防治和病理学科研工作. 收稿日期:2004—02一JJ 40%;药敏试验结果表明,三株分离菌均对丁胺 卡那,头孢三嗪,头孢哌酮,头孢噻肟,氧哌嗪青 霉素高度敏感,对头孢唑啉,卡那霉素,链霉素, 复方磺胺,利福平,氨苄青霉素耐药. 关键词:仔猪水肿病;大肠杆菌;分离鉴定 仔猪水肿病是由某些血清型大肠杆菌引起 的肠道毒血症,主要危害断奶仔猪,引起仔猪全 身或四肢麻痹,共济失调和面部水肿等症状. 近几年广西各地猪场发病率有所上升,成为危