里氏木霉重组t_PA的酶性质的研究

里氏木霉重组t_PA的酶性质的研究 里氏木霉重组 t - PA 的酶性质的研究 邵金华 ,孟凡玲 ,蒋琼凤 ,冮 洁 ()湖南科技学院生化系 ,湖南永州 , 425100 摘要 :利用分光光度计对里氏木霉重组 t - PA 的性质进行了研究 ,结果表明该酶对高温较为敏感 , 60?酶完全失活 ; 在 2 + 3 + 2 + 2 + pH6. 4,7. 6范围内 ,作用时间的长短对酶活力影响不大 ,保持较大的酶活 ; Zn和 Fe离子对其有抑制的作用 , M g、Ca、2 + 2 + 2 + + + Cu、Fe、M n、N a 、K对酶有激活的作用 。 关键词 : 里氏木霉 ; t - PA; 性质 ( ) 文章编号 : 1006 - 8376 2009 03 - 0033 - 03 中图分类号 : Q5 文献标识码 : A t - PA 是体内各种组织中都含有的一种酶 ,它 PA 的发酵产物进行了提取 ,收集提取液 ,在冰箱中 能选择地将血栓中的纤溶酶原变成纤溶酶使血栓溶 4 ?保存备用 。 解 。 t - PA 在没有血栓时几乎无此作用 。与尿激酶 1. 4 酶活力的测定 不同 , t - PA 引起的血栓溶解一般不伴有全身出血 纤溶酶原激活剂标准品的配制 : 用生理盐水稀的倾向 ,因而成为新一代血栓溶解剂 。目前 ,国外已 释纤溶酶原激活剂标准品配置每毫升 0. 5、1、3、5、 有 t - PA 基因工程产品用于临床 ,国内也正在加紧 10、20、30、50 U 系列浓度 ; 测定 : 吸取每个浓度 对其进行研制 。本实验室 ,在成功的分离纯化里氏 μ的样品 10 L 点于已制备好的血纤维蛋白平板上 , 木霉重组 t - PA 以后继而对该酶进行了部分性质和 每个浓度各点 3 个平板 ,然后置于 37 ?恒温箱中保 稳定性研究 。研究这些影响因素 ,有利于对里氏木 温 6 h,观察并垂直测量溶解圈直径 ,反复测定 3 次 , 霉重组 t - PA 进行药理药效的分析 ,也有利于采取 ( ) 求平均值 ;做回归曲线 : 用 Exce l建立酶活力 C 和 各种手段为该酶进行保藏 、运输等提供科学的依据 。 () 溶解圈直径 A 的回归方程 log C = 7. 7428 log A - 6. 2443 , - 1 1 材料和方法 ( ) C - t - PA 酶 活 力 U ?mL , A - 溶 解 圈 直 径1. 1 材料与试剂 里氏木霉工程菌株由天津科技大() mm ;用同法测定样品 ,将所得的溶解圈的直径代 学应用微生物 入回归方程 ,经计算得 t - PA 酶活力 。 研究室制备 ;凝血酶 ,中国医科院血液研究所 ; 牛血 1. 5 纯酶性质的研究 纤维蛋白原 , 北 京 经 科 公 司 ; 主 要 仪 器 为 UV - V is μ1. 5. 1 温度对酶活的影响 将纯酶液 10 L 点在血 分光光度计 ,美国 TECHCOM P L IM ITED。 纤维蛋白平 板上 , 分 别置 平 板于 28 ?, 32 ?, 37 ?, 1. 2 粗酶液的制备 40 ?, 42 ?, 45 ?, 47 ?, 50 ?, 52 ?, 60 ?恒 温 箱 中 以接种量 10 % , 即 10 mL 将菌种接于 500 mL 保温 6 h,测定酶活力 。- 1 三角瓶 , 28 ?, 150 r?m in 下培养 48 h。发酵液1. 5. 2 酶 的 耐 热 性 取 纯 酶 样 品 分 别 置 不 同 温 度 - 1( ) 25 ?、30 ?、35 ?、37 ?、40 ?、45 ?、50 ?、60 ?条 8000 r?m in 离心 25 m in, 除去菌体和残渣等固形 件下保温 0. 5 h、1. 0 h、2. 0 h和 4. 0 h,定时取样迅 杂物 ,取含 t - PA 的上清液备用 。 速冷却后 , 37 ?,保温 6 h,测定酶活力 。 1. 3 纯酶液的制备 1. 5. 3 pH 对酶活的影响 在用缓冲溶液配制的不同选用 D 296 进行粗酶液的脱色后 , 通过 75 %饱 pH 值纤维蛋白 平板 上 , 用 微量 取液 器 分别 加酶 样和度硫酸铵盐析 8 h,然后对各种分离纯化的方法进 μ 10 L ,置 37 ?恒温箱中保温 6 h 后 ,用游标卡尺测 行比较和优化 ,最终运用强阴离子交换剂 Q - Sep h2 a ro se FF离 子交 换色 谱 、Sup e rdex 75 P rep Grade 凝 量透明溶圈直径 ,代入公式计算酶活力 。 胶过滤色谱蛋白质分离纯化 , 对里氏木酶重组 t - 1. 5. 4 酶的 pH 稳定性 用 pH3. 4 ,11. 4 的广泛缓 冲溶液置 37 ?恒温 箱 中保 温条 件 下处 理酶 液 0. 5 收稿日期 : 2009 - 04 - 15 h、1 h、2 h、3 h,测定酶活力 。 ( ) 作者简介 :邵金华 ,女 1981 - 助教 。 E - m ail: jinhua0212 @ 163. com 1. 5. 5 金属离子对木聚糖酶活性的影响 分别用双 2. 3 酶的最适作用 pH - 1) ( 0. 1 mo l?L 的 CuSO 、Fe SO 、FeSO 、蒸水配制 由图 3 可知 ,酶的最适 pH 为 7. 6 ,此时 ,酶的 4 4 3 4 ZnSO、M nSO、CoC l、KC l、CaC l、N aC l、M gSO溶液 ,活性最高 。整个图的形状为典型的“钟形 ”, pH 值 4 4 2 2 4 - 1 的升高或降低都会影响酶的活性 。 然后将它 们 系 列 稀 释 为 10 mmo l ?L 、5 mmo l ? - 1 - 1 2. 4 酶的 pH 稳定性μL 、1 mmo l?L 。各取 20 L 纤溶酶液分别加入 图 4 表明 , 该酶在 pH6. 4,8. 4 的范围内 ,在同 μ20 L 系列浓度的金属离子溶液 ,以双蒸水为对比 , 一时间段内 ,残余酶活的损失最小 ,而且在这个 pH 每个样做 3个平行 。混匀 , 37 ?温育 18 h后 ,取 10 范围内 ,残余酶活的活力高 ,所以酶的最适 pH 稳定 μL 混合液点平板 , 37 ?保温 6 h 后 ,测量纤溶酶在 的范围是 pH6. 4,8. 4。 平板上形成的溶圈直径 。 2 结果与分析 2. 1 酶促反应的最适温度 由图 1 可知里氏木霉重组 t - PA 的最适作用温 度为 37 ?,在 28 ?,37 ?范围内 ,随温度的升高 ,酶 反应速度变化是逐渐升高 ; 高于 45 ?, 酶催化速度 急剧下降 ,有可能是高温下引起酶蛋白变性而产生 的现象 。 2. 2 t - PA 的热稳定性 图 2 可 知 , 该 酶 在 30 , 37 ?比 较 稳 定 , 超 过 37 ?,随着温度的升高 ,酶活力损失加大 ; 在同一温 度下 ,随着保温时间的延长 ,酶活力损失加大 。 60 ? 以上保温 2. 0 h以后 ,纯酶完全失活 ,说明该酶对高 温较为敏感 。 2. 5 金属离子对酶活的影响 2 + 3 + 由图 5可知 , 除 Zn、Fe离子 外 其余 各种 金 + + 属离子对酶有不同程度的激活作用 ,而且 K、N a 、2 + M n离 子 浓 度 越 大 , 激 活 作 用 越 强 , 其 激 活 程 度 2 + + + 2 + 2 + 2 + 2 + M nK > > N a , 而 Cu、 Fe、Ca、M g、3 + Fe离 子 浓 度 越 小 , 激 活 作 用 越 强 , 其 激 活 程 度 2 + 2 + 2 + 2 + 3 + Ca> M g> FeCu > > Fe,当离子浓度达 - 12 + 3 + 到 5 mmo l?L 时 , Fe、Fe离子能完全抑制酶的 - 1活性 ,而当浓度达到 5 mmo l?L 时 ,离子强度达到 最大 ,当离子浓度再增加时就减小到零 ;随作用时间 2 + 2 + 2 + 2 + 的增长 , M g、Ca、Cu、Fe的激活作用减弱 ,而2 + + + M n、N a 、K的激活作用增强 。 外其余各种金属离子对酶有不同程度的激活作用 。 参考文献 [ 1 ] 李建武 ,萧能赓 , 余瑞元 , 等 . 生物化学实验原理和方 法 . [M ]北京 :北京大学出版社 , 1994 , 402 刘士辉 ,徐秀英 ,陈琳 ,等 . Zt - PA 突变体的构建 、表达 [ 2 ] ( ) 及生物学特性分析 . [ J ]生物技术通 讯 , 1994, 5 1 : 46. 刘士辉 ,朱恒奇 ,徐秀英等 . SD S - 聚丙烯酰胺凝胶电 [ 3 ] 泳纤维蛋白自显影法检测 不同分子量的纤溶酶原激 ( ) 活剂 . [ J ]中 国 应 用 生 理 学 杂 志 , 1994, 10 4 : 367 , 369 ( )图 5 金属离子对纤溶酶活性的影响 18 h Bo s R. O ne - step p u rifica tion of tissue - typ e p la s m ino2 [ 4 ] gen ac tiva to r u sing affin ity ch rom a tograp hy w ith a sp ec ia l 3 结论 monoc lona l an tibody unde r m ild cond ition s. B ioch im B io2 t - PA 纯 酶 的最 适作 用 温度 为 里氏木霉重组( ) p hy A c ta, 1992 , 1117 2 : 188,192 奚国良等 . 适用蛋白质化学技术 . [M ]上海 : 科学技术 37 ?;该酶 60 ?完全失活 , 说明该酶对高温较为敏 出版社 , 1982: 54,55 感 ;里氏木霉重组 t - PA 的最适作用 pH 是 7. 6 ,该 [ 5 ] 酶稳定的 pH 范围是 6. 4 ,7. 6 ,在该范围内 ,作用 Study on Properties of T richode rm a reese i - Reorgan iz ing t - PA SHAO J in - hua, M EN G Fan - ling, J IAN G Q iong - feng, GAN G J ie ( )H unan U n iversity of S cience and Eng ineering, Yongzhou 425100 , C h ina A b stra c t: The p rop e rtie s of T richoderma reesei - reo rgan izing t - PA we re stud ied w ith sp ec trop ho tom e te r. The re su lts showed tha t th is enzym e wa s mo re sen sitive a t h igh temp e ra tu re, and comp le te ly inac tiva ted a t 60 ?. R eac2 2 + 3 + tion tim e had little influence on enzym e ac tivity a t the range of pH from 6. 4 to 7. 6 , Znand Fehad inh ib ito ry 2 + 2 + 2 + 2 + 2 + a + + effec t on the ac tivity, and M g, Ca, Cu, Fe, M n, Nand Kcou ld ac tiva te the enzym e. Key word s: T richoderma reesei; t - PA; p rop e rty