3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法

3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法 3H胸腺嘧啶核苷(3Hthymidine,3HTdR)掺入试验，是体外淋巴细胞转化试验较客观、重复性好、结果准确的方法之一。 (一) 原理当淋巴细胞受分裂原(PHA等)或特异性抗原刺激发生转化时，必然伴有DNA的大量合成，若将具有放射性的3HTdR加到培养液内，则可被作为合成DNA的原料而摄入转化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量(以脉冲数表示)，就能客观地反映淋巴细胞对刺激物的应答水平。 3HTdR掺入法最初是利用分离纯的淋巴细胞进行试验，近年来逐渐推广采用微量全血法，该法具有采样少，操作简便，并能较正确地反映整个机体免疫状态等优点。 (二) 器材 国产FJ353型或YSJ76型液体闪烁计数器，恒温箱，水浴箱，离心机，培养瓶(10ml链霉素瓶)，其他常用器材。 (三) 试剂 1 培养基RPMI1640或TC199培养液。 2 小牛血清50? 30min灭活后使用。 3 PHA同形态学方法。 4 3HTdR最好选用比活性为2,10mci/mg分子的制品，将1mci/ml溶液用生理盐水稀释为100μci/ml，于4?冰箱保存，临用时，再用培养液稀释成10μci/ml溶液。 5 3%冰醋酸。 6 浓甲酸。 7 30%HO。 22 8 闪烁液PPO(2,5二苯基口恶唑)5g，P OPOP〔1,4双(5苯基口恶唑基2苯)〕 03g，无水乙醇200ml，甲苯800ml。 (四) 方法及结果 1 培养液按1%体积加青、链霉素溶液(含青霉素1万u/ml、链霉素001g/ml)及肝素液(含肝素125u/ml)。用35%碳酸氢钠溶液调整pH值为72,74，然后加灭活小牛血清使浓度为20%。再加所需要的PHA，无菌分装于培养瓶内，每瓶1ml。 2 无菌取静脉血05,15ml，按每毫升血加入肝素125u抗凝，进行白细胞计数及分类。 ,3 将肝素抗凝血液样品注入含1ml培养液的培养瓶内，每瓶01ml，每份样品23管，37?培养72h。在培养结束前16,24h，每瓶加入3HTdR 1μci。 4 培养结束后，将培养物移到离心管内，用3%冰醋酸6ml分两次冲洗培养瓶，并将冲洗液也放入离心管内，2000 r/min离心10min，如此反复两次。 5 最后在沉淀中加30% H2O2 1滴，85?水浴加温15min，待溶液呈无色，再加浓甲酸0.5ml后，继续加热30min，使沉淀物完全消化溶解。 6 将消化溶解的液体移于测样杯内，用红外线灯或80?热空气烘烤至液体体积少于01ml，加闪烁液5ml，用液体闪烁计数器测定每分钟脉冲数(cpm)。 7 取各管测定读数的平均值，即为01ml全血检测的脉冲数。再按血样淋巴细胞计数结果，校正成每百万淋巴细胞的脉冲数(cpm/106淋巴细胞)。 亦可用刺激指数(SI)表示试验结果。为此，须在培养时设同样数量的不加PHA的对照管，试验管脉冲数之比即为刺激指数。SI=加PHA管cpm不加PHA管cpm (五) 注意事项 1 培养基TC199或RPMI1640培养基都能得到良好结果，Eagle MEM亦较常用，其他许多种组织培养基，包括05%水解乳蛋白、Hanks液也都可用于实验，但做实验动物淋转试验时，特别是检测小鼠淋巴细胞转化率时，则以RPMI1640培养基效果最好，Eagle MEM亦可，TC199则不成功。 2 其他培养条件血样与培养基比例在1?10至1?30之间。培养容器国外多用螺纹口盖的培养管或微型培养板，置5%CO2气体环境中培养。国内采用10ml容量的链霉素瓶，塞上胶塞放普通气体环境中培养，有时发现同一样品在不同管培养物上所得的结果差别较大，其原因可能是各管胶塞松紧不一，造成管内、外气体交流情况不同所致。 3 闪烁样品制备有关问题培养后制备闪烁测定样品的方法大体有均相法(或称溶解法)和滤膜法两类。 (1) 均相法:是使培养物经过红细胞溶解，洗脱未被摄入的放射性物，沉淀大分子物质，并使之消化溶解，便于均匀分布在闪烁液中。上述方法即为均相法的一种。不同实验室的具体操作法和应用的试剂常有不同，溶解红细胞多用1%,3%醋酸，但也有使用蒸馏水。许多实验室多用5,10%三氯醋酸(TCA)沉淀大分子物质，使洗液不致流失，消化溶解，最后沉淀物多采用强酸和氢氧化钠。 (2) 滤膜法:均相法处理样品须反复多次离心沉淀，操作繁琐，耗费时间，因此有逐渐被滤膜法取代的趋势。 滤膜有玻璃纤维和微孔滤膜两种，直径2,25cm，孔径03,045μm。处理方法是先使培养物的红细胞溶解(加3%醋酸或蒸馏水)，移于滤膜上减压抽滤，再依次使约10ml生理盐水、5,10ml的5%,10%三氯醋酸溶液、3,5ml无水乙醇通过滤膜，最后将滤膜移于测样杯内，加5ml闪烁液测定。 (3) 闪烁液:30%三联苯甲苯溶液或4%,5%PPO甲苯溶液均可使用。如添加0.1%,0.4%FOPOP可提高测定效率。闪烁溶剂中加入一定比例的醇类(如无水乙醇)，则可容纳处理后样品中可能残留的水分，但闪烁液的溶水量仍然很低，故须将样品 烘干或接近干燥后再加闪烁液，否则将发生混浊而无法测定。若闪烁液内含1/3体积的异辛基苯氧聚乙氧乙醇( TritonX100)，其容水量可达15%，消化溶解后的样品不必烤干，即可添加闪烁液测定。 (4) 对照问题:由于绝大多数样品的对照(即不加PHA培养后的检测结果)，其cpm与本底比较接近，不同样品之间的少许差别也不易确定其意义，故依据刺激指数以表示转化水平(刺激指数一般在100左右)，不如直接用cpm的绝对值表示更明确可靠，因此，可以省略对照，而用样品单位体积(以上为01ml全血)cpm/106淋巴细胞表示结果。 实验动物，特别是小鼠的淋转试验结果，通常须用刺激指数表示，但因为在正常动物不同个体之间，不论是加PHA培养管或不加PHA培养的对照管，cpm差别较大，有时可达10倍左右，试验时必须设相同数量的对照培养管，测定后计算刺激指数，才能比较正确地反映机体的免疫应答水平。