阳离子反胶团体系提取蛋白质

阳离子反胶团体系提取蛋白质 ( ) 自 然 科 学 版 华 侨 大 学 学 报 第 19 卷 第 3 期V o l. 19 N o. 3 1998 年 7 月 (). 1998Jo u rna l o f H uaq iao U n ive r sity N a tu ra l Sc ience J u l Ξ 阳离子反胶团体系提取蛋白质 陈少欣林文銮 ( ) 华侨大学化工与生化工程系, 泉州 362011 () ƒ正戊醇2正辛烷分别对 4 种蛋白质进行反胶团提取的试验和 用阳离子反胶团体系 摘要C TA B 考察, 确定 值、离子强度、面活性剂浓度和助溶剂等影响提取的主要因素. 实验结果表明, 反 pH 胶团的提取过程与蛋白质本身的性质和反胶团体系有关, 且静电作用在提取中起主要作用; 利用 阳离子体系提取蛋白质时, 为了获得高的萃取率, 应控制低盐深度和高的 值.- pH p I 关键词 反胶团, 萃取, 蛋白质 分类号 510. 3Q 反胶团是溶解在有机溶剂中的表面活性剂, 其自发形成的纳米级的一种聚体. 表面活性剂 的极性尾在外与非极性的有机溶剂接触, 而极性头则排列在内形成一个极性核, 此极性核具有 溶解极性物质的能力. 极性核溶入水后就形成了“水池”, 当含反胶团的有机溶剂与含蛋白质的 水溶液相混合时, 蛋白质就溶于反胶团的“水池”中. 由于水和表面活性剂在蛋白质表面形成一 层“水壳”, 使蛋白质避免与有机溶剂直接接触而得到有效的保护. 反胶团内的环境近于细胞内〔1, 2〕 环境, 蛋白质不易变性, 便于分离和纯化. 本文利用阳离子表面活性剂在辛烷中构成了反胶 团溶液, 研究各种因素对蛋白质萃取过程的影响. 1 材料与 1. 1 材料 ) () ((十六烷基三甲基溴化铵, 分析纯; 辛烷 分析纯; 脂肪酶 = 9. 4, 无锡酶制剂厂 C TA B p I ) () ( () ) 生产; 中性蛋白酶 = 7. 0; 牛血清白蛋白, = 4. 9; 淀粉酶 = 5. 0, 试剂均为分 p IB SA p Ip I 析纯或化学纯. 1. 2 仪器 224 型回转振荡器, 离心机, 微水测定仪.H Z 1. 3 方法 () () 1反胶团溶液的配制. 取 溶解于辛烷?助溶剂为 4?1 的混合液剂中, 构 ƒC TA B V V - 1成透明澄清的反胶团溶液, 浓度为 30 ?. m o lL - 1 () 2萃取实验. 取相同体积的有机相和水相, 置于三角瓶中, 在 250 次?的振荡机上 m in - 1 往复混合 10 . 取出后, 以 350 ?的速度离心 15 , 用移液管小心将两相分开, 对 m inrm in m in () () 两相分别测定蛋白质的萃取率 E 和含水量 W 0 等有关参数: 萃入有机相中的蛋白质质量胶团中水的含量 W = E = ,0 . 初始水相中的蛋白质质量表面活性剂的含量 〔3〕() 3 蛋白质含量的测定. 水相中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝 G 2250 染色分析, 然 后通过物料衡算计算出有机相蛋白质含量. 2 试验内容与结果 2. 1 水相 值的影响pH 水相 值的影响主要表现在改变蛋白质的表面电荷, 因而对萃取率有明显的影响, 如图pH 1 所示. 从图 1 可看出, 不同蛋白质的最适宜萃取 值是不同的, 因此可利用这个特点把蛋白 pH 质分开. 2. 2 离子强度的影响 () () 水相 浓度 对蛋白质萃取率 的影响, 如图 2 所示. 从图 2 可看出, 浓度在KC l C KC lE KC l - 1 0. 05, 0. 10 ?较为适宜, 实验中水相值为 12. 随着 浓度的增加, 蛋白质的萃取 m o lL pH KC l 率迅速降低, 这意味着通过调节离子强度可选择最佳的萃取和反萃取率. 图 1 水相 值对萃取率的影响 图 2 水相 浓度对萃取率的影响 pH KC l 1. B SA ; 1. B SA ; 2. 脂肪酶; 3. 淀粉酶; 4. 蛋白酶2. 脂肪酶; 3. 淀粉酶; 4. 蛋白酶 2. 3 表面活性剂的影响- 1 () 实验结果见图 3 所示, 选择表面活性剂 的量 在 30. 0, 40. 0 ?之间 C TA B C CTAB m o lL 为宜. 增加 的量有利于蛋白质的萃取, 但 达到一定量后, 萃取率几乎不变, 这是 C TA B C TA B - 1 因为存在临界表面活性剂浓度. 实验选择 量为 30. 0 ?左右.C TA B m o lL 2. 4 不同的助溶剂的影响 根据堆砌几何理论模型, 必需加入助溶剂才能形成反胶团. 从图 4 看出, 助溶剂种 C TA B 类对萃取的影响不明显. 但考虑到助溶剂的水溶性和实验的可操作性, 本实验采用正戊醇为助 溶剂. 2. 5 微水对萃取的影响 - 1 实验结果见图 5 所示, 其中水相 值为 12. 0, 浓度为 0. 10 ?. 从图 5 可看pH KC l m o lL () 出, 萃取率与微水含量 呈同步变化, 微水含量大, 萃取率高. W 0 3 助溶剂对萃取率的影响微水含量对萃取率的影响 对萃取率的影响 图 4图 5C TA B 1. B SA ; 2. 脂肪酶;1. B SA ; 2. 脂肪酶; 3. 淀粉酶; 4. 蛋白酶3. 淀粉酶; 4. 蛋白酶 3 萃取机理的初步探讨 3. 1 水相的 pH 〔4〕 因为萃取物系中的表面活性剂和蛋白质都是带电的分子, 可以从静电方面来考虑它们 之间的相互作用. 当 时, 蛋白质带负电 > pH p I 荷, 与带正电的阳离子表面活性剂极头产生静电 吸引. - 值越大, 则静电引力也越大, 萃取率pH p I 越高, 说明静电作用在萃取过程中起主要作用. 与 ( )实验结果相吻合 图 6. 中性蛋白酶在 反 C TA B 胶团中的萃取率低, 这种现象无法用静电作用来 解释, 说明除了静电引力在萃取中起作用外, 还有 () 其它的因素 如蛋白质的疏水性等也会对萃取率 〔5〕产生影响. 陈家镛等人在研究反胶 336 A liqu a t 团萃取 2淀粉酶和蛋白酶时, 也发现类似现象, 具Α 萃取率与 的关系 - pH p I 图 6体的机理有待于进一步的研究. ( ) 在提取过程中, 如果存在对萃取不利的因素 如高盐浓度时, 可通过调节 值使蛋白质 pH 表面所带电荷增多, 则 值增大, 借此增强静电作用力, 就可以补偿萃取率的降低. 但必 - pH p I 须注意反胶团提取酶时, 由于最佳萃取率与酶活的最适宜 值并不完全吻合, 在调节 值 pH pH 时, 应使 值在该酶的稳定范围之内. pH 3. 2 水相的离子强度 - 1 从实验结果可看出, 4 种蛋白质在 浓度为 0. 05, 0. 10 ?时萃取率较高, 但高 KC l m o lL 式中 k 为扩散双电层厚度的倒数, e 为单位静电, N a 为 A vagad ro πs 常数, Ε为介电常数, K 为 常数, 为绝对温度, 为离子强度, , 为趋于0 时的值, 为离开 为电势Bo lzm an n T I 7 7 0 x 7 x 静电表面的距离. 蛋白质解离的反离子在表面活性极性头附近 - 1 ( ) 建立了扩散双电层, 如果增加离子强度 , 则 I k 值降低, 电解质溶液的电势 也降低. 因此, 增大 7 浓度会减少带负电的蛋白质与阳离子表面之 KC l 间的静电引力, 使萃取率下降. 3. 3 含水量 在离子强度较高时, 反胶团中的含水量与 - 1ƒ2 ( ) 成正比关系 图 7, 这与文献〔6〕相符. 在离 I 子强度较低时, 反胶团内“水池”含水量大, 溶解的 图 7 离子强度与含水量的关系 蛋白也多, 因此萃取率高; 同时, 含水量大, 反胶团 的直径也大, 有利于蛋白质传递到反胶团内部. 参考文献 () 1 陆 强, 施亚钧. 反胶束提取与分离蛋白质和酶. 生物工程进展, 1992, 12 6: 12, 16 () 陆 强, 施亚钧. 反胶束提取蛋白质技术新进展. 化工进展, 1995, 1 1: 25, 29 2 . : M a r io n M B radfo rdA rap id and sen sit ive m e tho d fo r th e quan t ita io n o f m ic ro g ram quan t ite s o f p ro te in 3 2, 254. . . , 1976, 72: 248u t ilizing th e p r inc ip le o f p ro te in dye b ind ingA na lB io ch em ( ) ( ) 黄惠莉, 林文銮. 茶多酚的提取技术及抗氧化性能研究. 华侨大学学报 自然科学版, 1996, 17 4: 403,4 406 , . L o ng Q ingC h en J iayo ngE ffec t o f th e typ e o f co n so lven t o n th e ex t rac t io n p ro ce ss fo r sep a ra t io n and p u2 5 336 . r if ica t io n o f tw o enzym e s f rom bac illu s sub t ilis u sing a liqua t reve r sed m ice lle sSep a ra t io n Sc ience and () T ech no lo gy, 1995, 30 13: 2 679, 2 693 5 戚文彬. 表面活性剂与分析化学. 北京: 中国计量出版社, 1986. 437, 441 () , . . . . . , 1992, 47 1: 99, 111Go k len S E K re i G AE x t rac t io n o f enzym e by reve r se m ice lle sC h emE ngSc i 6 Pro te in Ex tra c t ion by A dop t in g Ca t ion ic Rever se M ice lle C h en Sh ao x in L in W en lu an (). . . . , . , 362011, D ep to f C h em& B io ch emE ngH uaq iao U n ivQ uanzho u A bstrac t Fo u r k ind s o f p ro te in s a re ex t rac ted re sp ec t ive ly by adop t ing ce tane t r im e th y l amm o n ia b rom ide () ƒ22. , , C TA B n am y l a lco ho lo c ty l a lco ho lA study is devo ted to th e effec t s o f pH va lueio n ic st reng th co ncen2 . , t ra t io n o f su rfac tan t and co so lven t o n th e ex t rac t io nA s show n by th e re su lt sth e ex t rac t io n by reve r se m i2 ; ce lle h a s a bea r ing o n th e p rop e r ty o f p ro te in and reve r se m ice lle sy stem e lec t ro sta t ic in te rac t io n p lay s an im 2 ; - po r tan t p a r t in th e ex t rac t io na low e r sa lt co ncen t ra t io n and a h igh e r pH p I o f ten lead to a h igh e r ex t rac2 .t io n ra te , , Keywords reve r se m ice lleex t rac t io np ro te in