【doc】大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离、培养及鉴定

【doc】大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离、培养及鉴定 大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离、培养及鉴 定 第l2卷第l期 2008年3月 生命科学研究 LifeScienceResearch Vo1.12No.1 Mar.20o8 大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离,培养及鉴定 焦玉清,易着文,何小解,刘喜红,何庆南,党西强,吴小川,莫双红 (中南大学湘雅二医院4',JL肾脏病研究室,湖南省4,JL肾脏病临床中心,中国湖南长沙410011) 摘要:分离,培养大鼠胚胎后肾问充质细胞(MMCS),取孕13d大鼠胚胎,分离胚胎肾脏,去除输尿管芽,消化 后置37qC,5%CO2,饱和湿度的培养箱中培养.饲置相差显微镜下观察培养细胞,并行HE染色,电镜观察,生 长曲线测定;ABC免疫酶染色法检测波形蛋白,角蛋白,nestin,CD133,CD34;直接免疫荧光法检测双花扁豆凝 集素(DoliehosBiflorus,DB),并流式细胞术定量检测,MMCS形态为成纤维细胞样,贴壁生长,48,72h达生长 高峰;波形蛋白,nestin,CD133表达阳性;角蛋白,CD34,DB表达阴性;MMCS以DB标记后流式细胞检测为单 峰,结果表明:培养细胞为后肾间充质细胞,纯度较高并符合干细胞特征. 关键词:后肾;间充质细胞;原代培养;大鼠 中图分类号:R.332文献标识码:A文章编号:1007.7847(20O8)0l—Do66.07 Isolation.CultivationandIdentificati0n0fMetanephric MesenchymalCellsDerivedfromEmbryonicRats JIA0Yu—qing,YIZhu—wen,HEXiao-jie,LIUXi—hong,HEQing—nan, DANGXi—qiang,WUXiao—chuan,MOShuang—hong (TheDepartmentofPediatrics,TheSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,HunanProvinceClinwdCenterof PediatricNephrology,410011,Hunan,China) Abstract:Toestablishanisolationandculturemethodformetanephricmesenchymalcells(MMCS).Rats wereanaesthetizedongestationday13andmetanephricbalstematawereseparatedfromuretericbudsby microdissection.CellsweregrowninDMEMcontaining10%fetalcalfserumat37oCina5%CO2 atmosphere.ThemorphologyofMMCSwereobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope,HEstaining, andelectronicmicroscope.Thesurfaceantigenphenotypeswereidentifiedbyimmunohistochemistry,andthe purificationwasidentifiedbyflowcytometry.Agrowthcurvetobeusedforstudyingthecharacteristicsof growing.MMCSgrewadherencelyasfibroblast— like,positiveforvimentin.nestin,andCD133.Instead,they werenegativeforkeratin,CD34andDolichosBiflorus(DB).Theflowcytometryshowedasinglepeakof MMCS.Inconclusion,theresultssuggestthattheculturedcellsareMMCS,whicharecoincidedwithstem cellsandwithhighpurity. Keys:metanephron;mesenchymalcells;primaryculture;rat (,/feScienceResearch.2008,12(1):066,072) 研究显示,胚胎后肾间充质细胞(metanephric mesenchymalcells,MMCS)具有干细胞特性.诸 多因素如wT-1,PAX一2,TGF-fl等,在MMCS的增 殖,分化过程中,发挥诱导作用[3].近年来的研究, 着重于后肾原基及输尿管芽之间相互诱导的分子 机制及基因学基础的探讨[4],而有关MMCS的体 收稿日期:2007-l1.12;修回13期:2008-01-08 基金项目:国家自然科学基金资助项目(3o672251) 作者简介:焦玉清(1969.),女,江苏徐州人,中南大学博士研究生,主要从事小儿肾脏 病研究,E-mail:njiaoyq@163.corn;易着文(1946-),男,湖 南华容人,中南大学教授,主任医师,博士生导师,通讯作者,主要从事小儿肾脏病研 究,Teh0731.5292170,E-mail: 第1期焦玉清等:大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离,培养及鉴定67 内移植尚未见报道.本实验旨在建立并改进大鼠 胚胎MMCS的原代分离,培养方法,为MMCS的 移植研究提供细胞来源及依据. 1材料及方法 1.1材料 1.1.1实验动物 250,300gSD大鼠,清洁级,由中南大学湘 雅二医院实验动物中心提供. 1.1.2主要试剂 L一15培养基,DMEM—LG培养基,优级胎牛血 清(FBS),胶原酶(美国Gibco公司),胰酶,四甲基 偶氮唑蓝(MTr),二甲亚枫(DMSO)(美国 Amresco公司),小鼠抗大鼠波形蛋白,抗角蛋白 (美国SantaCruz公司),小鼠抗大鼠nestin,抗 CD133,抗CD34(美国Chemicon公司),FITC—DB (美国Sigma公司),免疫组化染色试剂盒为武汉 博士德生物试剂公司产品. 1.2方法 1.2.1胚胎MMCS的分离,培养 1.2.1.1不同孕期的大鼠胚胎MMCS培养【] 分别选取孕12,13,14d3个时间点大鼠胚 胎(El2,El3,El4,以检栓当13为受孕0d), Olympus解剖显微镜下,分离胚胎肾,分离,清除 肾外输尿管芽,置于4?预冷的DMEM清洗备 用.37?下,予含胶原酶液(DMEM+IO%FBS+ 0.2%胶原酶+50IU/mLDNAase)孵育15min.残 存后肾组织以0.25%胰酶/O.O2%EDTA(1:1)室 温消化,肉眼观组织块几近消失后,加入含10% FBS的DMEM,1000r/min离心5min.弃上清, 加含10%FBS的DMEM重悬细胞,细胞浓度调 整至5x104/cm,置35mm培养皿中,放人37?, 含5%CO,饱和湿度的培养箱中培养.36,48h 后第一次更换培养基,以后每2,3d换液一次.细 胞培养至5,7d,以0.25%胰酶/0.02%EDTA消 化,按1:2,4传代培养.每次传代后均在相差显微 镜下进行细胞形态观察,照相.取传至第3代的 El3的MMCS,分别行HE染色,电镜观察,细胞 生长曲线的绘制及相关免疫标志物的检测. 1.2.1.2不清除输尿管芽MMCS培养 取孕14d大鼠胚胎,解剖显微镜下分离胚胎 肾,不清除输尿管芽,DMEM清洗后,如前述消化 培养. 1.2.1.3改良消化法MMCS培养 取孕14d大鼠胚胎,如前述分离胚胎肾,清 除肾外输尿管芽,DMEM清洗后,'于相差显微镜 下细针剥离肾内输尿管芽分支,残存后肾组织同 上胰酶/EDTA消化后,置培养皿中培养. 1.2.1-4改良组织块法MMCS培养 取孕14d大鼠胚胎,将后肾取出洗涤后,直 接置于35mm培养皿中,不经酶消化,相差显微 镜下用细针撕开组织,剥离可视输尿管芽,将细胞 尽量铺开,加入少量含10%FBS的DMEM后放 孵箱培养.4h后,加入常量培养基培养. 1.2.1.5几种培养方法的比较 取孕14d大鼠胚胎,分别采用以上4种不同 方法,每种方法取1只胚胎的2个后肾接种一皿, 取传2代细胞消化计数,定量比较. 1.2.2细胞形态学观察 1.2.2.1细胞HE染色 取生长良好的细胞,0.25%胰酶/0.02% EDTA消化后,以5xl04/mL细胞密度接种到放置 有高压灭菌的盖玻片的35mm培养皿中,待细胞 爬片80%后,以4%多聚甲醛固定,行HE染色. 1.2.2.2透射电镜观察 将细胞消化离心后,加入10mL4?预冷的 PBS,吹打均匀,以2000r/min离心15min,获得 细胞团块;倾斜离心管,沿管壁加入4?预冷的 2.5%戊二醛4mL,4?固定1h;以细针剥离细胞 团块,移人青霉素小瓶中,送透射电镜检测. 1.2.3细胞生长曲线的绘制 1.2.3.1细胞计数法 细胞消化后,制备单细胞悬液,细胞密度调整 至(1,2)×104/mL,以每孔0.5mL接种于24孔 板,置37?,5%CO培养箱中培养,每天各取3 孔消化计数,计算均值,连续7d,其中每48h给 细胞换液一次.以培养时间为横轴,细胞数为纵 轴,描绘生长曲线. 1.2.3.2Mrlq"法 制备单细胞悬液,细胞密度调整至(1,2)×104/ mL,接种于96孔培养板,每组接种3个复孔,每孔 体积200L将培养板置于CO培养箱,在37?, 5%CO及饱和湿度条件下,于培养的第1,7d, 分别于每孔加入Mrlq"液2O,37?继续孵育4 h后终止培养,小心吸弃孔内培养上清液.每孔加 150LDMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解; 选择测定波长490am,在酶联免疫检测仪上测定 各孔光吸收(A)值,结果.以不加细胞只加培 生命科学研究2008往 养基,作为空白对照.以培养时间为横轴,光吸收 值为纵轴,绘制生长曲线. 1.2.4细胞免疫化学分析 取传至第3代细胞,4%多聚甲醛固定.波形 蛋白,角蛋白,nestin,CD133,CD34的检测,采用 ABC免疫酶染色法,操作按免疫组织化学试剂盒 说明书完成,以PBS代替一抗作为空白对照.以 细胞出现棕黄色或黄褐色颗粒作为阳性反应. FITC—DB的检测采用直接免疫荧光染色法,FITC— DB(终浓度50mg/LC)37oC孵育0.5h,PBS洗涤 后,荧光显微镜下观察. 1.2.5细胞流式检测 分别选取3组细胞(El2的MMCS传3代细 胞,未去除肾内输尿管芽分支的El4的MMCS 传3代细胞,去除肾内输尿管芽分支的El4的 MMCS传3代细胞),消化后细胞密度调整至3一 (A) 5x106/mL,加入FITC—DB(终浓度50mg/L), 37?孵育30min,PBS洗涤2次后行流式细胞 术检测. 2结果 2.1原代培养大鼠胚胎MMCS的动态观察及形 态描述 倒置相差显微镜下,消化后的MMCS细胞小, 亮,圆,边界清晰,胞浆少,胞核大,核仁明显.传 代细胞接种4h内,即已出现贴壁,24h已大部贴 壁.细胞呈岛样,漩涡样生长.贴壁细胞初始体积 较小,呈梭形,随后伸展生长,呈星状,细胞间以突 起相互连接成细胞网,核浆比大,分界清楚,折光 性强.见图1.电镜下,细胞为长梭形或不规则形 状,表面较多微绒毛,核不规则,核仁大,数目多, 胞浆中滑面内质网发达,可见分泌颗粒.见图2. (B) 图1原代培养大鼠胚胎MMCS的形态描述 (A)倒置相差显微镜下细胞形态:细胞接种后48h,形态为梭形成纤维细胞样,有分散集落生长的特点(×100); (B)细胞HE染色:细胞伸展生长.呈成纤维细胞样(×200). Fig.1MorphologyofprimaryculturedMMCS (A)MorphologyofMMCSobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope:48hafterinocul ation,MMCSwerespindle-shalc,ed andfibroblast.1ike,growinginascatteredCOlonyway(×100); (B)MorphologyofMMCSbvHEstaining:MMCSwerespreading,fibroblast.1ike(×2O0). 图2MMCS细胞电镜观察 细胞为长梭形或不规则形状,表面较多微绒毛,核不规则, 10000). 胞浆中滑面内质网发达,可见分泌颗粒(× Fig2.MorphologyofMMCSobservedbyelectronic nncroscope MMCSwerespindle.shaped.1'henuclearwasirregular.Alot ofslipplaneendoeytoplasmiereticulumsandsecretory granuleswereincytoplasm(×10000). 2.24种培养方法的比较 改良组织块法培养的El4MMCS传2代后, 组织块可完全消化,消化后计数达4xl06,相对于 方法1培养的El4MMCS(2.8x10),改良消化法 培养的El4MMCS(2.4~106),总量有提高,与不清 ,细 除输尿管芽培养的El4MMCS(4.4xl06)比较胞总量基本相当. 2.3生长曲线绘制 见图3.结合两种方法所作的细胞生长曲线, 细胞接种后第1d,密度略有下降,经过短暂的滞 留期后,细胞进入对数生长期,增值高峰在接种后 23d,至接种后第5d,细胞基本长满,随后细胞 进入生长平台期. 第l期焦玉清等:大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离,培养及鉴定 目 : 墓 器 0l234567 培养时间,d Thetimeofinoculation,d (A) j驾 招 芒 q .竺 0 l234567 培养时间,d Thetimeofinoculation,d (B) 图3MMCS细胞生长曲线 (A)细胞计数法:细胞接种后第1d,密度略有下降,增值高峰在接种后2—3d,至接种后第5d,细胞基本长满: (B)Mr兀'法:增值高峰在接种后2—3d,至接种后第5d,细胞基本长满. Fig.3ThegrowthcurveofMMCS (A)ThegrowthofMMCSwasdeterminedbycountingthecellnumber-thedensityofMMCS decreasedslighflyatthe1stday afterinoculation,andreachedamaximumatthe2nd一3rdday.Cellsweredistributedovertl1ebaseofvesselatthe5thday: (B)ThegrowthofMMCSwasdeterminedbyMr兀'assay:afterinoculation.thedensityofMMCSreachedamaximumatthe2nd 3rddayanddistributedoverthebaseofvesselatthe5t}lday. 2.4波形蛋白,角蛋白,nestin,CD133,CD34, FITC.DB的表达与分布 波形蛋白(图4),nestin(图5),CD133(图6) 均为阳性表达,波形蛋白,nestin阳性表达产物位 图4波形蛋白阳性表达.阳性表达产物位于胞浆(x400) Fig.4Vimentinexpressionwasobservedinthe cytoplasmofMMCS(x400) 图6CD133阳性表达.阳性表达产物位于胞膜(x400) Fig.6CD133expressionwasobservedinthe cytomembraneofMMCS(x400) 2.5细胞流式检测分析 未去除肾内输尿管芽分支的El4MMCS流式 结果为双峰型,统计后输尿管芽细胞占细胞总量 于胞浆中,CD133阳性表达产物位于胞膜,部分 细胞DB(图7)表达阳性,阳性表达产物位于胞 膜,角蛋白,CD34免疫化学分析均为阴性. 图5巢蛋白阳性表达.阳性表达产物位于胞浆(x400) Fig.5Nestinexpressionw_舾observedinthecytoplasm ofMMCS(x4001 图7DB阳性表达.阳性表达产物位于胞膜(×400) Fig.7DBexpressionwasobservedinthecytomembrane ofseveralcells(x400) 的27.28%.去除肾内输尿管芽分支后,El4的 MMCS流式显示为单峰,与方法1培养的El2 MMCS一致.见图8. 765432lO OOOOOOO 加m5O —f_目一/(H×)?u窨兰J0皇2皂?IIIL 70生命科学研究2008钲 ^c庙b0nDate:l0-Sep-07Gate:G1 GatedEvents:8827TotalEvents:10000 MstkerLeft.RightEvents%Gated%TotalMean All1.99108827100.00882716756 M11.415926.715.g234.24 M242.99108219931182.1917741 I MIIM2 Acqu~itJonDate:l0-Sep-07Gate:G1 GatedEvents:8923TotaIEvents:lO000 MarkerLeft,Ri口htEvents%Gated%TotalMean AlI199108g231000089.23154.79 M11415866575663444 ?42.9910830293.0483021嬲76 量 墨 舄 差一 0磊 导 2007—9-l0.0l3 MIM2 3讨论 Marker%Gated%TotalMean A M l 1 l10 0 0. 08 00660..052716 3B 13. 06 17 M299g26&16143B 2007—9一l7.022 1 .J l0ol0'l021(2l0~ (B) 图8FITC.DB标记后流式细胞术检测 (A)El2MMCS与去除肾内输尿管芽分支后的El4MMCS流式检测,结果为单峰形; (B)未去除肾内输尿管芽分支的E14MMCS流式检测,结果为双峰型. Fig.8Thepurityof?瞰CSwasidentifiedbyflowcytometry (A)Determinedbyflowcytometry.E12MMCSandE14MMCSwithuretericbudremovedw erepurified; (B)Determinedbyflowcytometry,E14MMCSwithouturetericbudremovedwereimpurity. 在胚胎发育过程中,肾有3个相互连续,略为 重叠的发育阶段,即前肾,中肾及后肾.它们均来 源于间介中胚层,前肾和中肾是暂时的器官,在 胚胎时期即相继退化,后肾则高度发育,成为生 后永久的泌尿器官.后肾的发生有两个来源:输 尿管芽和后肾原基,二者相互作用,相互诱导,最 终形成后肾.输尿管芽是输尿管,肾盂,肾盏和集 合小管的原基,而后肾原基则形成肾单位疆].目前 认为,后肾原基间充质细胞(MMCS)具有干细胞 (A) 特性,这使得以MMCS为基础的治疗研究有了理 论基础.50多年来,有关后肾的探索一直没有停 歇[9,tO],近年来,国内亦开始涉足这一领域[11-13]. MMCS的分离,培养一般选择E13,14d的胚 胎,因为在这一时期,输尿管芽开始出现最初的分 支].一般情况下,1只孕鼠有13个左右的胚胎, 实验中我们发现,孕鼠的体重,孕次及胎数对胚胎 输尿管芽的发育有明显的影响.以El4的胚胎后 肾为例,体重较重,非初孕鼠,胎数少的孕鼠,其胚 胎输尿管芽的发育明显加快(见图9). (B) 图9倒置相差显微镜下E14后肾形态 (A)有3个胚胎,体重32Og的母鼠(去除子宫胚胎后称重)的El4后肾(×10o); (B)有12个胚胎,体重273g的母鼠(去除子宫胚胎后称重)的E14后肾(X100). Fig.9MorphologyofEl4metanephronobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope (A)E14metanephronseparatedfrompregnantratwhichweights320gandhas3embryoes(X 100); (B)E14metanephronseparatedfrompregnantratwhichweights273gandhas12embryoes( X100) MMCS的分离培养,较常引用的为Herzlinger 所介绍的方法l5].实验中我们发现,细胞的产量不 甚稳定,为探求原因及更便捷的细胞培养方法,我 们选取了El2,El3,El43个不同的时间点细胞 培养,并以El4为基础,对几种不同培养方法进 行比较. 809—0乙10?导0 卫=:0u 第l期焦玉清等:大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离,培养及鉴定7l 相差显微镜下可看到,后肾组织极其疏松,组 织几成膜状,根据这一特性,我们参考文献[7]方 法并加以改进,不经酶消化直接培养,数据显示此 法能得到很好的培养结果.比较4种方法细胞定 量之间的差异,我们认为可能在以下一些环节上, 存在主要影响因素:1)分离胚胎肾,分离并清除 肾外输尿管芽对细胞获取量的影响:后肾组织极 其疏松,分离夹取的过程中,不可避免地造成后肾 组织的破损,分离,清除肾外输尿管芽需要外力的 牵拉,拖拽,更进一步加重了组织的损伤,在随后 的清洗中,细胞移出,丢失,导致产量降低.由细 胞计数可看到,这一点在El4的MMCS的培养 中,起到关键作用;2)酶消化的影响:胶原酶对 细胞的影响相对较小,但消化能力较弱,实验中发 现,延长胶原酶的消化时间,将使细胞贴壁率降 低.而胰酶消化过度,将导致细胞死亡率增加.为 此我们舍弃了胶原酶消化过程,仅予胰酶/EDTA 常温下消化组织,肉眼观组织几近消失时即终止 反应.比较细胞计数结果,此种情况下消化酶对 细胞培养的影响甚小;3)肾内输尿管芽剥离过 程中,细胞的丢失:其原因主要在于输尿管芽分支 周围所附带的后肾组织的丢失,而且分支愈多,丢 失量愈大;4)组织来源情况:相对于El4,El2的 后肾体积小,取材,分离的难度均明显加大,细胞 获取量减少. 除细胞产量外,MMCS的分离培养还存在细 胞纯化的问题.实验中发现,大部分的El3以及 所有的El4后肾,均已出现明显输尿管芽分支, 为验证培养的MMCS的纯度,我们利用FITC—DB 进行细胞免疫化学及流式细胞检测.DB又称双 花扁豆凝集素,是凝集素的一种,由于能够特异 地与输尿管芽细胞膜上特定的糖基结合,故常用 于对MMCS的纯度进行鉴定].实验显示部分细 胞免疫荧光反应阳性,提示培养细胞中含输尿管 芽细胞.为进一步对输尿管芽细胞定量,我们选 取了流式细胞术检测.由结果可看到,剔除肾内 输尿管芽分支的培养细胞纯度较高,流式结果显 示为单峰,而未清除肾内输尿管芽的El4培养细 胞中,输尿管芽细胞占了接近1,3的比例,结合 胚胎图片,提示胎龄愈大清除后肾输尿管芽的工 作量愈大. 以上细胞培养法,可看到采用改良组织 块培养法,可以得到纯度及含量均较高的MMCS, 实际操作中可根据胚胎的具体情况,选用不同的 分离消化方法.另外,在MMCS的培养中不管采 用何种方法,均需要动作轻柔,尤其是在去除输尿 管芽及组织夹取的步骤中. 形态学上,MMCS为成纤维细胞样,呈岛样, 漩涡样贴壁生长,MMCS传代接种4h内出现贴 壁,24h内已大部贴壁,增殖高峰在传代后48,72 h,显示细胞有良好的适应及增殖活力. 波形蛋白,角蛋白的表达常用于MMCS的初 步鉴定[15,16].波形蛋白,角蛋白均属于中间丝蛋白, 分别特异地分布于间充质细胞及上皮细胞来源的 细胞.免疫化学检测显示,培养细胞波形蛋白阳 性,角蛋白阴性,提示符合间充质细胞的特征. 为进一步验证MMCS的干细胞特性,我们选 取了nestin(巢蛋白)和CD133两个指标.nestin 最早被认为是神经干细胞的表面标记,但随后的 研究发现,nestin阳性细胞也见于非神经组织的 祖细胞,包括肌肉,心脏,胰腺等.nestin阳性细胞 在成体组织中也有报道,但主要局限于再生区域. 由于以上特点,一般认为,nestin是干细胞或祖细 胞的标志[17].近年的研究更显示,nestin在肾小球 内皮祖细胞及MMCS中亦均有表达,小鼠ne~in 的免疫活力最早可在E11.5的肾脏即可检测到, 而在El5.5明显减少?引.' CD133是另一引起广泛关注的指标.最初发 现CD133阳性抗原选择性表达在人胎肝,骨髓, 脐血及外周血CD34的造血细胞中,随着研究进 展,人们在一些CD34一的干细胞表面也发现有 CD133抗原表达.目前该抗原已被认为是一个崭 新的,极有研究和应用价值的干细胞表面标志. 已经证实,CD133在人及大鼠的胚胎肾脏中亦均 有表达[引. 在我们培养的MMCS中,nestin及CD133的 检测,均支持MMCS具有干细胞的特征,电镜显 示细胞不规则,核仁大,数目多,胞质结构简单,亦 提示细胞处于较原始的状态[2O]. CD34被认为是造血干/祖细胞及内皮细胞的 阳性标记,为排除此类细胞的影响,我们进一步做 了CD34的检测.结果显示为阴性. 参考文献(References): 【1]OLIVERJA,BARASCHJ,YANGJ,eto1.Metanephric mesenchymecontainsembryonicrenalstemcells[J].AmJ PhysiolRenalPhysiol,2002,283(4):799?809. 【2]QIAOJ,COHEND,HERZHNGERD.Themetanephric blastemadifferentiatesintocollectingsystemandnephron 72生命科学研究20o8年 epitheliainvitro[J].Development.1995.121(10):3207—3214. 『313DAVIESJA,PERERAAD,WALLl(ERCL_Mechanismsof epithelialdevelopmentandneoplasiainthemetanephrie kidney[J].IntJDevBiol.1999,43:473_478. [41YANGJ,BLUMA,NOVAKT,et.Anepithelialprecursoris regulatedbytheuretericbudandbytherenalstrema叨. 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