山羊大腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精

山羊大腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精 山羊大腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外 受精 ' 矗 第2l卷第1期 1998年1月 河北农业大学 7oumalofA~icuhur'alUniversityofHebe~ Vo1.2lNo.1 Jan.1998 山羊大腔卵泡卵母细胞的 体外成熟和体外受精. }护 型耋塑:一李裕强芮荣李勇 一(西北农业大学发育生物学研究室,杨陵712100) 摘要从屠宰场采集卵巢.抽吸洁回收2,6mrn大腔卵泡卵母细胞.随机抽样后,测量其直 径为167.42?17.43pm.A,B缎卵泡卵母细胞进行体外成熟培养,其成熟率为67.50%.山 羊新鲜精液以t30痕或?一H液处理后,与体外成熟卵母细胞进行授精,受精率分别为 56.61%(17eO)和63.33%(19eO),两组问差异不显着(P>o.0.5).13o乖MD—H液均适宜 于山羊精子获能处理.体外受精卵的2细胞胚发育率为16.67%(6e6),4细胞胚发育率为 2.78%(1舶). 美麓词 .壁!噬;里塑丝;堡塑盟羞;塑璺基 中圈分类号$827.36.-9814.6 超数排卵和胚胎移植的台理化应用,虽能成倍提高优良母畜的繁殖率,但所获胚胎数量 极为有限.体外受精技术的采用可有效地开辟胚胎来源的新途径,为胚胎工程领域的其他 技术提供条件.1984年Kim首次选用mKRB液培养山羊卵泡卵母细胞,成熟率为 55.5%LH.郝志明等体外培养奶山羊卵巢卵母细胞,获得56.7%的成熟率_2J.刘灵等选用 TCMl99和Ham's2培养山羊卵巢卵母细胞,体外成熟率为79.4%(104/1_31)和76.3% (58/76)J.本试验旨在建立较为理想的山羊大腔卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的方 法和条件,为山羊小腔卵泡卵母细胞的体外受精研究奠定基础. l材料和方法 1.l卵巢来源与处理 卵巢采自西安清真屠宰场和杨陵屠宰场.关中奶山羊屠宰剖腹后,立即无菌采集卵巢, 除去大型卵泡(直径大于6mm)和多余脂肪组织,灭菌滤纸擦干后,迅速置于无菌生理盐水 (内含200IU/mL青霉素钠和200t~/mL硫酸链霉素)中保存,在l-6h内运回实验室备用. 手术摘取的卵巢,置于37?生理盐水中,随即使用. 1.2大腔卵泡(直径2~.6ram)卵母细胞的采集 用38?灭菌生理盐水充分冲洗卵巢,用带有l2#针头的5mL注射器及少量PBS液抽 吸大卵泡.抽吸物于检卵杯中静置5min后,在实体显微镜下,挑选A,B级卵丘卵母细胞复 合体.(A级:在卵母细胞周围,存在有数层致密卵丘细胞,卵母细胞胞质均匀;B级: 卵母细 胞周围的卵丘细胞层数相对A级较少,或卵丘细胞部分包围卵母细胞,卵母细胞胞质均匀; ? 农业部生物技术项目,井得到国家白掩科学基金责助 张涌男.39岁.教授,博士生导师,从事哺乳生转胚胎工程领域科研工作 1997—03,11收璃19卯一O6—06收修改稿 河北农业大学第21卷 c级:卵母细胞完全裸露且胞质不均匀者.) 1.3卵母细胞直径的测量 随机取抽吸法得到的卵丘卵母细胞复合体,测其卵母细胞直径,记录测量结果.致密卵 丘卵母细胞复合体则用150IU/mL透明质酸酶处理1~2min. 1.4卵母细胞的体外成熟 将A,B级卵丘卵母细胞复合体用成熟培养液洗涤3次后培养,培养条件为5%0, 38.512.饱和湿度.培养结束后,以第1极体排出作为卵母细胞成熟的判断标准. 1.5颗粒细胞制备 从直径2N6mm卵泡中吸取颗粒细胞(卵丘细胞),用PBS离心洗涤(1500r/10min)2 次 后,用TCM199洗涤1次,诵其密度至1,10×1个/mL 1.6精子处理获能 1.6.1采精用假阴道法采集公羊精液.吸取原精液少许,用生理盐水稀释后镜检,活力 太于0.5时方可用于受精. 1.6.2精子洗涤向原精液加人BO液(或MD—H液)离心(1500r/10mln),洗涤3次后, 将精子置于获能液中,于38.5?,5%c.2,饱和湿度条件下,孵育1-2h. 1.6.3精子计数与稀释吸取10t~L获能精子,适当稀释后,用血细胞计数板计数.根据 计数结果,调整精子密度至1,10×lo6个/mL备用. 1.7体外受精与受精卵发育 将体外成熟的卵母细胞移人获能精子培养液中,共同培养17h.受精卵移人含15%灭 活NCs的1?M199中培养.以抛出第2极体判断受精与否. I.8数据处理 采用卡方检验和t检验对试验数据进行统计学处理. 2结果 2.1季节对卵泡卵母细胞回收率的影响 在山羊非繁殖季节和繁殖季节各采集卵巢24个和17个,使用抽吸法回收卵母细胞,平 均每只羊可得可用卵母细胞分别为3.29?4.07枚和5.71?2.52枚,两者间差异不显着(P >0.05).季节对卵母细胞回收率的影响不大. 2.2季节对卵母细胞成熟率的影响 选繁殖季节和非繁殖季节采集的A,B级卵泡卵母细胞进行体外成熟.结果见表1. 襄1季节对卵母棚胞成熟率的髟响 .Tab.1EffectofSeasonsonGoatO.ceIVM B:b.P<0.0l 由表l可以看出,繁殖季节采集的卵泡卵母细胞成熟率极显着地高于非繁殖季节的卵 泡卵母细胞成熟率(P<O.01). 第1期张涌等:山羊大腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精47 2.3保存温度对卵母细胞成熟率的影响 采集的卵巢分别在25-29"C,35,38?灭菌生理盐水中保存.在相应实验室室温条件 下,回收卵母细胞.成熟体系为TCM199+20mMHepes+15%GS+1--10×106+/mL颗 粒细胞+10~/mLFsH+10~ag/mLLh+lvg/mL17~一.卵母细胞成熟情况见表2.温度 对卵母细胞成熟率的影响不显着(P>0.05). 裹2保存温度对卵母耋田胞成熟率的影响 Tab.2InfluenceofTenkoeratureonGoatOocyteIVM c:d,p>O.05 2.4血精类型和激素对卵母细胞成熟率的影响 可培养用的卵母细胞复合体分别于培养液(1),(2),(3)中培养,结果见表3.其中 舔加GS和NCS组同结果差异不显着(P>0.05),激素舔加组与对照组间的结果差异也不 显着(P>0.05). 裹3血清类型,激素对卵母细胞体外成熟的影响 Tab3EffectofSeramadl-kalmc*msoilGoatOccyteMaturationinVitro 本试验在观察各种因素对卵母细胞体外成熟影响的同时,随机抽样测量了卵母细胞的 直径,结果为167.42?17.43tan. 2.5成熟卵母细胞体外受精情况 将体外成熟的卵母细胞进行体外受精,其受精率为60.6%(36枷),受精卵的2细胞胚 发育率为16.6796(6/36),4细胞胚发育率为2.78%(1/36).此外,本试验结果表明,用B0 液体系或MD-H液进行精子洗涤和精子获能处理,对受精率不发生显着作用(P>0.05), 结果如表4所示. 寰4不丽获能液对受辅率的影响 Tab.4Effect~tationMediaontheFerfilimtodRate 3讨论 卵母细胞的采集是进行其体外成熟的前提.一般认为,采卵数目除与采卵方法有关外 ??;, 48河北农业大学第21卷 还与繁殖状态有关.本试验对比了山羊繁殖季节和非繁殖季节的卵母细胞回收率.结果显 示,季节对卵母细胞回收率无显着影响.处于非繁殖季节的山羊卵巢有类似于繁殖季节的 卵泡动力学变化…4.关于不同季节卵巢卵泡动力学变化有待于进一步研究.对比不同季 节的卵母细胞体外成熟的试验结果发现,采自繁殖季节的卵母细胞成熟率极显着地高于非 繁殖季节的卵母细胞的成熟率(p>0.01).季节对卵母细胞体外成熟率有显着的影响作用. 研究证实,促性腺激素和雌激素对卵母细胞成熟具有促进作用..在卵泡卵母细胞 的成熟培养体系中,添加10~g/mLFSH,LH1/Lg/mL17[3一组与不添加激素组相比,差异 虽不显着(P>0.05),但提高了12.25%(57.19%:54.84%).本试验还对比研究了发情山 羊血清和新生牛血清对卵母细胞成熟率的影响.山羊血清采自发情开始后的第1,2天的山 羊,其内含有一定量的内源性激素,又属同种动物血清,GS血清添加组试验结果略高于 NCS添加组(67.19%:61.54%). 卵母细胞体外成熟实验所用卵巢绝大多数来源于屠宰场,而实验室与屠宰场间有一定 距离存在,相应引发了卵巢运输方法,保存条件及温度和时问等问题在牛体外受精技术 中,大部分报道认为,应在屠宰后3h内将卵巢运回实验室,也有人将此时间延长至6h.山 羊卵泡卵母细胞对运送时间及温度等刺激比牛更敏感.本试验分别设两种温区做对比,35 , 38?试验组的实验结果明显好于25--29?组(66.04%:51.31%),两组间差异不显着(P >0.05).有待进一步研究. Younis等(1991年)和Smedt等(1992年)分别使用BO液和MD,H液进行山羊鲜精 的获能处理,获较高的体外受精率(56.7%和57%)【,.本试验比较]30液和MD—H液对 成熟卵泡卵母细胞的体外受精结果,认为BO液和MD—H液均适用于山羊的精子获能处 理. 将60枚体外成熟卵母细胞与经获能处理的精子悬液共同培养17h后,移人体外培养液 TCM199和15%GS液中继续培养,受精率为6o.0%,2细胞胚发育率为16.67%(6/36),4 细胞胚的发育率为2.78%(1/36). 参考文献 1KimCl,ImmH,NiwaK,eta1Maturationdivisionofgoatfol[icular删目culturedinvitro.KoreanJ AnimSeJ,1984,26(5):433--439 2HaoZM,QianJF,WangJC.Invitromaturation.ffo[[icular目fromthemouseanddairygoat.Theft— ogenolngy,1990,1:364 3刘灵,张涌,钱菊汾.山羊卵巢卵母细胞的体外成熟.西北农业太学,1992,Z0(1):l07,l10 4NodB,BisterJLandPaquayR.OvarianfolliculardynamicsinNfffulkOrineatdifferentperi odsoftheyear. J.ReprodFert.1993,99:695--700 ,张锁链,薛晓先等.屠宰母牛卵巢卵母细胞体外受精与发育的研究畜牧兽5旭日干 医,1989,20 (3):l93,198 6旭日干,张锁链,薛晓先等绵羊悻外成熟,体外受精卵的悻外发育及移植后的产羔. 内蒙古太学 (自然科学版),1989,20(4):560--569 7YutakaF,KeiI,NoelF,eta1.Follidecultureenhancesfertilizabilltyandcleavage0fhi? eoccytesma— tinvitroJAnimsd,1987,64:935,941 8YotmisAL,ZuelkeKA,HarpefKMa1.Invitrofertilizationdgoatoot2yt~.NolRwrod,1991,44: ' 第1期张涌等:山羊大腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精49 1177,1182 9SnedtVD,Croze*NMAhmed— AllMeta1.InvitmmaturationandfertilizationofgoatOOC~STheft— ogenology,1992,37:10491060 (编辑:澹台炳琰) InVitroMaturationandinVitroFertilization ofGoatLargeAntralFollicularOocytes ZhangYongLiuSujuanLiYuqiangRuiRongLiYong (LabratoryofDevelopmentBiology,NorthwesternAgriculturalUniversity,YangLing712100) Ahstr'a~tGoatovariesusedinourresearchW&Scollectedfromslaughterhouse.Ovawereasp1. rateelfromthefollidesof2,6ram(indiameter)anditsdiameterweremeasured,andthere. sukWas167.42士17.43pxn.SelectingoocytesofgradeAandBforIVM,thematurationrate Was67.5%.Freshgoatspermswereincubatedin/30andMD—Hmediasupplementedwith 20mg/mLBSAand10~g/mLHeparinforcapaeitation.CapaeitatedspermWasmeulturedwith matured00~ytesofinsemlnation.Thefertilizationratewas56.67%(17/30)and63.33%(19/ 30)raspectivdy.Itshowedthattherewerenosignificantdifferenoeshetweenthetwodealted methods.TheresultsindicatedthatbothBOandMD— Hmediasuiteelforgoatspen'rmtozoaca. paeitatlon.Therate~ofcleavagewere16.67%(6/36). KeywordsGoat;Largeantralfollide;Oowte;Invitromaturation;Invitrofertilization