细胞内信号传递对脐血淋巴细胞凋亡的影响

细胞内信号传递对脐血淋巴细胞凋亡的影响 ?? 论著细胞内信号传递对脐血淋巴细胞凋亡的影响 刘恩梅 李成荣 杨锡强 王莉佳 吴仕孝 【摘要】 目的 探讨新生儿 T 淋巴细胞内信号传递与脐血淋巴细胞凋亡的关系 。方法 以健康 () ( ) 成人 14 例外周血单个核细胞 PBMC为对照 ,测定 19 例足月新生儿脐血淋巴细胞胞内钙离子浓度 , () ( ) ( ) 蛋白激酶 A PKA活性和蛋白激酶 C PKC激动剂 PMA 对脐血淋巴细胞凋亡的影响 。结果 1经抗( ) ( ) 2CD3 刺激前或刺激后脐血单个核细胞 CBMC和 PBMC 细胞内钙离子浓度差异无显著意义 ; 2PMA () 可纠正抗 CD3 诱导的 CBMC 凋亡 ; 3培养 2 小时 ,CBMC PKA 活性自发显著升高 ,而 PBMC PKA 活性 下降 。结论 细胞内信号传导不平衡可能是抗 CD3 诱导 CBMC 凋亡的主要原因 ,而 CBMC 自发凋亡 可能与 PKA 活性升高有关 。 脱噬作用 信号传递 白细胞 ,单核 【关键词】 胎血 The effect of intracellular signal transduction on a poptosis of cord blood mononuclear cells L IU Enmei , L I Chengrong , YANG Xiqiang , et al . Children s Hospital , Chongqing University of Medical Sciences , Chongqing 400014 【Abstract】 Objective In order to explore the effect of intracellular signal transduction on apoptosis of ( ) cord blood mononuclear cells. Methods Intracellular calcium concentration , protein kinase A PAKactivity , ( ) and the effect of PMA , which is the activator of protein kinase C PKCon apoptosis of cord blood mononuclear ( ) cells CBMCwere determined in CBMC with the control of normal adult peripheral blood mononuclear cells ( ) PBMC. Results There were no differences in calcium concentrations between CBMC and PBMC before or after stimulation of anti2CD3. PMA could completely correct the CBMC apoptosis induced by anti2CD3. Spontanous PKA ( ) activities in CBMC cultured for 2 hours in absence of mitogen increased from 1. 99 to 2. 37 P < 0. 01. While PKA activities in PBMC decreased. Conclusion The imbalance of intracellular signal transduction might be the main cause of apoptosis induced by anti2CD3 in CBMC. But spontanous apoptosis in CBMC might related to increased PKA activities. 【 Key words】 Tetal blood Leukocytes , mononuclear Apoptosis Signal transduction 细胞通过一系列酶促反应 ,将刺激信号传递至 TL 信号传导与凋亡的关系 。 新生儿 细胞核触发基因表达 ,合成相应的蛋白质调控细胞 对象和方法 活化 、增殖 、分化 。近年来作为细胞增殖 、分化的重 2 + ( ) 要信号分子钙离子 Ca ] 蛋白激酶 C PKC与凋亡 一 、对象 足月顺产新生儿 19 例 ,平均胎龄 40 周 ,出生体 () 的关系日趋引人注目 ,腺苷环化酶 AC活化后产生 重平 均 3 200g , 其 母 无 异 常 妊 娠 史 。健 康 成 人 14 ( ) 的环 磷 酸 腺 苷 cAMP及 其 依 赖 性 的 蛋 白 激 酶 A 例 ,平均年龄 23 岁 ,采血前 4 周无明显感染史 ,无血 ( ) PKA也参与多种细胞的凋亡 。文献报道新生儿 T 制品及免疫抑制剂或增强剂用药史 。 1 ( ) ( ) 淋巴细胞 TL经 TL 受体 TCR信号传递有障碍。 二 、细胞培养( ) 我们的研究已证实脐血单个核细胞 CBMC较成人 ) ( 常规分 离 肝 素 抗 凝 CBMC CBMC 组 与 PBMC 2 ( ) ( ) PBMC 组, 用含 10 %小牛血清 RPMI21640 培养基 外周血单个核细胞 PBMC易发生凋亡。本研究 6 2 + 将细胞调至 1 ×10Πml ,取 2 ml 加入 24 孔培养板中 , 拟通过检测活化前后细胞内 Ca浓度 、PKA 活性变 37 ?、5 %CO培养 24 小时 ,在以下 4 种条件下观察 化以及 PKC 激动剂 PMA 对 CBMC 凋亡的影响 ,探讨 2 () () ()凋亡细胞率 : 1空白对照组 ; 2抗 CD3 对照组 ; 3 ( ) 本课接受国家自然科学基金 项目编号 : 39670675与四川省 () PMA 刺激组 ; 4抗 CD3 加 PMA 刺激组 。卫生厅科研基金资助 ( 作者单位 :400014 重庆医科大学附属儿童医院 第二作者现在深 3 表 1 CBMC 和 PBMC 在抗2CD3 刺激前后 按 Mishell 等介绍的方法计数凋亡细胞 ,在荧2 + 细胞内 Ca 浓度变化 光显微镜下观察丫啶橙 、溴化乙啶染色的细胞 ,核固 2 + 的倍数 0 h ( )细胞内 Ca 浓度 nm 两组 缩为圆点 、新月形 、杆状者为凋亡细胞 ,计数 200 个 试验 比较CBMC PBMC 阶段CBMC PBMC 细胞并计算凋亡细胞率 。 t 值( )( ) n = 19 n = 14 四 、片段 DNA ?34 108 819 ?35 1100 1100 0 h 1158 4抗2CD3 刺激后 描 在实验的时间收集细胞 ,按 Sellins 等35 min 144 ?53 ?43 195 117 ?016 19 ?018 188 10述的方法提取片段 DNA ,经 1 %琼脂糖电泳分析 ,紫 3 10 min 182 ?82235 ?50211 ?017213 ?0170193 外灯下观察结果及照相 。 3 P 均 > 0105五 、细胞内钙离子测定 CBMC 或 PBMC 洗涤后重悬于 Hank′s 液中 ,2 ×( )表 2 CBMC 和 PBMC 在不同条件下的凋亡细胞百分率 % 6 μμ 10Πml 加 入 5 l Fura22ΠAm 至 终 浓 度 5 molΠL , 置24 h 组别 例数 0 h 抗2CD3 37 ?负载 45 分钟 ,洗涤后用 Hank′s 液将细胞浓度稀 空白 抗2CD3 + PMA 5 释为 2 ×10Πml , 在 Hitachi23010 荧光分光光度计测 CBMC 组 14 316 ?114 18 ?213 16 ?716 12 ?119 18276 定荧光强度 ,激发波长 340 nm ,发射波长 500 nm , 狭311 ?111518 ?119519 ?119610 ?1188 PBMC 组 t 值 0187 136 186 0123 137缝 10 nm , 测 定 样 本 荧 光 强 度 F 值 后 , 加 入 011 % 33> 0105 < 01001 < 01001 > 0105 P 值( ) TritonX2100 测 最 大 荧 光 强 度 Fmax, 再 加 入 3 mol 3 t′检验结果( ) EDTA 测最小荧光强度 Fmin。 F - Fmin 2 + ( )Ca = ×224 nmolΠL Fmax - F 2 + 抗2CD3 刺激 5 分钟 、10 分钟后 , 再测定 Ca ] 浓度 。 六 、PKA 活性测定 6 新鲜分离的新生儿 CBMC 或成人 PBMC 4 ×10Π ml ,培养 0 小时 、2 小时测定 PKA 活性 ,后者分为两 () ( ) 组 : 1空白对照组 ; 2抗 CD3 刺激组 。用 PKA 活 ( ) 性测定试剂盒 Gibico ,USA测定 PKA 活性 ,用 Lowry 法测定标本的蛋白质含量 ,按每毫克蛋白质计算 。 Πmg 活化 P KAΠmin pmol ( ) PKA 活性 %= ×100 %pmolΠmg 总 PKAΠmin 七 、统计学处理 ( ) 实验数据以均值 ?差 x? ?s 表示 ,两样本 作 1 : CBMC 经抗2CD3 + PMA 刺激 24 小时 2 : CBMC 经 PMA 刺激 24 小时 t 检验 。因所得的 PKA 活性值不是正态分布 ,首 先3 : CMBC 经抗2CD3 刺激 24 小时 将其作数据转换后 ,作 t 检验 。 4 : CBMC 培养 24 小时 5 : CBMC 培养 0 小时 结果 6 :入 DNA EcoRIΠHind ? 图 1 PMA 对 CBMC 凋亡的影响2 + 一 、细胞内 Ca浓度 自发和经抗2CD3 刺激 5 或 10 分钟 ,成人 PBMC 2 + ( ) P > 0105, 培养后 CBMC PKA 活性较培养前升 义 与 CBMC 细胞内 Ca浓度上升幅度差异均无显著 ( ) 高 ,且高于成人 PBMC P < 0105,经抗2CD3 刺激后 ( ) 意义 P > 0105 ,表 1。 CBMC PKA 活性下降 , 而成人 PBMC 的 PKC 活性则 二 、PMA 对 CBMC 凋亡的影响 () 升高 表 3。 PMA 不能纠正 CBMC 自发凋亡 ,可纠正抗 CD3 () 诱导的 CBMC 凋亡 表 2 ,图 1。 讨论 三 、PKA 活性 TCR与抗原或丝裂原结合后 ,通过一系列酪氨 培养前 CBMC 与 PBMC PKA 活性差异无显著意 表 3 CBMC 和 PBMC 在培养前后及抗2CD3 刺激前后 PKA 活性变化比较 () ( ) PKA 活性 log x ? ?s log x? %为培养前倍数 两组比较 培养时间 t 值 ( ) ( ) CBMC n = 13PBMC n = 10CBMC PBMC ()培养前 0 h 100 1100 11199 ?0125 2115 ?0124 1155 培养 2 h 3空白对照组 抗2137 ?0142 183 ?0140 124 ?0135 186 ?0121 1103103 3 1190 ?01272123 ?01301190 ?01272123 ?01302CD3 对照组 4115 3 P < 0101 ( ) 酸磷酸化活化磷脂酶 Cr PLCr, PLCr 催化 4 ,52磷脂 PKA , 文 献 报 道 cAMP 相 似 物 dbcAMP , 激 动 剂 及 ( ) 酰二磷酸肌醇分解为三磷酸肌醇 IP和甘油二醇forskin 诱导或促进人外周血 BL 和胸腺细胞凋 亡 。 3 2 + 2 + 有人报道在 PGE作用下 CBMC 较成人 PBMC 易发 () 2 使细胞内 Ca 储存池中 Ca 释放 ,DAG DAG。IP3 2 + 生凋亡 。本组表明 : 未经抗2CD3 刺激体外培养 则活化 PKC 。Ca释放后通过钙神经蛋白 ,活化转 的 CBMC PKA 活性明显高于成人 PBMC ,提示 CBMC ( ) 录因 子 活 化 T 细 胞 核 因 子 NF2AT, 产 生 IL22 , 而 自发凋亡可能与 PKA 活性升高有关 。CBMC PKA 活 PKC 则通过 NF2KB 或直接将信号传导至核内 ,协同 2 + 性自发升高的原因不清楚 ,推测与 CBMC 所处的特 Ca诱导细胞活化和增殖 。 定微环境有关 ,是否受抗原提呈细胞产生的内源性 近年来细胞内信号传递与凋亡的关系已成为细 PGE或其它激素的影响有待进一步研究 。 2 2 + 胞生物学研究的重点 ,其中 Ca、PKC 和 PKA 对凋 5 亡的 作 用 尤 其 引 人 注 目 。McConkey 等发 现 抗2 2 + 参 考 文 献 CD3 诱导的人或鼠胸腺细胞凋亡伴有 Ca升高 ,可 通过 PMA 激活 PKC 纠正其凋亡 , 推测抗2CD3 刺激 1 Bertotto A , Gerli R , Lanfrancone L , et al . Activation of cord T 2 + 后细胞内 Ca升高与 PKC 不足或转位异常引起的 lymphocytes , cellular and molecular analysis of the defective response 细胞内信号传导不平衡是胸腺细胞发生凋亡的原 induced by anti2CD3 monoclonal antibody. Cell Immunology , 1990 , 因 。本研究发现经抗2CD3 刺激后 ,可导致 CBMC 凋 127 : 2472259 . 2 + 2 刘恩梅 ,李成荣 ,杨锡强 ,等 1 脐血淋巴细胞凋亡及其影响因素 1亡 ,虽然伴有 CBMC 细胞内 Ca浓度上升 , 但其上 中华儿科杂志 ,1998 ,36 :33423361升幅度与成人 PBMC 无显著差异 ,加用 PKC 激动剂 Mishell BB , Shiqi SM , Henry C , et al . Preparation of mouse cell 3 PMA 可纠正抗2CD3 诱导的 CBMC 凋亡 ,提示 CBMC suspensions. In : selected methods in cellular immunology. New York : 2 + Free man , 1980 . 21222 . 经 TCR 通道活化后 , 其 CaΠPKC 信号传导的失衡 2 + 4 Sellins KS , Cohen JJ . Gene induction by gamma2irradiation leads to 所致的凋亡主要为 PKC 不足 , 而非细胞内 Ca升 DNA fragmentation in lymphocytes. J Immunol , 1987 , 139 : 319923206 . 高 。推测新生儿 CBMC PKC 不足与发育不成熟及特 McConkey DJ , Hartzell P , Aador2Perez J F , et al . Calcium2dependent 5 殊的 表 型 有 关 。大 于 90 %以 上 的 CBMC 是 CD 45 killing of immature thymocytes by stimulation via the CD3ΠT cell receptor complex. J Immunol , 1989 , 141 : 180121806 . RA + 细胞 ,其 DAG 基础水平低 ,需要较高的 PKC 活 Schwinzer R , Siefken R , Frankin RA , et al . Human CD45 RA + and 6 6 化 ,才能达到信号传递所需的阈值。 CD45 RO + T cells exhibit similar CD3ΠT cell receptor2mediated transmembrane signaling capacities but differ in respones to costimulatory ( ) 前列腺素 EPGE通过活化 AC 而产生 cAMP2 2 signals. Eur J Immunol , 1994 , 24 : 139121395 . ( )收稿 :1998202226 修回 :1998209210 ()本文编辑 :徐福兰